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2.7. Mlc- ein globaler Repressor mit untypischer Funktionsweise
1995 wurde in Escherichia coli ein Protein entdeckt, das die Verwertung von Glukose reprimiert und dadurch reguliert. Aufgrund des Phänotyps der Mutanten erhielt dieser Regulator den Namen Mlc („makes large clonies“) (Hosono et al. 1995, Plumbridge 2002).
Mlc ist ein globaler Repressor des Zucker-Metabolismus und kontrolliert unter anderem die Expression von malT. Die Repression beruht auf einem Mechanismus, der dem bei MalK beschriebenen sehr ähnlich ist (Abschnitt 2.6). Auch hier findet die Repression in Abhängigkeit vom Transport statt, im Fall von Mlc Glukosetransport über das PTS für Glukose (Decker et al. 1998, Schiefner et al. 2005, Lee et al. 2000). Dieser Mechanismus ist völlig unüblich für einen Repressor, da Mlc durch die Sequestrierung an die dephosphorylierte EIIBCGlc Domäne des PTS für Glukose und somit an die Membran gebunden wird, während Glukosetransport stattfindet, und nicht wie sonst üblich durch die Bindung eines niedermolekularen Effektors gesteuert wird (Lee et al. 2000, Nam et al. 2001, Nam et al. 2008, Plumbridge 2002, Seitz et al. 2003, Tanaka et al. 2000). In der Abwesenheit von Glukose liegt EIIBCGlc hauptsächlich in phosphorylierter Form vor (pEIIBCGlc). Mlc interagiert nicht mit dieser phosphorylierten Form und dissoziiert unter diesen Bedingungen von der Membran weg um an seine Zielpromotoren zu binden und so deren Transkription zu reprimieren (Tanaka et al. 1999). Wenn Glukose vorhanden ist werden die Phosphatgruppen auf die transportierte Glukose übertragen, woraufhin EIIBCGlc hauptsächlich in dephosphorylierter Form vorliegt die
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wiederum mit Mlc interagiert. Dadurch wird Mlc an die Membran (genauer an die dephosphorylierte EIIBCGlc Domäne) gebunden und reprimiert nicht mehr (Lee et al. 2000, Seitz et al. 2003).
Abbildung 10: Wirkungsweise von Mlc.
Während Glukosetransport stattfindet liegt die EIIBGlc Domäne des PTS für Glukose vorwiegend in dephosphorylierter Form vor. Dieser Zustand wird von Mlc erkannt und gebunden, wodurch der Repressor, Mlc, an die Membran sequestriert und inaktiviert wird. Ohne Transportvorgang liegt die EIIBGlc Domäne hauptsächlich phosphoryliert vor und wird nicht von Mlc gebunden. Mlc reprimiert dann seine Zielgene. HPr und EIIAGlc sind cytoplasmatische Enzyme, die an der Phosphorylierung der Membrankomponenten des Transportsystems beteiligt sind.
Wie schon kurz erwähnt, kontrolliert die PTS-vermittelte Aufnahme von Glukose den internen Level an cAMP/CAP-Komplexen. Somit unterliegen sowohl malT, als auch die Gene die für den ABC-Transporter kodieren (malEFGK2), der Katabolitenrepression (Richet and Søgaard-Andersen 1994, Chapon 1982 a, Chapon 1982 b).
In der Summe resultieren daraus zwei entgegengesetzte Reaktionen: einerseits übt Glukose Katabolitenrepression auf das Maltosesystem aus, indem es den cAMP-Spiegel senkt, und andererseits wirkt sie dem Effekt der Katabolitenrepression entgegen, indem Mlc, der Repressor von malT, an die Membran gebunden wird und so die Expression weniger hemmt. Eine Erklärung für diesen Sachverhalt gibt es nicht, allerdings ist anzunehmen, dass in Anbetracht der Vielzahl der von Mlc regulierten Systeme eine feine Regulierung dieses Repressors nötig ist. Neben malT und mlc werden ptsG (kodiert für EIIBCGlc), manXYZ (kodiert für mannosespezifisches EII) und ptsHI (kodiert für die
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generellen cytoplasmatischen Proteine des PTS) von Mlc reprimiert (Plumbridge 1998a, Plumbridge 1998b, Plumbridge 1999, Kimata et al. 1998, Kim et al. 1999).
2005 wurde in Konstanz die Struktur von Mlc gelöst (Schiefner et al. 2005). Aufgrund der Aminosäuresequenz wird Mlc zu den ROK-Familie-Proteinen („repressors, open reading frames, and kinases“) gezählt (Titgemeyer et al. 1994, Hansen et al. 2002). In der Familie dieser Transkriptionsregulatoren finden sich unter anderem Xylose-Repressoren, Zuckerkinasen und andere Transkriptionsregulatoren mit dem weit verbreiteten Konsensusmotiv CXCGXXGCXE (Konsensussequenz 2) wieder. Sie beinhalten zusätzlich noch eine weitere Konsensussequenz (Konsensussequenz 1) die aus 28 Aminosäureresten besteht und 9 Reste vor der Konsensussequenz 2 lokalisiert ist (Hansen et al. 2002). Die Kristallstruktur von Mlc repräsentiert die erste beschriebene Struktur eines ROK-Familienmitglieds. Jedes Monomer von Mlc besteht aus drei Domänen: einer N-terminalen DNA-Bindedomäne mit einem Helix-Turn-Helix Motiv (HTH) (Wintjens and Rooman 1996, Harrison and Aggarwal 1990), einer kleineren α/β Domäne und einer großen α/β Domäne. Die große α/β Domäne enthält die beiden Konsensusmotive die alle ROK-Familienmitglieder aufweisen.
Innerhalb dieser Domäne wird ein für die Funktionalität und Struktur wichtiges Zinkatom durch drei Cysteine und ein Histidin koordiniert. Mlc bildet in der asymmetrischen Einheit stabile Dimere, wobei die Dimerisierung ebenso über die große α/β Domäne erfolgt, zusätzlich dazu kommen auch die beiden HTH-Motive in engen Kontakt miteinander (Schiefner et al. 2005). Frühere Studien mit Gelfiltrationsanalysen deuteten in vitro allerdings auf einen tetrameren Komplex hin (Nam et al. 2001, Seitz et al. 2003). 2008 konnte die tetramere Struktur von Mlc im Komplex mit der EIIBGlc Domäne des Glukose-PTS erstmals kristallisiert und somit bestätigt werden (Nam et al. 2008). Die EIIBCGlc Domäne besteht aus der cytosolischen EIIB-Untereinheit, welche durch einen Linker mit der Membran-lokalisierten EIIC-Domäne verbunden ist. In der Kristallstruktur ist eine 1:1 Stöchiometrie zu sehen, somit bindet jedes Mlc Monomer ein EIIB-Molekül. Die drei Domänen von Mlc werden nun als D-Domäne (DNA-Binde-Domäne), E-Domäne (EIIB-Binde-Domäne) und O-Domäne (Oligomerisierungs-Domäne) bezeichnet (Nam et al. 2008). Anhand der Kristallstruktur können die für die Interaktion mit EIIB wichtigen Reste genau bestimmt werden. Das Bindungsinterface wird in eine obere und eine untere Kontaktregion aufgeteilt, die jeweils aus mehreren Aminosäureresten besteht. Die obere Kontaktregion ist in der hydrophob ausgekleideten E-Domäne von Mlc lokalisiert, wobei die Aminosäuren Ile-132, Phe-136, Ile-137, Leu-143, Leu-146, Thr-186 und Val-188 von Mlc mit den Aminosäureresten 448-453 (speziell mit den Seitenketten von Val-449 und Ala-451) von EIIB interagieren. Die untere Kontaktregion befindet sich an der Grenze zwischen der D- und der E-Domäne von Mlc und besteht im Gegensatz zu der hydrophoben oberen Kontaktregion überwiegend aus polaren Kontakten.
Der Vergleich von Mlc mit anderen strukturverwandten Proteinen ergab drei bakterielle Kinasen, welche dieselbe Struktur des ROK-Motives aus Mlc aufweisen (Schiefner et al. 2005). Eine putative
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Fruktokinase aus Bacillus subtilis (Bs-FrcK, PDB Nummer 1XC3), eine anorganische Polyphosphat/ATP-Glukomannokinase aus Arthrobacter sp. (As-GMK, PDB Nummer 1WOQ) (Mukai et al. 2004) und die Glukokinase aus Escherichia coli (Ec-GlcK, PDB Nummern 1Q18 und 1SZ2) (Lunin et al. 2004).