Die Aktivität von MalT wird durch direkte Protein-Protein-Interaktion beeinflusst

Abgesehen von der Steuerung der MalT-Aktivität durch die Bindung des Induktors Maltotriose und des Effektors ATP, unterliegt die Aktivität von MalT zusätzlich noch der Regulation die durch die Interaktion mit anderen Proteinen gesteuert wird. Bisher sind drei Proteine identifiziert worden, die direkt mit MalT interagieren: MalK, MalY und Aes.

MalK ist die ATPase-Untereinheit des Maltosetransporters in E. coli. Die ATPase-Untereinheit besteht aus einer N-terminalen Nukleotid-Binde-Domäne (NBD) zur ATP-Bindung und einer C-terminalen regulatorischen Domäne (RD). Die C-terminale Domäne von MalK ist in zwei regulatorische Prozesse verwickelt (Böhm et al. 2002). Erstens wird MalK durch Enzym IIA^Glc, einer Komponente des PTS (Phospho Transferase System) für Glukose, reguliert (Nelson and Postma 1984, Dean et al. 1990, Böhm et al. 2002). Abhängig von dem Vorhandensein von PTS-Zuckern kann Enzym IIA^Glc entweder in der phosphorylierten oder in der unphosphorylierten Form in der Zelle vorliegen. In der unphosphorylierten Form, wenn beispielsweise ein PTS-Zucker wie Glukose vorhanden ist, bindet Enzym IIA^Glc an MalK und verhindert dadurch die Aufnahme von Maltose über den ABC-Transporter.

Die Inhibierung wird wieder aufgehoben, wenn nur noch wenig oder keine Glukose mehr vorhanden ist, und Enzym IIA^Glc wieder phosphoryliert wird. Dieser regulatorische Prozess definiert die Hierarchie in der die Zucker verwertet werden und ist als „Inducer exclusion“ bekannt. Der zweite bekannte Regulationsmechanismus beruht auf der Inhibierung der Aktivität von MalT, dem Aktivator des Maltosesystems, durch MalK. Hierbei bindet MalK die monomere, inaktive Form von MalT, das wiederum nicht mehr für die Transkriptionsaktivierung zur Verfügung steht (Reyes and Shuman 1988, Panagiotidis et al. 1998, Boos and Böhm 2000, Böhm et al. 2002, Joly et al. 2004). Dieser zweite Regulationsmechanismus von MalK soll im Folgenden genauer beschrieben werden.

Ein Zusammenhang zwischen dem Transportvorgang und der Genregulation durch MalT wurde schon früh anhand von Mutanten in malK vermutet (Hofnung et al. 1974). Diese Mutanten in der malB Region führen zu einer konstitutiven Expression von malQ (malA Region) und allen anderen MalT-abhängigen mal Genen, obwohl die entsprechenden Stämme für den Maltosetransport negativ sind (Kühnau et al. 1991). Im Gegensatz zu der Konstitutivität dieser malK Mutanten wurde festgestellt, dass die Überexpression von malK zu einer völligen Repression der MalT-abhängigen Genexpression führt. Ist allerdings gleichzeitig ein malT^c Allel vorhanden oder wird zusätzlich malT überexprimiert, so hebt sich diese Repression wieder auf (Reyes and Shuman 1988). Die Eigenschaft von MalK als Repressor zu wirken ist scheinbar nicht nur an den Transport sondern auch an seine enzymatische Funktion gebunden. Hierfür sprechen zwei weitere Mutantenklassen: Mutationen in den Transmembrandomänenproteinen MalF (malF500 Allel) und MalG führen zu den sogenannten Bindeprotein-unabhängigen Mutanten, die Maltose/Maltodextrine auch in Abwesenheit von MalE

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(MBP) transportieren können. Diese Mutationen bewirken, dass MalK durch die veränderte Membrankomponente konstitutiv ATP hydrolisiert und eine erhöhte, partiell konstitutive, mal Genexpression stattfindet. Im Gegensatz dazu wird die ATPase-Aktivität von MalK im Wildtyp nur durch die Interaktion mit dem substratbeladenen Bindeprotein stimuliert. Diese Beobachtung spricht dafür, dass im aktiven Komplex während Substrattransport stattfindet, MalK nicht mehr als Repressor wirken kann. Mutanten die einen Aminosäureaustausch im ABC-Signature-Motiv tragen (malK941 Allel) können zwar noch ATP binden, es aber nicht mehr hydrolisieren. Diese Klasse von Mutanten wird als MalK Superrepressoren bezeichnet, da sie in der Lage sind, sogar in Mutanten die das malT^c Allel tragen und somit konstitutiv malT exprimieren, die MalT-abhängigen Gene zu reprimieren (Kühnau et al. 1991, Schmees and Schneider 1998a, Schmees and Schneider 1998b).

1998 konnten H. Shuman und seine Mitarbeiter biochemisch nachweisen, dass MalT und MalK in vitro miteinander interagieren (Panagiotidis et al. 1998). Der Mechanismus der der Repression durch MalK zugrunde liegt ist also eine direkte Interaktion des aktiven, transportierenden MalEFGK2

Komplexes mit MalT, wobei der Transkriptionsaktivator in seiner inaktiven Form stabilisiert und an MalK gebunden wird. Somit ist die klassische Rolle des Transportsystems in der Induktion nun nicht mehr nur die Bereitstellung des Induktors Maltotriose durch den Transport über die Membran, sondern ist vielmehr direkt durch seine Transportaktivität und die Sequestrierung des Regulatorproteins MalT an der Regulation der mal Genexpression beteiligt (Boos and Böhm 2000, Joly et al. 2004, Böhm and Boos 2004).

Abbildung 8: Der Maltose/Maltodextrin-Transportvorgang reguliert die Aktivität von MalT.

MalG/F bilden die Transmembrankomponenten des Transporters, MBP ist das periplasmatische Bindeprotein und MalK die ATPase-Untereinheit (Homodimer). MalTi steht für inaktives, monomeres MalT. MalTa steht für aktives, multimeres MalT.

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Wenn kein Transport stattfindet wird monomeres MalTi an die Membran sequestriert und somit inaktiviert. Unklar ist wieviele MalT-Moleküle an MalK binden können. Im Bild sind schematisch zwei dargestellt, was bisher nicht bewiesen werden konnte. Während des Transportvorgangs wird MalTi frei und kann mit Maltotriose und ATP in die transkriptionsaktive Form überführt werden.

Ein weiteres Effektorprotein, dessen Interaktion mit MalT nachgewiesen werden konnte, ist Aes. Das cytoplasmatische Protein wurde während der Suche nach anderen Proteinen die MalT inaktivieren können gefunden, die mit Hilfe einer Expressionsgenbank von E. coli durchgeführt wurde. Aes weist eine signifikante Sequenzähnlichkeit zu Lipasen auf, allerdings entpuppte sich das gereinigte Enzym unbekannter physiologischer Funktion als eine Acetylesterase, die keine Lipaseaktivität besitzt (Peist et al. 1997, Joly et al. 2002). Mutationen in aes zeigen keinen Phänotyp und dennoch verhält sich Aes in Bezug auf die Repression der mal Genexpression genauso wie MalK, was auf dieselbe Wirkungsweise des Proteins hindeutet. Eine Überexpression von Aes hat eine totale Repression der mal Gene zur Folge, die auf den Verlust der Aktivität von MalT zurückzuführen ist. Maltotriose kann dieser Repression entgegenwirken, ebenso wie die Einführung eines MalT^c Allels, wodurch die reprimierende Wirkung durch die konstitutive Expression der mal Gene stark vermindert wird. 2002 konnten Joly und Mitarbeiter zeigen, dass Aes mit MalT um die Bindung des Induktors Maltotriose konkurriert, indem es mit der N-terminalen Domäne von MalT (DT1) interagiert (Joly et al. 2002). In einer weiteren Studie wurden 2002 von Schlegel et al. 26 verschiedene MalT Mutanten isoliert, die sich alle im ersten Drittel von malT befinden und konstitutiv für die mal Genexpression sind, partiell unabhängig vom Induktor Maltotriose (Schlegel et al. 2002). Die Messungen der Transkriptionsaktivität erfolgten mittels einer malE-lacZ Fusion in einem ∆malK Stammhintergrund, wobei einige dieser Mutanten resistent gegen Aes waren, was darauf hindeutet, dass sich in dieser Region die Interaktionsstelle mit MalT befindet.

Das dritte und vorerst letzte Protein das nachweislich mit MalT interagiert ist die dimere Cysthathionase (β–CS–Lyase) MalY (Zdych et al. 1995, Clausen et al. 2000, Schlegel et al. 2002).

Das Maltosesystem zeigt das Phänomen der endogenen Induktion, das heißt, sogar in der Abwesenheit von extern im Medium vorhandenen Maltodextrinen ist die Basalexpression der mal Gene relativ hoch (Decker et al. 1993). Dieser Befund ist auf die endogene Produktion des Induktors Maltotriose zurückzuführen, der beim Abbau von Glykogen entsteht. Auf MalY stieß man indirekt während der Suche nach Enzymen, die zur internen Synthese des Induktors Maltotriose beitragen. Im Verlauf der Transposonmutagenese wurde das malI Gen isoliert (Ehrmann and Boos 1987). Resultat einer Insertionsmutante in malI ist eine dramatische Reduktion des „uninduzierten“ (oder vielmehr endogen induzierten) Levels der Basalexpression der mal Gene. Entgegen der Erwartung ein Enzym zu finden, welches den Induktor synthetisiert, kodiert malI für ein typisches Repressorprotein (Reidl et al. 1989).

Der Repression durch MalI unterliegen zwei Gene, die divergent zu malI auf einem Operon lokalisiert sind: malY und malX. In malI Nullmutanten ist folglich die Expression von malY und malX

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dereprimiert, was einen erhöhten Level an MalY-Protein in der Zelle zur Folge hat, der wiederum für die mal Genrepression verantwortlich ist (Reidl and Boos 1991). Die physiologische Bedeutung von MalX ist unklar, es ist ein Enzym II eines PTS das bei Überexpression Glukose und Maltose transportiert aber nicht phosphoryliert. Der Transport ist sehr ineffizient und daher wird angenommen, dass es sich nicht um die natürlichen Substrate handelt.

Das Dimer der Cysthathionase MalY besteht aus zwei identischen Untereinheiten von je 43,5 kDa, die beide ein Pyridoxal-5`-Phosphat als Kofaktor enthalten (Zdych et al. 1995). Das nicht homologe Gen metC kodiert für ein Enzym, MetC, das ebenfalls Pyridoxal-5`-Phosphat als Cofaktor trägt und dieselbe Reaktion wie MalY katalysiert. MetC ist an der Biosynthese von Methionin beteiligt (Review Artikel von Old et al. 1991). MetC Mutanten sind auxotroph für Methionin, können aber von malI Mutanten komplementiert werden, da diese MalY konstitutiv synthetisieren, welches die Funktion von MetC übernehmen kann. Dennoch bleibt die Funktion von MalY in der Zelle und die Frage, weshalb es an der Regulation des Maltosesystems beteiligt ist ungeklärt.

Durch biochemische Versuche konnte gezeigt werden, dass MalY reversibel mit MalT interagieren kann. Dieser Komplex kann durch Gelfiltrationsexperimente nachgewiesen werden und zeigt deutlich, dass nur die monomere Form von MalT an MalY bindet. Die gesamte Stöchiometrie des für die MalT Transkription inaktiven Komplexes ist sehr wahrscheinlich MalT-MalY2-MalT (Schlegel et al. 2002).

Der Induktor Maltotriose wirkt der Interaktion der beiden Proteine entgegen, aber die Bindung von Maltotriose an MalT wird reduziert, wenn MalY vorhanden ist (Schreiber et al. 2000). Durch in vitro Versuche in einem MalT-abhängigen Transkriptionsansatz mit gereinigten Komponenten konnte ebenfalls gezeigt werden, dass MalY mit der Transkriptionsaktivatorfunktion von MalT interferiert und dass Maltotriose dieser Inhibierung entgegenwirkt (Schreiber et al. 2000).

Die β-CS-Lyase-Aktivität von MalY ist nicht für die Repression der mal Genexpression notwendig, und so wurden Mutanten isoliert, die noch immer als Repressoren wirken ohne β-CS-Lyase-Aktivität zu besitzen, und Mutanten, die immer noch β-CS-Lyase-Aktivität besitzen, aber eine MalY-vermittelte Repression der mal Gene verhindern (Zdych et al. 1995). 2000 wurde von Clausen und seinen Mitarbeitern die Kristallstruktur von MalY gelöst (Clausen et al. 2000). Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Positionen der Aminosäurereste, die für die verminderte Repressoraktivität von MalY zuständig sind, zwar in der Primärsequenz an unterschiedlichen Positionen lokalisiert sind, in der Kristallstruktur aber ein gemeinsames Cluster an der Oberfläche bilden, das vermutlich die Interaktionsstelle mit MalT darstellt.

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30 Abbildung 9: Proteininhibitoren von MalT.

Die Aktivität von MalT wird durch verschiedene Proteininhibitoren beeinflusst. Diese konkurrieren mit dem Induktor Maltotriose um die Bindung an MalT. Bei Bindung der Inhibitorproteine (Aes und MalY) an MalT, wird der Transkriptionsregulator in seine inaktive, monomere Form überführt (MalTi). Ein Überschuss an Maltotriose oder MalT selbst wirkt dieser Inaktivierung entgegen und überführt MalT in die aktive Form, MalTa.