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Alexandra Küfen

Species- and Tissue-Specific Detection of Bovine CNS-Tissue in Meat Products Using RT-PCR

The bovine spongiform encephalopathy (BSE), the possible routes of infection of BSE, and the new variant of the Creuzfeld-Jakob-disease (vCJD) which is closely connected with the first, have gained special attention with regard to preventive protection of consumers. The possible entry of specific risk material, particularly the entry of CNS tissue in the human food chain, is considered as a main root of infection. The illegal use of mechanically recovered meat in retail meat products and CNS-tissue as an emulgator in cooked sausages can not be excluded. Therefore appropriate control procedures for food and feeding are necessary in order to prevent CNS-tissue infiltrating the food- and feeding-chain.

The method used in thesis in order to detect CNS-tissue in retail meat products is based on the detection of a168 bp sized fragment of mRNA of the glial acidic fibrillary protein (GFAP) by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Subsequent to the RT-PCR the classification of the species cattle by using a restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) had been carried out.

Investigations made with regard to the tissue specificity of the GFAP-mRNA in porcine and ovine tissues revealed that the specification of CNS-tissue of these species is not possible so far, using the168 bp sized amplification product of the GFAP-mRNA as marker. Therefore only the bovine GFAP-mRNA is considered to be a save marker for the presence of CNS-tissue. Consequently the bovine origin of the detected GFAP-mRNA has to be proved. By the development of the RT-PCR using the primer pair bGFAPw1 and bGFAPw2 the necessary sequence information from sheep, pork, horse, fallow deer, roe deer and red deer to differentiate the respective amplification products were obtained. Using the restriction enzymes Hae III and Msc I the bovine GFAP-mRNA can be clearly identified.

With beef sausage-products and liver sausages, which were spiked with bovine CNS-tissue in concentrations of 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % and 5 %, and which had a heating process up to 100°C temperature to undergo, the proof of GFAP-mRNA up to a concentration of 0,25 % was possible over a period of 35 days. Over a period of 28 days, the sensitivity of this method

is up to 97 % in retail meat products, which were produced by a heating temperature up to 100°C. The specificity of the GFAP-mRNA RT-PCR assay for bovine CNS-tissue is 100 % in the experiments conducted here. Examination of canned food endowed with bovine CNS which were heated to FS-values over 5 revealed that the proof of GFAP-mRNA with the described method was not safely possible.

Within the present thesis it can be stated that the used method is suitable to detect bovine CNS-tissue in meat products which were heated up to a temperature of 100°C.

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96/449/EG: Entscheidung der Kommission vom 18. Juli 1996 über die Zulassung alternativer verfahren zur Hitzebehandlung von tierischen Abfällen im Hinblick auf die Inaktivierung der Erreger der spongiformen Enzephalopathie.

ABI. EG Nr. L 184 vom 24.07. 1996, S. 43 – 46 EU (1997)

97/534/EG: Entscheidung der Kommission vom 30. Juli 1997 über das Verbot der Verwendung von Material angesichts der Möglichkeit der Übertragung transmissibler spongiformer Enzephalopathien.

ABI. EG Nr. L 126 vom 08.08. 1997, S. 95 EU (1998)

98/272/EG: Entscheidung der Kommission vom 23. April 1998 über epidemiologische Überwachung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien und zur Änderung der Entscheidung 94/47417EG.

ABI EG Nr. L 122, S. 59

EU (1999)

99/534/EG: Entscheidung über Maßnahmen zum Schutz gegen die transmissiblen spongiformen Enzephalopatien bei der Verarbeitung bestimmter tierischer Abfälle und zur Änderung der Entscheidung 97/735/EG der Kommission.

ABI EG Nr. L 204, S. 37 EU (2000)

2000/418/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Juli 2000 zur Regelung der Verwendung von bestimmten Tiermaterial angesichts des Risikos der Übertragung von TSE-Erregern und zur Änderung der Entscheidung 94/474/EG.

ABI EG Nr. L 157, S. 76 – 82 EU (2000a)

2000/374/EG: Entscheidung der Kommission vom 5. Juni 2000 zur Änderung der Entscheidung 98/272/EG über die epidemiologische Überwachung transmissibler spongiformer Enzephalopatien.

ABI EG Nr. L 135, S. 27 EU (2000b)

2000/766/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Dezember 2000 über

Schutzmaßnahmen in Bezug auf die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien und die Verfütterung von tierischen Protein

ABI. EG Nr. L 306, S. 32 EU (2000c)

2000/764/EG Entscheidung der Kommission vom 29. November 2000 über die

Untersuchung von Rindern auf bovine spongiforme Enzephalopathie und zur Änderung der Entscheidung 98/272/EG über epidemiologische Überwachung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien

ABI. EG Nr. L 305, S. 35 EU (2001)

2001/1326/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Juni 2001 mit

Übergangsmaßnahmen zu Erleichterung des Übergangs zur Verordnung EG Nr.

999/2001 des Europäischen Parlamentes und des Rates mit Vorschriften zur Verhütung, Bekämpfung und Tilgung bestimmter transmissibler spongiformer Enzephalopathien (TSE) sowie zur Änderung der Anhänge VII und XI dieser Verordnung.

ABI. EG Nr. L 177, S. 60

EU (2001a)

2001/25/EG Entscheidung der Kommission vom 27. Dezember 2000 zur Untersagung der Verwendung bestimmter tierischer Nebenerzeugnisse in Tierfutter.

ABI. EG Nr. L 6, S. 16 EU (2001b)

2001/999/EG Verordnung des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. Mai 2001 mit Vorschriften zur Verhütung, Kontrolle und Tilgung bestimmter transmissibler spongiformer Enzephalopathien.

ABI. EG Nr. L 147, S. 1 EU (2001c)

2001/233/EG Entscheidung der Kommission vom 14. März 2001 zur Änderung der Entscheidung 2000/418/EG im Hinblick auf Separatorenfleisch und Rinderwirbelsäulen.

ABI. EG Nr. L 84, S. 59 EU (2001d)

2001/1248/EG Entscheidung der Kommission vom 22.06.2001 zur Änderung der Anhänge III, X und XI der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates im Hinblick auf die epidemiologische Überwachung von transmissibler spongiformer Enzephalopathien und die entsprechenden Nachweistests.

ABI. EG Nr. L 173 EU (2001e)

2001/9/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Dezember 2000 über

Kontrollmaßnahmen zur Umsetzung der Entscheidung 2000/766/EG des Rates über Schutzmaßnahmen in Bezug auf die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien und die Verfütterung von tierischen Protein.

ABI. EG Nr. L 2, S. 32 EU (2001f)

2001/165/EG Entscheidung der Kommission vom 27. Februar 2001 zur Änderung, in Bezug auf hydrolysierte Proteine, der Entscheidung 2001/9/EG über

Kontrollmaßnahmen zur Umsetzung der Entscheidung 2000/766/EG des Rates über Schutzmaßnahmen in Bezug auf die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien und die Verfütterung von tierischen Protein.

ABI. EG Nr. L 58, S. 43

EU (2001g)

2001/101/EG Richtlinie der Kommission zur Änderung der Richtlinie 2000/13/EG des Europäischen Parlaments und des Rates zur Angleichung der Rechtsvorschriften der Mitgliedsstaaten über die Etikettierung und Aufmachung von Lebensmitteln sowie Werbung dafür.

ABI. EG Nr. L 310, S. 19 EU (2002)

2002/270/EG Verordnung der Kommission vom 14. Februar 2002 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates in Bezug auf spezifizierte Risikomaterialien und die epidemiologische Überwachung auf bestimmte transmissible spongiforme Enzephalopathien sowie zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 1326/2001 in Bezug auf Futtermittel und das Inverkehrbringen von Schafen und Ziegen sowie daraus gewonnenen Produkten.

ABI. EG Nr. L 45 EU (2002a)

2002/1494/EG Verordnung der Kommission vom 21. August 2002 zur Änderung der Anhänge III, VII und XI der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Überwachung der bovinen spongiformen Enzephalopathie, der Tilgung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie, der Entfernung von spezifizierten Risikomaterials sowie Regeln für die Einfuhr von lebenden Tieren und Erzeugnissen tierischen Ursprungs.

ABI. EG Nr. L 225, S. 3

ABI. EG Nr. L 225, S. 3