3. Ergebnisse
3.7. Glukokinase und ihre unterschiedlichen Funktionen
Um die unterschiedlichen Funktionen der Glukokinase herauszuarbeiten wurde mit verschiedenen Deletionen und Insertionen in glk und mit der Glukokinase aus Thermus thermophilus gearbeitet.
Im Verlauf dieser Arbeit wurde für die Stammkonstruktionen mit der glk::Tn10(cam)-Insertions-Mutante gearbeitet, die aufgrund ihres kompletten Verlustes der Glukokinase-Aktivität bisher immer als Nullmutation angesehen wurde (Meyer et al. 1997). Diese Mutation existiert auch auf einem Plasmid, pCSF34, bei dem sich das glk::Tn10(cam)-Allel unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors befindet. Ein weiteres analoges Plasmid, pCSF2, exprimiert das wildtypische glk ebenfalls unter der Kontrolle des natürlichen Promotors. Beide Plasmide sollten als Kontrolle für den Effekt der Plamide die glk überproduzieren dienen. Erstaunlicherweise stellten wir fest, dass pCSF34 in MAD106 fast denselben Effekt auf die mal Genexpression ausübt wie das entsprechende Wiltyp-Glk-Plasmid pCSF2 (Tabelle 5, MAD106/pCSF34 und MAD106/pCSF2).
Tabelle 5: Unterscheidung der vielfältigen Funktionen der Glukokinase (Lengsfeld et al. 2008).
Die Stämme wachsen auf Minimalmedium A (MMA) mit 1% (wt/vol) Casoamino acids (CAA). Die malK-lacZ Aktivität wird angegeben in mmol ONPGal das pro Minute und mg Protein hydrolysiert wird.
Allen Stämmen fehlt glgA und malZ wenn nicht anders angegeben
Zusätzlicher Genotyp MalK-LacZ Aktivität
MAD106 glk15::Tn10(Cam) 2.42
MAD106 glk15::Tn10(Cam) pglk+ 0.09
MAD106 glk15::Tn10(Cam) pCSF34 (glk15 ∆aa
306-321)
0.88
MAD106 glk15::Tn10(Cam) pCSF2glk+ 0.58
Ergebnisse
48
Das Glk-Protein das von pCSF34 exprimiert wird besitzt keine Glukokinase-Aktivität mehr und kann somit nicht mehr auf der Ebene wirksam werden, die die Aktivität von MalQ durch Entfernen der Glukose kontrolliert. Das mutante Glk-Protein ist, verglichen mit dem Wildtyp-Glk, C-terminal um 16 Aminosäuren verkürzt. Möglicherweise kann diese verkürzte Glk-Variante dennoch mit MalT oder mit PtsG interagieren, und dadurch die Aktivität von MalT beeinflussen beziehungsweise Mlc verdrängen, was zu einer Reduktion der malT Expression führen würde. Betrachtet man die Struktur der Glukokinase, so wird deutlich, dass die trunkierten 16 Aminosäuren eine Helix bilden, die nicht Teil der Interaktionsfläche von EIIB und PtsG sind (Abbildung 16, rote Helix).
Abbildung 16: Die Struktur von Glk (Lengsfeld et al. 2008).
Die Struktur vom Glk-Dimer (in Grau) (Lunin et al. 2004) wird gezeigt. Die C-terminale Helix die aus den 16 Aminosäuren gebildet wird, die in der glk15 (∆aa 305-321) Mutante fehlen, werden in rot gezeigt. Sie repräsentieren aller Wahrscheinlichkeit nach die Interaktionsstelle mit MalT. Die putative Interaktions-Domäne mit EIIB von PtsG ist in cyan angezeigt.
Um zu testen, ob tatsächlich ein trunkiertes Protein exprimiert wird, wurden verschiedene Zellextrakte präpariert und im Anschluss daran der Überstand nach Zentrifugation bei 100000 g auf das Vorhandensein von Glk und Glk-Derivaten auf einem Western-Blot überprüft. Tatsächlich wird von einem Stamm der pCSF34 enthält ein Protein synthetisiert, das in einem Glk-Deletionsstamm nicht vorhanden ist (Abbildung 17). Zumindest die Interaktion des trunkierten Proteins mit PtsG ist somit denkbar.
Abbildung 17: Die Menge und Größe der trunkierten Version von Glk (Lengsfeld et al. 2008).
Die Proteine wurden auf einem SDS-PAGE mit anschließendem Western-Blot mit anti-Glk Antikörper analysiert. Spur 1:
Wildtyp MG1655, Spur 2: JW2385 (∆glk), Spur 3: JW2385 mit plasmidkodiertem glk15 (∆aa 305-321), Spur 4: JW2385 mit plasmidkodiertem N-terminal His6-tagged wildtyp Glk unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors.
Ergebnisse
49
Um zwischen einem Effekt den die trunkierten Glk-Variante auf PtsG oder auf MalT ausübt unterscheiden zu können, wurde mit einem Stamm gearbeitet, dem sowohl glgA als auch mlc fehlt (Tabelle 6, CL19). Anhand von CL19 ist feststellbar, ob die Reduktion die pCSF34 auf die mal Genexpression ausübt auf die Interaktion mit MalT zurückzuführen ist, da Mlc nicht vorhanden ist und damit ein Effekt über PtsG auszuschließen ist. Falls in CL19 also eine Reduktion der mal Genexpression sichtbar sein sollte, kann dies nur auf die Interaktion mit MalT zurückzuführen sein.
Tabelle 6: Unterscheidung der vielfältigen Funktionen der Glukokinase (Lengsfeld et al. 2008).
Die Stämme wachsen auf Minimalmedium A (MMA) mit 1% (wt/vol) Casoamino acids (CAA). Die malK-lacZ Aktivität wird angegeben in mmol ONPGal das pro Minute und mg Protein hydrolysiert wird.
pCSF34 (glk15 ∆aa 306-321) verursacht keine signifikante Reduktion in der mal Genexpression in CL19 (Tabelle 6). Somit scheint die C-terminal um 16 Aminosäuren verkürzte Version von Glk noch in der Lage zu sein mit PtsG zu interagieren, nicht aber mit MalT. Die Helix die von diesen 16 trunkierten Aminosäuren gebildet wird ist wie schon erwähnt räumlich deutlich von der Interaktionsstelle mit PtsG getrennt und könnte aufgrund dieser Daten die Interaktionsstelle mit MalT repräsentieren (Abbildung 16).
Die Menge an chromosomal gebildeter glk15::Tn10(Cam) trunkierter Glukokinase hat wie auch die Menge an Wildtyp-Glk keinen signifikanten Effekt auf PtsG oder die Aktivität von MalT. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass eine komplette Deletion von glk (CL27) die mal Genexpression im Vergleich zu der glk15::Tn10(Cam) Mutation in einem glgA malP+ malQ+ Stammhintergrund nicht verändert. Erst Allen Stämmen fehlt glgA und
malZ wenn nicht anders angegeben
Zusätzlicher Genotyp MalK-LacZ Aktivität
CL19 (malZ+) glk15::Tn10(Cam) mlc Vektor 6.30
CL19 (malZ+) glk15::Tn10(Cam) mlc pglk+ 0.71
CL19 (malZ+) glk15::Tn10(Cam) mlc pCFS2 (glk+) 3.90 CL19 (malZ+) glk15::Tn10(Cam) mlc pCSF34 (glk15
∆aa 306-321)
4.75
Ergebnisse
50
in einem glgA+ malP+ malQ+ Hintergrund (Tabelle1, TB04 und MAD104) macht sich die Menge an chromosomal produzierter Glukokinase mit Glukokinase-Aktivität auf die mal Genexpression bemerkbar.
Als weitere Kontrolle für die Funktion der überexprimierten E. coli Glukokinase wurde TTC1688 aus Thermus thermophilus kloniert. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das als Glukokinase annotiert ist (Henne et al. 2004). Die Glukokinase aus T. thermophilus wurde in E. coli heterolog exprimiert und gereinigt (Diplomarbeit Iris Andernach). Das im Folgenden TthGlk genannte Protein besteht aus einer 303 Aminosäurereste langen Polypeptidkette, die nur 22% Sequenzidentität zu der Glukokinase aus E.coli aufweist. TthGlk kann ATP-abhängig Glukose und Mannose mit einer Km von 0,16 mM phosphorylieren. Mittels Gelfiltration lässt sich bei Raumtemperatur ein Gleichgewicht von Dimer und Tetramer feststellen. Obwohl das Temperaturoptimum der Glukokinase aus T. thermophilus bei 70°C liegt ist das Protein auch bei 37°C noch aktiv. Während der Reinigung von TthGlk aus E.coli Extrakten bildete das Protein einen sehr stabilen Komplex mit MalP aus E. coli der sich nur mit Hochsalz (1,5 M NaCl) voneinander trennen ließ. Eine derart stabile Interaktion von E. coli Glk mit MalP ließ sich nicht nachweisen.
Die mal Genexpression wird in Stamm MAD104 (glgA+ malP+ malQ+) 2,6-fach reduziert, wenn TthGlk von Plasmid überexprimiert wird (Tabelle 7, MAD104/ pTtglk+). Diese Reduktion fällt deutlich geringer aus als bei überproduzierter Glukokinase von E. coli (MAD104/ pglk+), wo die mal Genexpression mehr als 50-fach reduziert ist. Da TthGlk in der Lage ist Glukose zu phosphorylieren wird ein regulierender Einfluss auf die Aktivität von MalQ erwartet. Dann wäre MalQ hoch aktiv, da die Glukose von TthGlk aus dem Gleichgewicht entfernt wird, und der Level an Induktor Maltotriose würde von MalQ verringert werden. In Stämmen die glgA- sind und somit gar keine endogene Maltotriose produzieren (MAD106 und RD105) ist die Reduktion der mal Genexpression bei Überexpression von TthGlk nur weniger als 2-fach (Tabelle 7, MAD106/ pTtglk+ und RD105/
pTtglk+). Dies bedeutet, dass TthGlk nicht nur die Aktivität von MalQ beeinflusst, sondern möglicherweise auch mit PtsG oder MalT oder beiden interagieren kann. Um hier eine Unterscheidung treffen zu können wurde erneut mit Stämmen gearbeitet, denen zusätzlich zu glgA auch noch mlc fehlt (Tabelle 7, GW12 und CL19). In diesen Stämmen hatte die Überexpression von TthGlk keinen Effekt auf die mal Genexpression. Dieses Ergebnis zeigt, dass TthGlk mit PtsG interagieren kann und damit Mlc, den Repressor von malT, verdrängt, jedoch nicht mit MalT selbst interagieren kann um dessen Aktivität zu beeinflussen.
Ergebnisse
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Tabelle 7: Unterscheidung der vielfältigen Funktionen der Glukokinase (Lengsfeld et al. 2008).
Die Stämme wachsen auf Minimalmedium A (MMA) mit 1% (wt/vol) Casoamino acids (CAA). Die malK-lacZ Aktivität wird angegeben in mmol ONPGal das pro Minute und mg Protein hydrolysiert wird.
Allen Stämmen fehlt glgA und malZ wenn nicht anders angegeben
Zusätzlicher Genotyp MalK-LacZ Aktivität
MAD104 (glgA+) glk15::Tn10(Cam) Vektor 4.21
MAD104 (glgA+) glk15::Tn10(Cam) pglk+ 0.08
MAD104 (glgA+) glk15::Tn10(Cam) pTtglk+ 1.59
MAD106 glk15::Tn10(Cam) 2.42
MAD106 glk15::Tn10(Cam) pglk+ 0.09
MAD106 glk15::Tn10(Cam) pTtglk+ 1.20
RD105 glk15::Tn10(Cam) malP 1.95
RD105 glk15::Tn10(Cam) malP Vektor 2.02
RD105 glk15::Tn10(Cam) malP pglk+ 0.09
RD105 glk15::Tn10(Cam) malP pTtglk+ 1.05
GW12 glk15::Tn10(Cam) malP malQ mlc
Vektor
4.27
GW12 glk15::Tn10(Cam) malP malQ mlc pglk+ 3.94
GW12 glk15::Tn10(Cam) malP malQ mlc
pTtglk+
4.39
CL19 (malZ+) glk15::Tn10(Cam) mlc Vektor 6.30
CL19 (malZ+) glk15::Tn10(Cam) mlc pglk+ 0.71
CL19 (malZ+) glk15::Tn10(Cam) mlc pTtglk+ 6.37
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