Transkriptions- Analysen von MalK1

Um nachweisen zu können, ob MalK1 konstitutiv transkribiert wird, sollten Northern-Blot Analysen durchgeführt werden. Hierdurch sollte außerdem gezeigt werden, ob MalK1 abhängig von unterschiedlichen Zucker-Kohlenstoffquellen unterschiedliche Transkriptionsmuster aufweist.

7.8.1. Wachstumsanalyse

Zunächst wurden Wachstumsanalysen auf Minimalmedium mit 1% (wt/vol) CAA und unterschiedlichen Zucker-Kohlenstoffquellen durchgeführt (Abbildung 61). Als Kontrolle wurde die ΔmalF1::bleo Mutante mitgeführt. Nach 1,5; 3,5; 5; 7; 12; 17; 25; und 55 Stunden wurden Zellproben für die Northern-Blots entnommen.

Abbildung 61: Wachstumskurve von Thermus thermophilus HB27 und der malK1::kan Mutante auf verschiedenen Medien.

Der Wildtyp Stamm HB27 wuchs auf Minimalmedium mit 1% (wt/vol) CAA und folgenden unterschiedlichen Zucker-Kohlenstoffquellen (0,4% (vol/vol)): Glc, Glukose; Mal, Maltose; M3, Maltotriose. Ein Zellansatz des Wildtyps HB27 und die malK1::kan Mutante wuchsen auf Minimalmedium mit 1% CAA als Kohlenstoffquelle. Nach 1,5; 3,5; 5; 7; 12; 17; 25;

und 55 Stunden wurden Zellproben für die Northern-Blots entnommen.

0,001 0,01 0,1 1 10

0 10 20 30 40 50 60

OD600

Stunden

MalK HB27 HB27/Glc HB27/Mal HB27/M3

Ergebnisse

126

Das Ergebnis der Wachstumsanalyse (Abbildung 61) zeigt, dass der Wildtyp Stamm HB27 auf Minimalmedium mit CAA dasselbe Wachstumsverhalten wie die ΔmalF1::bleo Mutante zeigt. Wird dem Minimalmedium zusätzlich eine Zucker-Kohlenstoffquelle zugefügt (Maltose, Glukose oder Maltotriose jeweils 0,4% (vol/vol)), so zeigt der Wildtyp HB27 auf diesen Kohlenstoffquellen ein besseres Wachstum als ausschließlich auf CAA. Dies wird auch deutlich wenn die jeweils erreichten Endwerte der A600 nm betrachtet werden. Auf CAA als Kohlenstoffquelle erreicht der Wildtyp eine OD600 von 2,0 wohingegen auf CAA mit zusätzlichem Zucker OD600 Werte von 4,0 und höher erreicht werden.

7.8.2. Herstellung von Digoxigenin-markierten RNA-Sonden

Es wurden Digoxigenin-markierte RNA-Sonden gegen folgende Gene hergestellt: malK1, glcE und malE1. Mittels PCR wurden DNA-Fragmente amplifiziert, die jeweils zu ca. 700 bp aus dem Zentrum der Gene malK1, glcE und malE1 identisch sind. Mit den reverse Primern wurde dabei die Promotor-Sequenz der T7-RNA-Polymerase an die PCR-Fragmente angehängt. Die mittels PCR amplifizierten Fragmente wurden anschließend als Template für eine in vitro-Transkription mit der T7-RNA-Polymerase und Digoxigenin-markierten UTPs eingesetzt. Abbildung 62 zeigt exemplarisch das Ergebnis der in vitro-Synthese der Sonde gegen malK1.

Abbildung 62: Analyse der Synthese der malK1 - Sonde.

Aufgetragen sind die Ansätze (je 1 μl der angegebenen Verdünnungen, UV steht für unverdünnt; 10^-1 für eine 1:10 Verdünnung, 10^-2 für eine 1:100 Verdünnung, 10^-3 für eine 1:100 Verdünnung und 10^-4 für eine 1:10000 Verdünnung) der in vitro Transkripktion mittels der T7 – RNA-Polymerase und dem PCR-Fragment von malK1. Test-Sonde wurde in dem verwendeten Kit mitgeliefert und diente zum Vergleich der Effizienz der Reaktion.

Die so gewonnenen Sonden sind bis zu einer 1:10000 Verdünnung detektierbar. Für die Northern-Blot Analyse beziehungsweise die Hybridisierung wurden die Sonden jeweils in einer 1:1000 Verdünnung eingesetzt.

Ergebnisse

127 7.8.3. Northern-Blot Analyse

Für die Northern-Blot Analyse wurde die RNA aus den Proben der Wachstumsanalyse (siehe Abbildung 61) isoliert. Diese wurde anschließend unter denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt. Die so der Größe nach aufgetrennten RNA-Proben wurden dann in Northern-Blot Analysen mit den Sonden gegen die Gene malK1, glcE und malE1 analysiert.

Abbildung 63: Ergebnis der Northern-Blot Analyse mit der malK1-Sonde.

Die Detektion der Northern-Blots wurde mit chemilumineszenz Substrat Immobilon Western AP durchgeführt. Die jeweiligen Wachstumsbedingungen bei denen die Zellen angezogen wurden sind über dem Blot angegeben: MalK^- steht für die malK1::kan Mutante die auf Minimalmedium mit 1% (wt/vol) CAA angezogen wurde. HB steht für den Wildtyp Stamm HB27 der entweder auf Minimalmedium mit 1% (wt/vol) CAA ohne Zucker (HB) angezogen wurde, oder mit folgenden Zucker-Kohlenstoffquellen (0,4% (vol/vol)): HB/Glc, mit Glukose; HB/Mal, mit Maltose; HB/M3, mit Maltotriose.

Unterhalb sind die Zeitpunkte der Probenentnahme in Stunden angegeben. Bei den Zeitpunkten 1,5; 3,5; 5; 7; 12; und 16,5 Stunden sind auf den Northern-Blots jeweils Banden der 23- und 16 SrRNA sichtbar. Auf den zwei letzten Blots (24,5 und 55,5 Stunden) sind diese Banden nicht zu sehen. Dies ist vermutlich darauf zurückzufürhen, dass in den beiden letzten Blots nur 0,7 µg RNA aufgetragen wurde und bei den vorhergehenden Blots immer 1 µg. Die Sonden wurden in einer 1:1000 Verdünnung eingesetzt.

Das Ergebnis der Northern-Blots mit der Sonde gegen malK1 zeigt, dass das Gen für malK1 konstitutiv transkribiert wird (Abbildung 63). Eine signifikante Induktion der Transkription unter einer

Ergebnisse

128

bestimmten Wachstumsbedingung (Kohlenstoffquelle) oder zu einem bestimmten Zeitpunkt (wachstumsphasenabhängig) ist nicht zu beobachten. Zu den Zeitpunkten 1,5; 3,5; 5; 7; 12; und 16,5 Stunden sind auf den Northern-Blots jeweils Banden der 23- und 16 SrRNA sichtbar.

Die Northern-Blots mit Hilfe der Sonden gegen glcE und malE1 sollten zeigen, dass die Transkription dieser Gene im Gegensatz zu der Transkription von malK1 induziert wird. Dass eine Induktion der Transkription der Gene glcE und malE1 erwartet wird beruht auf der zuvor gemachten Beobachtung, dass der Glukose- und Maltose-Transport durch Glukose beziehungsweise Maltose induzierbar ist.

Daraus folgt die Konsequenz, dass auch die Bindeproteine der Transportsysteme, Glc und MalE1 induziert werden sollten, wenn Glukose und/oder Maltose im Wachstumsmedium vorhanden sind.

Abbildung 64: Ergebnis der Northern-Blot Analyse mit der malE1- und der glcE-Sonde.

Die Detektion der Northern-Blots wurde mit chemilumineszenz Substrat Immobilon Western AP durchgeführt. Die jeweiligen Wachstumsbedingungen bei denen die Zellen angezogen wurden sind über dem Blot angegeben: MalK^- steht für die malK1::kan Mutante die auf Minimalmedium mit 1% (wt/vol) CAA angezogen wurde. HB steht für den Wildtyp Stamm HB27 der entweder auf Minimalmedium mit 1% (wt/vol) CAA ohne Zucker (HB) angezogen wurde, oder zusätzlich mit folgenden Zucker-Kohlenstoffquellen (0,4% (vol/vol)): HB/Glc, mit Glukose; HB/Mal, mit Maltose; HB/M3, mit Maltotriose. Die Sonden wurden in einer 1:1000 Verdünnung verwendet.

Bild (A): Northern-Blot Analyse mit der glcE-Sonde. Die aufgetragenen Proben wurden exemplarisch nur von einem Zeitpunkt (1,5 Stunden) aufgetragen.

Bild (B): Northern-Blot Analyse mit der malE1-Sonde. Die aufgetragenen Proben wurden exemplarisch nur von einem Zeitpunkt (3,5 Stunden) aufgetragen.

Nach der Entwicklung des Northern-Blots war zu sehen, dass eine leichte Induktion sowohl von glcE gewachsen auf Glukose als auch von malE1 gewachsen auf Maltose zu sehen ist (Abbildung 64).

Ergebnisse

129

Dieses Ergebnis deckt sich mit der Erwartung, dass die Transkription der Bindeproteine bei Wachstum auf dem jeweiligen Substrat induziert werden sollte.