4. Diskussion
7.1. Mlc aus Thermus thermophilus
7.1.1. Mlc aus E. coli hat ein homologes Protein in Thermus thermophilus
Von Fabienne Chevance durchgeführte BLAST-Analysen der Sequenz von Mlc (Hosono et al. 1995) aus Escherichia coli (im Folgenden MlcEco genannt) gegen das Genom des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus HB27 (Henne et al. 2004) zeigten, dass es ein homologes Protein zu MlcEco in T. thermophilus gibt (im Folgenden MlcTth genannt). Das Gen TTC0329 kodiert für ein Protein, das über die gesamte Proteinlänge eine Aminosäure-Sequenzähnlichkeit von 17% zu der Sequenz von MlcEco aufweist. Weitere computergestützte Analysen ergaben, dass MlcTth die zwei Konsensussequenzen aufweist, die Proteine kennzeichnet, welche der ROK-Familie (Repressors, Open reading frames and Kinases) von transkriptionellen Regulatoren angehören (Titgemeyer et al.
1994, Hansen et al. 2002). Weiterhin besitzt MlcTth vier Reste (ein Histidin und drei Cysteine) die in E. coli Teil der Zink-Bindestelle, und damit an der Repressorfunktion von MlcEco beteiligt sind (Schiefner et al. 2005). Zusätzlich dazu zeigt die Sequenz von TTC0329, dass das Protein von T.
thermophilus fünf hoch-konservierte Reste des Glukose-Bindemotivs der Glukokinasen besitzt. MlcEco
hat einen dieser Reste für die Glukose-Bindung bereits verloren (His194 statt Asn178, siehe Abbildung 32, weiße Buchstaben auf schwarzem Hintergrund).
Abbildung 32: Sequenz-Vergleich von MlcTth (Tt Mlc) und MlcEco (Ec Mlc) (Chevance et al. 2006).
Die beiden Konsensus-Sequenzen welche die ROK-Familie-Proteine (transkriptionelle Regulatoren) kennzeichnen sind grau unterlegt angegeben. Die Aminosäuren die laut Schiefner et al. (Schiefner et al. 2005) an der Zink-Bindung beteiligt sind werden durch dicke Buchstaben gekennzeichnet. Reste die in der Glukokinase von E. coli an der Glukose-Bindung beteiligt sind (Lunin et al. 2004) werden weiß auf schwarzem Untergrund angegeben, und das Helix-Turn-Helix Motiv zur Bindung der DNA ist durch einen Balken oberhalb der Sequenz gekennzeichnet.
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Mit 17% Aminosäure-Identität ist die Sequenz-Homologie zwischen den beiden Proteinen MlcTth und MlcEco eher gering. Die umgekehrte Analyse, der Sequenzvergleich von MlcTth mit dem E. coli Genom brachte erneut MlcEco hervor, aber auch NagC, ein nahe verwandtes Protein von MlcEco. NagC ist ein Repressorprotein und gehört ebenfalls zur Familie der ROK-Proteine. Es bindet in E. coli nicht an PtsG. MlcTth dagegen ist noch in der Lage an PtsG aus E. coli zu binden, wie im nächsten Abschnitt 7.1.2. gezeigt wird. Dieses Ergebnis legt somit eher eine nahe Verwandschaft von MlcTth zu MlcEco
nahe, als eine Verwandschaft zu anderen Mitgliedern der ROK-Protein-Familie die als Repressoren fungieren. Vergleiche von MlcTth mit anderen bakteriellen Proteinen ergaben, dass MlcTth eng verwandt mit der weit verstreuten Klasse der ROK-Protein-Familie-Mitgliedern ist, so zum Beispiel auch mit XylR, einem Regulator aus Bacillus subtilis. Das Genom von T. thermophilus enthält allerdings schon eine als xylR annotierte Sequenz, die sich von der des MlcTth unterscheidet. Daher kann vermutet werden, dass MlcTth evolutiv gesehen mit MlcEco verwandt ist (Chevance et al. 2006).
Ebenfalls interessant in Bezug auf diesen Aspekt ist, dass das Glukose-Bindemotiv scheinbar sehr verbreitet unter anderen Mlc-Homologen zu sein scheint, und dass Mlc (VC2007) aus Vibrio cholerae, ein mesophiles Bakterium mit PTS-Transportern, alle fünf konservierten Bindestellen des Glukose-Bindemotivs aus Glukokinasen enthält (Swiss-Prot accession no. Q9KQJ1).
7.1.2. MlcTth beeinflusst bei Überexpression in E. coli die Expression von ptsG
Die DNA-Sequenz von MlcTth (TTC0329) wurde in einen IPTG-induzierbaren E. coli Vektor kloniert.
Das so entstandene Plasmid, pFC4 (Chevance et al. 2006), wurde in E. coli Stämme transformiert die eine translationale ptsG-lacZ Fusion enthalten (Plumbridge 1998b). Überraschender Weise beeinflusste die Überexpression von MlcTth die Expression von ptsG, einem Haupt-Angriffszielgen von Mlc in E. coli.
Abbildung 33: Effekt von Plasmid-kodiertem MlcTth auf eine translationale ptsG-lacZ Fusion in E. coli (Chevance et al. 2006).
Die Zellen wachsen in MMA mit 1% (wt/vol) CAA als Kohlenstoffquelle. Alle Messungen werden mit Stamm JM-G2 durchgeführt, der PtsG+ aber Mlc- ist. Die Werte sind als spezifische Aktivität der ptsG-lacZ Fusion angegeben (µmol an
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ONPG das pro Minute und pro Milligramm Protein hydrolysiert wird). Balken: 1, ohne Plasmid; 2, ohne Plasmid aber mit Glukose im Wachstumsmedium; 3, mit Plasmid pSA1 (kodiert für MlcEco); 4, mit Plasmid pSA1 und Glukose im Wachstumsmedium; 5, mit Plasmid pSA1 und IPTG; 6, mit Plasmid pSA1 und IPTG und Glukose im Wachstumsmedium; 7, mit Plasmid pFC4 (kodiert für für MlcTth); 8, mit Plasmid pFC4 und Glukose im Wachstumsmedium; 9, mit Plasmid pFC4 und IPTG; 10, mit Plasmid pFC4 und IPTG und Glukose im Wachstumsmedium.
Wie in Abbildung 33 zu sehen, reduziert MlcTth die Aktivität von ptsG (Spur 9), allerdings fällt der Effekt deutlich geringer aus als bei MlcEco und ist nur zu beobachten, wenn MlcTth überproduziert wird.
Diese Versuche wurden mit Stamm JM-G2 durchgeführt, der eine translationale ptsG-lacZ Fusion enthält, ptsG+ ist, aber kein Mlc enthält (mlc-). Obwohl die Expression von ptsG im Fall von MlcEco
(nur wenn es nicht überexprimiert wird) durch Glukose angehoben wird (Spur 4), verstärkte Glukose die Repression von ptsG durch MlcTth (nur wenn dieses überexprimiert wird) (Spur 10). Die genaue Ursache für dieses Phänomen bleibt bisher unklar. Allerdings bindet MlcTth wie später in Abschnitt 7.1.3. gezeigt wird Glukose. Die in Abschnitt 7.1.4. gezeigte MlcTth -abhängige Repression im Fall des Glukose, Galaktose, Mannose ABC-Transporters von T. thermophilus wurde durch Bindung von Glukose an MlcTth aufgehoben (Abschnitt 7.1.4.). Möglicherweise bewirkt die Bindung von Glukose an MlcTth im Fall von ptsG den entgegengesetzten Effekt und führt daher zu einer verstärkten Repression. Des Weiteren gibt es Hinweise darauf, dass MlcTth möglicherweise eine Restaktivität der Bindung an PtsG besitzt. Die Bindung von Glukose durch MlcTth könnte daher auch eine veränderte Bindungseigenschaft an PtsG verursachen, die wiederum in der verstärkten Repression resultieren könnte.
MlcEco dagegen zeigt keine Glukosebindung mehr. Wenn Glukose im Wachstumsmedium vorhanden ist und daher auch Glukosetransport stattfindet, wird Mlc an vorwiegend in depohosphorylierter Form vorhandenes EIIBCGlc gebunden und steht daher nicht mehr für die Repression zur Verfügung (siehe Abschnitt 2.7. in Teil I dieser Arbeit). Daher werden die Mlc-regulierten Gene, darunter auch ptsG, dereprimiert und die ptsG Expression wird angehoben. Auch EIIA liegt hauptsächlich in dephosphorylierter Form vor wenn Glukosetransport stattfindet (siehe Abschnitt 2.5. in Teil I dieser Arbeit). Dadurch wird die Adenylatcyclase nicht aktiviert und der cAMP/CAP-Spiegel (cyclisches AMP/catabolite activator protein) ist niedrig. Von ptsG weiß man, dass es schwach von cyklischem AMP und CAP abhängig ist. Dennoch konnten wir im Gegensatz zu den Daten die früher schon publiziert wurden (Plumbridge 1998b) keine signifikante Repression der ptsG-lacZ Fusion durch Glukose in einer Mutante der Mlc fehlt nachweisen.
Als Kontrolle wurde der Effekt von MlcTth auf eine tsx-lacZ Fusion getestet, die in E. coli nicht von Mlc kontrolliert wird. Hierbei wurde kein Effekt beobachtet (Daten nicht gezeigt).
In Thermus thermophilus wurde bisher kein PtsG gefunden, weshalb MlcTth in T. thermophilus eine andere Rolle als MlcEco in E. coli spielen muss.
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7.1.3. Mlc – Eigenschaften eines thermophilen Regulatorproteins
Um aufzuklären, welche Rolle Mlc in T. thermophilus spielt wurde zunächst getestet, ob das Protein Glukokinaseaktivität besitzt und welche Zucker von Mlc gebunden werden. Da in der Sequenz von MlcTth (TTC0329) fünf Reste konserviert sind, welche in E. coli an der Glukosebindung in Glukokinasen beteiligt sind, und aufgrund der hohen strukturellen Ähnlichkeit von Mlc mit Kinasen (Schiefner et al. 2005) (Abbildung 34), ist es sehr wahrscheinlich, dass das entsprechende Protein (MlcTth ) tatsächlich eine Glukokinase ist. Diese Versuche wurden von Marc Erhardt durchgeführt.
Abbildung 34: Vergleich der Kristallstrukturen von MlcEco (links) und GlkEco (rechts).
Mlc (linkes Bild) besteht aus drei Domänen. In grün die N-terminale Domäne mit dem Helix-Turn-Helix Motiv, in gelb die zweite Domäne und in blau die C-terminale Domäne in der die Zink-Bindestelle und die putative Glukose-Bindestelle lokalisiert sind. Das Zink-Molekül ist als grauer Punkt angedeutet (Schiefner et al. 2005).
Glukokinase (rechtes Bild) zeigt eine hohe Strukturähnlichkeit zu Mlc. Einzig die N-terminale Domäne mit dem Helix-Turn-Helix Motiv fehlt in der Struktur der Glukokinase (Lunin et al. 2004).
MlcTth wurde als natives Protein und als N-terminal His6-getaggte Variante gereinigt. Für die Zuckerbindeversuche und die enzymatischen Versuche wurde mit der N-terminal His6-getaggten Variante gearbeitet. MlcTth bindet im Gegensatz zu MlcEco tatsächlich Glukose. Die höchste Binde-Aktivität zeigt das Protein bei einer Temperatur von 70°C, bei einer Temperatur von 37°C war die Binde-Aktivität um 30% verringert. Die Aktivität von Mlc wurde in Anwesenheit von MgSO4
gesteigert, im Gegensatz dazu verminderte sie sich in Gegenwart von ZnCl2. Daher wurde für alle weiteren Versuche ein Puffer mit MgSO4 ohne ZnCl2 verwendet. Der experimentell bestimmte KD -Wert für die Bindung von Glukose liegt bei 20 µM (Abbildung 35) (Chevance et al. 2006).
Überraschend ist, dass MlcTth Glukose mit einer deutlich höheren Affinität bindet als die Glukokinase aus E. coli, die eine Km für Glukose von 0,78 mM aufweist (Meyer et al. 1997).
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Abbildung 35: Bindung von Glukose und Mannose an MlcTth aus Thermus thermophilus (Chevance et al.
2006)
Bindung von Glukose und Mannose durch MlcTth.
Bild A: MlcTth einer Konzentration von 2,5 µM wurde bei 70°C mit radioaktiv markierter 14C-Glukose inkubiert und die Menge an gebundener Glukose anschließend durch Ammonium-Sulfat-Präzipitation nachgewiesen. Die so erhaltenen Werte ergeben eine Kurve nach Michaelis-Menten die einen KD-Wert von 20 µM und eine Sättigung der Bindung bei 2,1 µM zeigte. Die Sättigung entspricht einer 1:1 Stöchiometrie (Polypeptid:Substrat).
Bild B: MlcTth einer Konzentration von 5 µM wurde bei 70°C mit radioaktiv markierter 14C-Mannose inkubiert und die Menge an gebundener Mannose anschließend durch Ammonium-Sulfat-Präzipitation nachgewiesen. Die so erhaltenen Werte ergeben eine Kurve nach Michaelis-Menten die einen KD-Wert von 134 µM und eine Sättigung der Bindung bei 4,76 µM zeigte. Die Sättigung entspricht einer 1:1 Stöchiometrie (Polypeptid:Substrat).
Mannose, das 2-Epimer der Glukose wird ebenfalls von MlcTth gebunden. Der KD-Wert für die Bindung von Mannose liegt bei 134 µM (Abbildung 35, Chevance et al. 2006). Im Gegensatz dazu wurde keiner der folgenden Zucker von MlcTth gebunden: Maltose, Maltotriose, Sukrose, Fruktose, Laktose, Galaktose, Trehalose, α-Methyl-Glucopyranosid und Glukose-6-Phosphat.
Trotz der hohen Affinität von MlcTth für Glukose und der starken strukturellen Ähnlichkeit zur E. coli Glukokinase konnte für MlcTth keine Glukokinase-Aktivität nachgewiesen werden. Weder zweiwertige Ionen wie Mg2+ oder Zn2+ noch verschiedene Phosphoryl-Donoren (ATP, ADP, GTP und CTP) konnten die Phosphorylierung von Glukose initiieren (Daten der Dünnschicht nicht gezeigt).
7.1.4. Mlc wirkt als Repressor und reprimiert sein eigenes Gen
Eine genauere Untersuchung der genomischen Umgebung von mlc in T. thermophilus ergab, dass das Gen welches für MlcTth kodiert zu einem Operon gehört, das für mehrere Gene kodiert, unter anderem ein putatives Glukose-Bindeprotein und zwei putative Permeasen. In E. coli dagegen ist das Gen das für MlcEco monocistronisch kodiert.
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Abbildung 36: GGM-Operonstruktur (verändert nach Chevance et al. 2006).
Organisation des Mlc/Glukose-Transport-Operons in Thermus thermophilus HB27. Die TTC Nummern beziehen sich auf die Nummerierung in der Genomsequenz von T. thermophilus (Henne et al. 2004). Die Zeichnung ist in Bezug auf Abstände zwischen den Genen und die Größe der Gene nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Die Abkürzung nt steht für Nukleotide. Rot gestrichelt ist die amplifizierte DNA-Operator-Sequenz (263 Basenpaare) angegeben die für den EMSA eingesetzt wurde und die potentielle Mlc-Bindestelle darstellt.
Mit der Hilfe von EMSAs (Elektromobility Shift Assay) sollte im Folgenden nachgewiesen werden, ob MlcTth als transkriptioneller Regulator für das potentielle ABC-Transporter-Operon wirkt. Ist dies der Fall, so sollte unterschieden werden, ob MlcTth als Repressor wirkt, der durch Glukose inaktiviert wird, oder als Aktivator, der durch Glukose aktiviert wird.
Die Ergebnisse in Abbildung 37 zeigen eindeutig, dass MlcTth die upstream DNA-Region (Abbildung 36, rot gestrichelte DNA-Operator-Sequenz) des mlc Gens shiftet und Glukose diesem Shift entgegen wirkt.
Abbildung 37: EMSA zwischen MlcTth und der T. thermophilus mlc Promotor-Region (Chevance et al.
2006).
Bild (A): Spuren 1-10 repräsentieren Reaktionsansätze mit jeweils 8 ng markierter DNA die von der Promotor/Operator-Region vor dem mlc Gen (TTC0329) amplifiziert wurden (Abbildung 29, rot gestrichelter Bereich der die potentielle Mlc-Bindestelle darstellt). In Spur 1-10 wurden folgende Konzentrationen an Wild-Typ MlcTth eingesetzt: 0; 0,21; 0,28; 0,56;
0,67; 0,84; 1,11; 1,26; 1,67; und 3,32 µM.
Bild (B): Jede Reaktion wurde mit derselben Konzentration an markierter DNA durchgeführt (8 ng). + und ++ stehen für 1,11 und 1,67 µM Wild-Typ MlcTth. Glukose wurde jeweils in einer Konzentration von 200 µM hinzugegeben (+).
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Mlc wirkt somit vermutlich als transkriptioneller Repressor seines eingenen Gens und als Konsequenz dessen auch für die distal folgenden Gene des Operons. Da gereinigtes MlcTth auch Mannose bindet, wurde getestet, ob die Mannose ebenfalls in der Lage ist dem Shift entgegenzuwirken. Dies ist nicht der Fall. Es ist nicht klar, weshalb MlcTth Mannose binden sollte, wenn diese nicht an der Regulation bzw. der Inaktivierung des Proteins beteiligt ist. Eine mögliche Erklärung ist, dass Mannose mit der Glukose um die Bindung konkurriert, den Repressor Mlc aber nicht inaktivieren kann, und damit der Glukose-abhängigen Induktion entgegen wirkt.
Versuche zur Quartärstruktur von MlcTth (N-terminal mit His-tag) mit Hilfe von einer Größenfraktionierung in An- und Abwesenheit von Glukose ergaben, dass MlcTth in beiden Fällen als Tetramer vorliegt. Crosslinkversuche mit der N-terminalen His-tag-Variante von MlcTth zeigten dagegen, dass ohne Glukose im Ansatz der Hauptanteil des Proteins als Monomer vorliegt, bei Anwesenheit von Glukose im Ansatz verschob sich dieser Hauptanteil des Proteins hin zum Dimer (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse scheinen zunächst im Widerspruch zueinander zu stehen.
Allerdings könnte es möglich sein, dass die Interaktionsfläche zwischen Monomer und Dimer eine andere ist als die zwischen dem Dimer und dem Tetramer. Daher ist im Crosslinkversuch möglicherweise nur die Bildung eines Dimers, nicht aber die eines Tetramers möglich.
Im Gegensatz dazu zeigte wildtypisches MlcTth die Tendenz zu multimerisieren (Daten nicht gezeigt).