Die Enzyme des Maltosesystems in E. coli

Für die effiziente Aufnahme und die sich anschließende Verwertung von Maltose und Maltodextrinen werden in E. coli 10 verschiedene Gene benötigt, die auf verschiedenen, über das ganze Chromosom verteilten, Genloci lokalisiert sind (Boos and Shuman 1998). LamB kodiert für das Maltoporin, und fungiert als spezifische Diffusionspore, über die zunächst die Aufnahme der Maltodextrine über die

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Außenmembran erfolgt. LamB ist außerdem der Rezeptor für den Bakteriophagen λ (Randall-Hazelbauer and Schwartz 1973). Der weitere Transport der Maltodextrine über die Cytoplasmamembran wird durch einen Bindeprotein-abhängigen ABC-Transporter bewerkstelligt.

MalEFGK2 ist eines der am besten untersuchten ABC-Transportsysteme von dem 2007 die Kristallstruktur gelöst wurde (Oldham et al. 2007).

Der MalEFGK2 Komplex besteht aus einem hochaffinen (KD = 1 µM), löslichen Maltose/Maltodextrin Bindeprotein, MalE (auch MBP genannt)(Spurlino et al. 1991), das im Periplasma für die Erkennung und Bindung des Substrats zuständig ist. Der Transportkanal durch die Cytoplasmamembran wird von zwei integralen Transmembranproteinen, MalF und MalG, gebildet (Covitz et al. 1994, Dassa and Muir 1993, Froshauer et al. 1988). Das MalK-Homodimer ist im Cytoplasma lokalisiert und fest mit den beiden Membrankomponenten MalF und MalG verbunden. Durch die von MalK katalysierte Hydrolyse von ATP wird Substrat aktiv gegen den Konzentrationsgradienten über die Membran transloziert (Schneider and Hunke 1998, Davidson and Chen 2004). Die Auswertung der 2007 gelösten Kristallstruktur des gesamten Komplexes ergab, dass durch die Bindung von MalE an die Transmembrandomänen MalF und MalG eine Konformationsänderung in den Nukleotidbindestellen von MalK ausgelöst wird, die die ATP-Hydrolyse stimuliert (Oldham et al. 2007, Davidson et al.1992). Eine detailierte Beschreibung des MalEFGK2 Komplexes ist in Teil II dieser Arbeit in Abschnitt 6.2 zu finden.

Der Abbau von Maltose und Maltodextrinen zu Glukose und Glukose-1-Phosphat, den Endprodukten des Maltodextrinstoffwechsels, wird in E. coli hauptsächlich durch drei Enzyme katalysiert: MalP, MalQ und MalZ.

Maltotetraose und längere Dextrine sind Substrat der cytoplasmatischen Maltodextrinphosphorylase MalP die als Produkte kürzere Dextrine und α-Glukose-1-Phosphat bildet (Schwartz and Hofnung 1967, Dippel et al. 2005). MalP spaltet vom nicht-reduzierenden Ende der Maltodextrine durch Phosphorylierung einen Glukoserest ab (Schwartz 1987, Watson et al. 1997). Letztendlich entstehen durch die von MalP katalysierte Reaktion Maltotriose, die kein Substrat mehr für MalP darstellt, und α-Glukose-1-Phosphat das durch Pgm in Glukose-6-Phosphat umgewandelt wird und anschließend in die Glykolyse einfließt (Lu and Kleckner 1994). MalP-Mutanten können noch auf Maltose wachsen, akkumulieren aber große Mengen an langen Maltodextrinen. Letzteres ist auf die Reaktion der Amylomaltase MalQ, einer monomeren, cytoplasmatischen Maltodextrin-Glukanotransferase, zurückzuführen (Monod and Torriani 1950, Wiesmeyer and Cohn 1960b, Pugsley and Dubreuil 1988).

MalQ bildet in einer Transferreaktion aus Maltodextrinen einschließlich Maltose als Produkt Glukose und längere Maltodextrine (Wiesmeyer and Cohn 1960a, Palmer et al. 1973, Dippel and Boos 2005).

Nachdem die glykosidische Bindung des Dextrins gespalten wird und der reduzierende Anteil entlassen wurde, bildet MalQ mit dem verbleibenden Dextrinylrest einen Übergangszustand. Dieser wird durch den Transfer des Dextrinylrestes auf das nicht-reduzierende Ende eines Dextrinakzeptors

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wieder aufgelöst. Bei dieser Transferreaktion bleibt die Anzahl der glykosidischen Bindungen konstant und nur wenn die entstehende Glukose durch andere Enzyme aus dem Gleichgewicht entfernt wird, findet ein weiterer Transfer der Glukoseeinheiten in Richtung langkettiger Dextrine statt. Diese Aufgabe übernimmt im Fall der Glukose das Enzym Glukokinase, Glk, welches die Umwandlung zu Glukose-6-Phosphat katalysiert. Mutanten in MalQ können nicht mehr auf Maltose wachsen, wohl aber auf Maltodextrinen mit einer Kettenlänge von mindestens 4 Glykosylresten, da diese Substrat von MalP sind.

In der Summe werden von MalP also längere Maltodextrine aus der Reaktion entzogen und gleichzeitig Glukose-1-Phosphat gebildet, während MalQ die aus dieser Reaktion entstehenden kürzeren Dextrine wieder zu längeren aufpolymerisiert und Glukose bildet.

Abbildung 3: Enzymaktivitäten von MalQ, MalZ und MalP (verändert nach Boos and Shuman 1998).

Die Aktivität der Amylomaltase, MalQ, ist links im Bild angedeutet, die der Maltodextrin-Glukosidase, MalZ, in der Mitte und die der Maltodextrin-Phosphorylase, MalP, rechts im Bild. Nach dem Transport der Maltose durch den Bindeprotein-abhängigen ABC-Transporter ins Cytoplasma werden Maltosyl-, Maltotriosyl-, Maltotetraosyl- (und so weiter) Reste von der Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose (und so weiter) auf die hineinkommende Maltose übertragen. Bei diesem von MalQ katalysierten Prozess wird Glukose freigesetzt. Maltotetraose und längere Dextrine sind Substrate der Maltodextrin-Phosphorylase, MalP, die Glukose-1-Phosphat und ein Maltodextrin bildet, das um einen Glykosylrest verkürzt ist. Die Maltodextrin-Glukosidase, MalZ, erkennt Maltotriose und längere Maltodextrine und spaltet Glukose vom reduzierenden Ende der Maltodextrine ab. Die Enzymaktivität der periplasmatischen Amylase, MalS, die längere Maltodextrine bevorzugt zu Maltohexaose im Periplasma abbaut, wird in diesem Schema nicht berücksichtigt.

Zwei weitere katabole Enzyme des Maltodextrinstoffwechsels sind die periplasmatische α-Amylase MalS (Freundlieb and Boos 1986, Schneider et al. 1992) und die cytoplasmatische Maltodextrin-Glukosidase MalZ (Tapio et al. 1991). Beide Enzyme sind wichtig, jedoch nicht essentiell für die Maltose- bzw. Maltodextrinverwertung (Reyes et al. 1986, Schneider et al. 1992).

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Die Hauptaktivität von MalZ ist der Abbau von längeren Maltodextrinen durch die Abspaltung von Glukose vom reduzierenden Ende der Ketten durch Hydrolyse der glykosidischen Bindung (Tapio et al. 1991). Kleinstes Substrat von MalZ ist Maltotriose, als Produkt dieser hydrolytischen Spaltung entstehen somit Maltose und Glukose (Abbildung 3). Durch die von MalZ katalysierte Reaktion werden also längere Dextrine und unter ihnen auch der Induktor von MalT, Maltotriose, abgebaut.

MalZ zeigt in vitro neben der Maltodextrin-Glukosidaseaktivität auch eine Cyclodextrinaseaktivität und kann γ-Cyclodextrin spalten (Peist et al. 1996). Welche Rolle diese Aktivität in vivo spielt blieb bisher unklar, da γ-Cyclodextrin kein Substrat für E. coli darstellt. Kürzlich machten Mitarbeiter der Gruppe um Park in Korea die interessante Beobachtung, dass die Amylomaltase, MalQ, auch Cyclodextrin-transferaseaktivität zu besitzen scheint (persönliche Mitteilung von Prof. Boos., Park et al. unpublished). Das bedeutet, dass MalQ aus linearen Maltodextrinen Cyclodextrine bilden kann.

MalZ kann dann die von MalQ gebildeten γ-Cyclodextrine wieder spalten.

MalS ist ein Ca²⁺-abhängiges monomeres Enzym, das zwei Disulfidbrücken ausbildet (Spiess et al.

1997). Durch hydrolytische Spaltung werden im Periplasma längere Dextrine von MalS gespalten und können dann als kürzere Dextrine über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Maltotriose ist das kleinste Substrat von MalS (Freundlieb and Boos 1986). Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von längeren Maltodextrinen mit mehr als sechs Glukoseeinheiten als bevorzugtes Hauptprodukt Maltohexaose frei (Freundlieb et al. 1988).

Abbildung 4: Modell des Glykogen-Abbaus und der Bildung von Maltotriose.

Die Glykosylreste sind als Kreise angegeben, horizontale Verbindungen stellen α-1,4-glykosidische Verknüpfungen dar, gebogene Pfeile repräsentieren α-1,6-glykosidische Verbindungen. Ausgefüllte Kreise sollen beim Nachvollziehen der Herkunft der linearen Dextrine helfen. Nur Maltotetraose, nicht aber Maltotriose ist Substrat von MalP. Glukose-1-Phosphat wird von der Phosphoglukomutase zu Glukose-6-Phosphat umgewandelt um dann in die Glykolyse zu gelangen. Die Glukokinase, Glk, katalysiert die Bildung von Glukose-6-Phosphat aus Glukose.

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