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Regulation von ABC-Transportern in Escherichia coli und Thermus thermophilus
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Christina Lengsfeld
Universität Konstanz
Mathematisch-naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie
Lehrstuhl für Mikrobiologie
Tag der mündlichen Prüfung: 17.02.2009
Prüfungsvorsitzender: Prof. Dr. W. Welte 1.Referent: Prof. Dr. W. Boos 2.Referentin: Prof. Dr. I. Adamska
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-76639
URL: http://kops.ub.uni-konstanz.de/volltexte/2009/7663/
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Danksagung
Besonders herzlich bedanken möchte ich mich bei meinem Betreuer Winfried Boos. Die herzliche Aufnahme an seinem Lehrstuhl und die grandiose Zeit im Labor zusammen mit seiner mitreißenden Begeisterung für alle Projekte - die auch nicht davor Halt machte, mich in die Geheimnisse des
„Transportelns“ einzuweihen und dabei tatkräftig zu unterstützen – haben die Zeit in Konstanz zu einem besonderen Erlebnis gemacht. Danke für die Möglichkeit diese Arbeit in seinem Labor anfertigen zu können. Für alle Fragen und Probleme hatte er jederzeit ein offenes Ohr und immer die passende Antwort oder Lösung parat. Danke auch für alle Diskussionen, Gespräche, interessanten Geschichten und die schöne Zeit in der ich so vieles lernen durfte und die Forschung aus verschiedenen Blickwinkeln kennengelernt habe.
Prof. Winfried Boos und Prof. Iwona Adamska danke ich dafür, dass sie sich als Gutachter für diese Arbeit zur Verfügung gestellt haben.
Allen Mitgliedern der AG Boos – auch den Ehemaligen – und der AG Deuerling vielen, vielen Dank.
Es war einfach schön eine von euch zu sein.
Ein besonderer Dank geht an Stefan Schönert für die klasse Freundschaft die auch einige Kilometer Distanz übersteht, und dafür, dass ich ihm nicht nur in der Anfangszeit in Konstanz Löcher in den Bauch fragen konnte und immer geduldige Antworten bekommen habe.
Die schöne Freundschaft mit Renate, Silke und Jan ließ die Zeit hier in Konstanz wie im Flug vorbeigehen. Zu sagen weshalb, würde bei weitem diesen Rahmen sprengen. Christoph, vielen Dank für die ausgleichenden Jogging-Ausflüge die mir beim Schreiben super geholfen haben. Pari herzlichen Dank nicht nur für die Schokolade, sondern auch für alles andere. Ein großes Danke an Gabi, die mir viel Arbeit abgenommen hat. Vielen Dank Uli, nicht nur für die Instandhaltung der Kaffeemaschine. Jutta danke ich für die Antikörper gegen MalK1 und den Stamm JN1.
Steffi, Michael und Simon ein herzliches Danke für die Freundschaft, das Korrektur lesen, das Computerprobleme lösen und vieles mehr.
Ein großes Danke auch an Iris, alle Praktikanten und HiWis für die motivierte Mitarbeit und die konstruktiven Fragen.
Claus ein großes Danke für`s Lachen, zuhören, motivieren, bekochen, ablenken und das „da-sein“.
Widmen möchte ich diese Arbeit meiner Mutter, die immer für mich da ist und an mich glaubt. Ohne sie wäre dies alles nicht möglich gewesen.
Inhaltsverzeichnis
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Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ... 7
Tabellenverzeichnis ... 10
Teil I ... 11
1. Zusammenfassung ... 12
2. Einleitung ... 14
2.1. Glykogen-abhängige endogene Induktion ... 14
2.2. Glykogen Metabolismus in Escherichia coli ... 15
2.3. Die Enzyme des Maltosesystems in E. coli ... 16
2.4. MalQ und seine komplexe Rolle im Maltodextrinstoffwechsel ... 20
2.5. Transkriptionelle Regulation des mal Regulons - MalT und sein Induktor Maltotriose ... 21
2.6. Die Aktivität von MalT wird durch direkte Protein-Protein-Interaktion beeinflusst ... 26
2.7. Mlc- ein globaler Repressor mit untypischer Funktionsweise ... 30
2.8. Glukokinase (Glk) und ihre Bedeutung im Stoffwechsel ... 33
2.9. Zielsetzung dieser Arbeit ... 35
3. Ergebnisse ... 36
3.1. Glukose kontrolliert die Aktivität von MalQ ... 36
3.2. Der Effekt von Glukose auf die endogene Induktion der mal Genexpression in Stämmen die Glykogen synthetisieren ... 38
3.3. Die Rolle der Glukokinase für die endogene Induktion in der Abwesenheit von Glykogen ………40
3.4. Glk kontrolliert in der Abwesenheit von Glykogen und Maltotriose die mal Genexpression über die Aktivität von MalT ... 40
3.5. MalT als Ziel der Inhibierung durch die Glukokinase ... 42
3.6. Glk kontrolliert in der Abwesenheit von Glykogen und Maltotriose die mal Genexpression über die Expression von MalT ... 44
3.7. Glukokinase und ihre unterschiedlichen Funktionen ... 47
4. Diskussion ... 52
4.1. Glukose reguliert die Aktivität von MalQ ... 52
4.2. Glk beeinflusst die Aktivität von MalT ... 54
4.3. Glk beeinflusst die Expression von malT durch die Bindung an PtsG und das Freiwerden von Mlc ... 56
4.4. Induktor-abhängige und -unabhängige endogene Induktion ... 58
Inhaltsverzeichnis
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Teil II ... 60
5. Zusammenfassung ... 61
6. Einleitung ... 63
6.1. Thermus thermophilus ... 63
6.2. ABC (ATP binding cassette) Transporter ... 64
6.2.1. Das Bindeprotein – MalE/MBP ... 66
6.2.2. Die Membrankomponenten – MalF und MalG ... 71
6.2.3. Die ATPase-Untereinheit - MalK ... 75
6.2.4. Modell des Substrattransports durch ein ABC-Transportsystem ... 78
6.2.5. Die regulatorische Domäne von MalK ... 79
6.3. Operonstruktur des Maltose/Trehalose ABC-Transporters in Thermus thermophilus HB27 ………81
6.4. Mlc von Thermus thermophilus HB27 und das potentielle Glukose ABC-Transportsystem ………83
6.5. Zielsetzung der Arbeit ... 85
7. Ergebnisse ... 86
7.1. Mlc aus Thermus thermophilus ... 86
7.1.1. Mlc aus E. coli hat ein homologes Protein in Thermus thermophilus ... 86
7.1.2. MlcTth beeinflusst bei Überexpression in E. coli die Expression von ptsG ... 87
7.1.3. Mlc – Eigenschaften eines thermophilen Regulatorproteins ... 89
7.1.4. Mlc wirkt als Repressor und reprimiert sein eigenes Gen ... 90
7.2. Identifikation des Operons distal des mlc Gens ... 92
7.2.1. Das Bindeprotein GlcE ... 92
7.2.2. Die Gene des Operons distal von mlc ... 95
7.2.3. Glukosetransport / das GGM-System ... 95
7.2.4. Das Maltose-Bindeprotein, MalE1, bindet auch Glukose ... 97
7.2.5. Inhibierung des 14C-Glukosetransports durch Mannose/Maltose ... 99
7.2.6. Transport-Kinetiken des Glukosetransports ... 102
7.3. Der Maltosetransport / das TMSP-System ... 103
7.3.1. Suche nach Regulatoren die das TMSP-System beeinflussen ... 107
7.4. MalK, die ATPase-Untereinheit ... 109
7.5. Suche nach potentiellen Fruktose-Bindeproteinen ... 110
7.6. Maltodextrintransport / das MDX-System ... 114
7.7. MalK ist limitierend für den Transport ... 117
7.7.1. MalK1 Lokalisationsversuche ... 118
Inhaltsverzeichnis
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7.7.2. MalK1-Transportversuche um die „geliehene“ ATPase-Untereinheit ... 121
7.7.3. Zeitabhängigkeit der 14C- Maltosetransportrate. ... 122
7.7.4. Zeitabhängigkeit der 14C- Maltosetransportrate in HB27 bei einer Mannose- Konzentration von 250 µM. ... 122
7.8. Transkriptions- Analysen von MalK1. ... 125
7.8.1. Wachstumsanalyse ... 125
7.8.2. Herstellung von Digoxigenin-markierten RNA-Sonden ... 126
7.8.3. Northern-Blot Analyse ... 127
7.9. Antikörper gegen GlcE und MalE1 ... 129
7.10. Kristallstruktur des Maltose-Bindeproteins MalE1 ... 130
8. Diskussion ... 132
8.1. Mlc und seine Funktion in Thermus thermophilus HB27 ... 132
8.2. MlcTth – ursprünglicher Vorläufer des „modernen“ MlcEco? ... 134
8.3. Glukosetransport in Thermus thermophilus HB27 ... 136
8.4. Das Glukose-Bindeprotein, GlcE, des GGM ABC-Transportsystems ... 137
8.5. Der Maltosetransport in Thermus thermophilus HB27 ... 137
8.6. Kristallstruktur des TMSP-Bindeproteins, MalE1 ... 139
8.7. Das Maltodextrin-System (MDX) ... 140
8.8. MalK1, die „geliehene“ ATPase-Untereinheit ... 141
8.9. Die Sequenz von MalK1 im Vergleich zu der E. coli Sequenz ... 143
9. Material und Methoden ... 145
9.1. Abkürzungen ... 145
9.2. Chemikalien, Enzyme, Antikörper, Proteine und Kits ... 146
9.3. Bakterienstämme, Plasmide, Phagen und Oligonukleotide ... 148
9.4. Medien- und Wachstumsbedingungen ... 153
9.4.1. Medien ... 153
9.4.2. Medienzusätze und Kohlenstoffquellen ... 155
9.4.3. Kulturbedingungen ... 156
9.4.4. Zelldichtemessung ... 157
9.5. Genetische- und molekularbiologische Methoden ... 157
9.5.1. Standardmethoden mit Nukleinsäuren... 157
9.5.2. Präparation von chromosomaler DNA ... 157
9.5.3. Konstruktion von Plasmiden ... 158
9.5.4. Stammkonstruktionen ... 158
9.5.5. EMSA, Elektromobility Shift Assay ... 159
Inhaltsverzeichnis
6
9.5.6. Herstellung von Digoxygenin markierten RNA Sonden ... 159
9.5.7. Präparation von RNA aus Bakterien ... 160
9.5.8. Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese... 161
9.6. Biochemische Methoden ... 162
9.6.1. Bestimmung der Proteinkonzentration ... 162
9.6.2. Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität ... 162
9.6.3. Dünnschichtchromatographie ... 162
9.6.4. Reinigung von Proteinen (Affinitätschromatographie) ... 163
9.6.5. Kristallisation ... 163
9.6.6. Bindetests und Membranpräparation ... 164
9.6.7. Präparation von Zellextrakten ... 164
9.6.8. Biotinylierte DNA an Streptavidin-Beads koppeln (Abschnitt 7.3.1.) ... 165
9.6.9. Vergleich der Menge an Glk in verschiedenen Stämmen (Abschnitt 3.7, Abbildung 16) ... ……….166
9.6.10. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 166
9.6.11. Western Blot ... 167
9.6.12. Northern Blot ... 168
9.6.13. Zucker-Bindetests ... 170
9.6.14. Transport Assays ... 170
10. Literatur ... 172
Abbildungsverzeichnis
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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Tandem Operonstruktur der Gene des Glykogenmetabolismus in E. coli. ... 14
Abbildung 2: Schema des Glykogen Abbaus in E. coli (Dauvillée et al. 2005, Dippel and Boos, 2005)... 16
Abbildung 3: Enzymaktivitäten von MalQ, MalZ und MalP (verändert nach Boos and Shuman 1998). ... 18
Abbildung 4: Model des Glykogen Abbaus und der Bildung von Maltotriose. ... 19
Abbildung 5: Amylomaltase, MalQ, und ihre Rolle im Maltose/Maltodextrinstoffwechsel. ... 20
Abbildung 6: Schematische Darstellung von Katabolitenrepression und Induktorausschluss ... 22
Abbildung 7: Genetische Organisation des Maltose-Regulons in E. coli. ... 25
Abbildung 8: Der Maltose/Maltodextrin Transportvorgang reguliert die Aktivität von MalT. ... 27
Abbildung 9: Proteininhibitoren von MalT. ... 30
Abbildung 10: Wirkungsweise von Mlc. ... 31
Abbildung 11: Vergleich der Kristallstrukturen von MlcEco (links) und GlkEco (rechts). ... 33
Abbildung 12: in vitro Enzymaktivität von MalQ mit [14C]-markierter Maltose als Substrat (Lengsfeld et al. 2008). ... 36
Abbildung 13: Einfluss der Glukokinase auf die in vitro Enzymaktivität von MalQ (Lengsfeld et al. 2008)... 37
Abbildung 14: Interaktion von Glk mit PtsG (Lengsfeld et al. 2008). ... 46
Abbildung 15: Die Überlagerung der Glk Struktur mit der Struktur der Interaktion von Mlc mit PtsG (Lengsfeld et al. 2008). ... 46
Abbildung 16: Die Struktur von Glk (Lengsfeld et al. 2008). ... 48
Abbildung 17: Die Menge und Größe der trunkierten Version von Glk (Lengsfeld et al. 2008). ... 48
Abbildung 18: Der Effekt von cytoplasmatischer Glukose auf die Aktivität von MalQ und auf die Glykogen-abhängige endogene Induktion. ... 53
Abbildung 19: Die Bindung von Glk an MalT inhibiert die Aktivität von MalT. ... 55
Abbildung 20: Die Expression von MalT wird durch die Bindung von Glk an PtsG und das Freiwerden von Mlc beeinflusst. ... 57
Abbildung 21: Die drei verschiedenen Bindeproteinklassen werden aufgrund der Anordnung und Topologie ihrer zentralen β-Strands unterschieden (Cuneo et al. 2006). ... 69
Abbildung 22: Modell der „bending und twisting“ Achsen in periplasmischen Bindeproteinen (Cuneo et al. 2006). ... 69
Abbildung 23: Gesamtstruktur des Glukosebindeproteins (TTC0328) aus Thermus thermophilus mit gebundener Galaktose (Cuneo et al. 2006). ... 70
Abbildungsverzeichnis
8
Abbildung 24: Architektur der Transmembrandomänen MalF und MalG des Maltose/Maltodextrin ABC-Transporters aus E. coli (Oldham et al. 2007). ... 72 Abbildung 25: Stereoansicht der Struktur der Transmembrandomänen MalF und MalG des
Maltose/Maltodextrin ABC-Transporters aus E. coli (Oldham et al. 2007). ... 72 Abbildung 26: Stereoansicht des Maltose-Transporters aus E. coli in einem katalytischen
Übergangszustand (Oldham et al. 2007). ... 73 Abbildung 27: Kristallstruktur der MalK-Untereinheiten des Maltose-Transporters aus E. coli mit gebundenem ATP (Oldham et al. 2007)... 76 Abbildung 28: Konformationsänderungen im MalK-Dimer während eines ATP-Hydrolyse Zyklus (Lu et al. 2005). ... 77 Abbildung 29: Modell eines ABC-Importers (Oldham et al. 2007). ... 78 Abbildung 30: Operonstruktur des Maltose/Trehalose ABC-Transporters aus Thermus thermophilus HB27 (Chevance et al. 2006). ... 82 Abbildung 31: Operon-Struktur des potentiellen Glukose ABC-Transportsystems in Thermus
thermophilus HB27. ... 84 Abbildung 32: Sequenz Vergleich von MlcTth (Tt Mlc) und MlcEco (Ec Mlc) (Chevance et al. 2006).86 Abbildung 33: Effekt von Plasmid-kodiertem MlcTth auf eine translationale ptsG-lacZ Fusion in E.
coli (Chevance et al. 2006). ... 87 Abbildung 34: Vergleich der Kristallstrukturen von MlcEco (links) und GlkEco (rechts). ... 89 Abbildung 35: Bindung von Glukose und Mannose an MlcTth aus Thermus thermophilus (Chevance et al. 2006) ... 90 Abbildung 36: GGM-Operonstruktur (verändert nach Chevance et al. 2006). ... 91 Abbildung 37: EMSA zwischen MlcTth und der T. thermophilus mlc Promotorregion (Chevance et al.
2006)... 91 Abbildung 38: SDS-PAGE der Reinigung des Glukose-Bindeproteins, GlcE, aus T. thermophilus. .. 93 Abbildung 39: Bindung von Glukose und Mannose durch das Glukose/Mannose-Bindeprotein GlcE aus T. thermophilus (Chevance et al. 2006). ... 93 Abbildung 40: Bindung von Galaktose durch das Glukose/Mannose-Bindeprotein GlcE aus T.
thermophilus. ... 94 Abbildung 41: Vergleich der 14C-Glukosetransportraten in HB27 und CL3 (mlc::kan). ... 95 Abbildung 42: SDS-PAGE der Reinigung des Maltose-Bindeproteins, MalE1, aus T. thermophilus. 97 Abbildung 43: Bindung von Maltose und Glukose durch das TMSP-Bindeprotein MalE1 (Chevance et al. 2006). ... 98 Abbildung 44: Inhibierung des 14C-Glukosetransports durch unmarkierte Mannose. ... 100 Abbildung 45: Transport-Kinetiken des 14C-Glukosetransports in Thermus thermophilus (Chevance et al. 2006). ... 102
Abbildungsverzeichnis
9
Abbildung 46: Organisation des TMSP-Operons (Chevance et al. 2006). ... 104
Abbildung 47: Vergleich der 14C-Maltosetransportraten in HB27 und CL3 (mlc::kan). ... 104
Abbildung 48: EMSA von MlcTth und der malE1 Promotor-Region (Chevance et al. 2006). ... 106
Abbildung 49: SDS-PAGE Analyse des Streptavidin-Matrix Versuchs. ... 107
Abbildung 50: Beispielspektrum der Thiomaltose-Bindung an TTC1288 (MalE2) aus Thermus thermophilus HB27. ... 112
Abbildung 51: Bindung von Maltotetraose und γ-Cyclodextrin durch das Maltodextrin-Bindeprotein MalE2 (TTC1288) aus T. thermophilus. ... 115
Abbildung 52: Organisation des MDX-Operons (Maltodextrin System) aus Thermus thermophilus HB27 (Silva et al. 2005)... 116
Abbildung 53: Die drei von MalK1 abhängigen ABC-Transportsysteme in Thermus thermophilus HB27. ... 117
Abbildung 54: Western-Blot Analyse der Pellet-Fraktion der Lokalisation von MalK1 aus Thermus thermophilus. ... 119
Abbildung 55: Western-Blot Analyse der löslichen-Fraktion (10 µg) der Lokalisation von MalK1 aus Thermus thermophilus. ... 119
Abbildung 56: Western-Blot Analyse der löslichen-Fraktion (20 µg) der Lokalisation von MalK1 aus Thermus thermophilus. ... 120
Abbildung 57: Schematische Darstellung der Transport-Situation. ... 121
Abbildung 58: Zeitabhängigkeit der 14C-Maltosetransportrate in Thermus thermophilus HB27. ... 122
Abbildung 59: Zeitabhängigkeit der 14C-Maltosetransportrate in Thermus thermophilus HB27 in der Gegenwart von 250 µM unmarkierter Mannose. ... 123
Abbildung 60: Bestimmung der Km des 14C-Maltosetransports in Thermus thermophilus HB27 in der Gegenwart von 250 µM unmarkierter Mannose. ... 124
Abbildung 61: Wachstumskurve von Thermus thermophilus HB27 und der malK1::kan Mutante auf verschiedenen Medien. ... 125
Abbildung 62: Analyse der Synthese der malK1 - Sonde. ... 126
Abbildung 63: Ergebnis der Northern-Blot Analyse mit der malK1-Sonde. ... 127
Abbildung 64: Ergebnis der Northern-Blot Analyse mit der malE1- und der glcE-Sonde. ... 128
Abbildung 65: Kristallstruktur des Maltose-Bindeproteins MalE1. ... 131
Abbildung 66: Wirkungsweise von Mlc in Escherichia coli. ... 132
Abbildung 67: GGM-Operonstruktur mit Orientierung der Kanamycin-Resistenzkassette in mlc (verändert nach Chevance et al. 2006). ... 136
Abbildung 68: Vergleich von MalK aus Thermus thermophilus mit MalK aus E. coli. ... 143
Abbildung 69: Michaelis - Menten Gleichung. ... 171
Tabellenverzeichnis
10
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Die Rolle von MalQ in der endogenen Glykogen/Maltotriose-abhängigen mal
Genexpression (Lengsfeld et al. 2008). ... 39
Tabelle 2: Die Rolle der Glukokinase für die Kontrolle der Aktivität von MalT (Lengsfeld et al. 2008)... 41
Tabelle 3: Die D65E Mutation in MalT ist resistent gegen die Inhibierung durch Glk (Lengsfeld et al. 2008)... 43
Tabelle 4: Die Rolle der Glukokinase für die Expression von malT (Lengsfeld et al. 2008). ... 44
Tabelle 5: Unterscheidung der vielfältigen Funktionen der Glukokinase (Lengsfeld et al. 2008)... 47
Tabelle 6: Unterscheidung der vielfältigen Funktionen der Glukokinase (Lengsfeld et al. 2008)... 49
Tabelle 7: Unterscheidung der vielfältigen Funktionen der Glukokinase (Lengsfeld et al. 2008)... 51
Tabelle 8: Stämme die in dieser Arbeit verwendet wurden (Chevance et al. 2006). ... 95
Tabelle 9: Transport von Glukose in Thermus thermophilus (Chevance et al. 2006). ... 96
Tabelle 10: Inhibierung des Glukose-Transports durch unmarkierte Mannose und Maltose (Chevance et al. 2006). ... 99
Tabelle 11: Inhibierung des Glukosetransports durch unmarkierte Mannose und Maltose (Chevance et al. 2006). ... 101
Tabelle 12: Transport von Maltose in Thermus thermophilus (Chevance et al. 2006). ... 105
Tabelle 13: Ergebnis der Suche nach möglichen Regulatorproteinen des TMSP-Systems in Thermus thermophilus HB27. ... 108
Tabelle 14: In dieser Arbeit verwendete Plasmide und die darauf kodierten Proteine aus Thermus thermophilus HB27. ... 111
Tabelle 15: Ergebnis der Zucker-Binde-Versuche am Spektrometer. ... 113
Tabelle 16: Transport von Glukose und Maltose in Thermus thermophilus (Chevance et al. 2006). 118 Tabelle 17: Km Bestimmung des Maltose-Transports in Thermus thermophilus HB27. ... 124
Tabelle 18: Abkürzungsverzeichnis ... 146
Tabelle 19: Chemikalienliste ... 147
Tabelle 20: Liste der verwendeten Enzyme, Antikörper und Proteine ... 148
Tabelle 21: Auflistung der verwendeten Bakterienstämme, Plasmide und Phagen ... 152
Tabelle 22: Verwendete Oligonukleotide ... 153
Tabelle 23: Verwendete Kits ... 153
Tabelle 24: Auflistung der Medienzusätze ... 155
Tabelle 25: Auflistung der Kohlenstoffquellen ... 156
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Teil I
Glukose- und Glukokinase-kontrollierte mal
Genexpression in Escherichia coli
Zusammenfassung
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1. Zusammenfassung
Die Regulation des Maltosesystems wird seit langem intensiv erforscht. MalT ist der zentrale transkriptionelle Aktivator aller mal Gene in Escherichia coli. Die MalT-Aktivität wird durch den Induktor Maltotriose kontrolliert. Durch Bindung des Induktors Maltotriose wird MalT von einer inaktiven in eine aktive Form überführt und stimuliert die Transkription des mal-Regulons. Abgesehen davon kann die Aktivität von MalT durch die Interaktion mit verschiedenen Proteinen inhibiert, und die MalT-Expression kontrolliert werden.
In dieser Arbeit wird ein neuer Aspekt der mal Genregulation aufgedeckt: Der Effekt, den cytoplasmatische Glukose und das Enzym Glukokinase (Glk) auf die Aktivität und die Expression von MalT ausüben.
Die interne Konzentration an Maltotriose, dem Induktor von MalT, wird einerseits dadurch gesteuert, dass durch den Abbau von Glykogen Maltotriose entsteht, die andererseits von MalQ, der Amylomaltase, wieder zu längeren Dextrinen aufpolymerisiert wird. MalQ ist essentiell für den Maltose-Stoffwechsel und bildet aus Maltodextrinen und Maltose längere Dextrine und Glukose.
Bisher nicht bekannt war die Tatsache, dass Glukose in Konzentrationen von 100 µM und mehr die Aktivität von MalQ inhibiert.
malQ Mutanten die in der Abwesenheit von Maltodextrinen wachsen werden endogen durch Maltotriose induziert, die durch den Abbau von Glykogen gebildet wird. Daher beruht die Beobachtung, dass glk Mutanten eine erhöhte mal Genexpression aufweisen darauf, dass Glukose nicht mehr effizient durch die Glukokinase entfernt werden kann und dadurch die Aktivität von MalQ inhibiert wird, was phänotypisch zu einem MalQ- Phänotyp führt. MalQ kann somit den durch den Abbau von Glykogen produzierten Induktor Maltotriose nicht zu höheren Maltodextrinen aufpolymerisieren, was die hohe Induktion der mal Gene erklärt.
Doch selbst in Mutanten denen Glykogen fehlt kontrolliert die Glukokinase noch die endogene Induktion. Die strukturelle Ähnlichkeit der Glukokinase zu Mlc, einem globalen Repressor des Zucker-Stoffwechsels und vor allem von malT, brachte die Vermutung auf, dass Glk mit Mlc um die Bindung an PtsG (das PTS für Glukose) konkurrieren könnte. Damit wäre mehr Mlc frei, was in der Konsequenz zu einer stärkeren Repression von malT führen würde. Mit Bindeversuchen an Membranvesikel die PtsG enthalten und die PtsG-Mlc Interaktionsstelle nach außen exponieren wurde eine Interaktion von Glk mit PtsG nachgewiesen.
Zusammenfassung
13
Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass selbst in Mutanten, denen außer Glykogen auch Mlc fehlt, eine Verringerung der mal Genexpression zu beobachten war, wenn Glk überproduziert wird. Diese Repression kann durch eine direkte Interaktion von Glk mit MalT interpretiert werden, was zu einer Inhibierung der MalT-Aktivität führt. Die Repression war abhängig von der Anwesenheit von MalP, der Maltodextrin-Phosphorylase, oder MalQ, der Amylomaltase, und führte zur Inaktivierung von MalT.
Die drei neuen Aspekte der Regulation des Maltosesystems, die innerhalb dieser Arbeit untersucht wurden, sind die Kontrolle der enzymatischen Aktivität von MalQ (und damit auch der glykogen- abhängigen endogenen Induktion) durch Glukose, die Interaktion der Glukokinase mit PtsG die dadurch indirekt über das Freiwerden von Mlc die Expression von MalT kontrolliert und die Interaktion der Glukokinase mit MalT, die zu einer reduzierten Aktivität von MalT als Transkriptionsaktivator führt.
Einleitung
14
2. Einleitung
2.1. Glykogen-abhängige endogene Induktion
Glykogen ist ein aus Glukoseeinheiten aufgebautes Polysaccharid das in Tier- und Bakterienzellen als primärer Kurzzeit-Energiespeicher fungiert. Es stellt das tierische und prokaryotische Äquivalent zum pflanzlichen Speicherstoff Stärke dar. Grundbaustein beider Polysaccharide sind α-1,4-glykosidisch und α-1,6-glykosidisch verknüpfte Glukoseoligomere.
Stärke kommt natürlicherweise in zwei unterschiedlichen Formen vor: unverzweigte Amylose die aus α-1,4-glykosidisch verbundenen Glukosemolekülen besteht und das verzweigte Amylopektin, bei dem eine α-1,6-glykosidische Bindung auf ca. 30 α-1,4-glykosidische Bindungen kommt. Glykogen weist ungefähr alle 10 Glukoseeinheiten eine Verzweigung auf und hat somit einen höheren Verzweigungsgrad als Amylopektin (Stryer 1994).
Escherichia coli nutzt Glykogen als nicht-osmoaktive Speicherform von Glukose. Die Bildung von Glykogen findet entweder als Reaktion auf Stresssituationen statt, wie beispielsweise hohe Osmolarität im Medium, Stickstoffmangel, oder zu Beginn der stationären Phase. Die Gene, welche für Enzyme des Glykogenmetabolismus kodieren sind in zwei Tandem-Operonen organisiert: glgCAP und glgBX bei 76,9 Minuten sowie glgS bei 68,76 Minuten (Romeo et al. 1988) (Abbildung 1).
Abbildung 1: Tandem-Operonstruktur der Gene des Glykogenmetabolismus in E. coli.
Obere Skizze: glgCAP und glgBX Operon bei 76,9 Minuten. Die einzelnen Gene werden durch schwarz umrandete Kästen dargestellt. Die CsrA-Bindestelle ist in orange als Strich dargestellt. Die cAMP/CAP-Bindestelle wird durch einen blauen Strich symbolisiert. Der schwarze Pfeil stellt den Transkriptionsstart dar. Die Skizze ist nicht maßstabsgetreu in Bezug auf die Länge der Gene.
Untere Skizze: glgS Operon bei 68,76 Minuten. Die einzelnen Gene werden durch schwarz umrandete Kästen dargestellt.
Die RpoS-Bindestelle ist in grün als Strich dargestellt. Der schwarze Pfeil stellt den Transkriptionsstart dar. Die Skizze ist nicht maßstabsgetreu in Bezug auf die Länge der Gene.
Einleitung
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Die Regulation des Glykogen-Metabolismus findet auf mehreren Ebenen statt. Die Expression von glgCAP wird durch cAMP/CAP (CAP steht für “Catabolite activator protein“) und ppGpp (Guanosin- 3',5'-bispyrophosphat) stimuliert (Preiss and Romeo 1994, Romeo and Preiss 1989). Daher resultiert die verstärkte Glykogensynthese beim Übergang von der logarithmischen in die stationäre Phase. glgS wird unter Stress abhängig von σS (RpoS) verstärkt exprimiert. GlgS stimuliert daraufhin die Synthese von Glykogen (Hengge-Aronis and Fischer 1992). Weitere Funktionen von GlgS sind nicht bekannt.
CsrA („carbon storage regulator“) reguliert GlgC auf posttranskriptioneller Ebene, indem er durch Bindung an die Shine-Dalgarno-Sequenz von glgC dessen Translation blockiert und gleichzeitig den Abbau des Transkripts beschleunigt. CsrA selbst wird auf posttranskriptioneller Ebene von der csrB- mRNA reguliert, welche an CsrA bindet und damit inaktiviert (Baker et al. 2002, Gudapaty et al.
2001). GlgA wird durch die Metaboliten AMP und Fruktose-1,6-Bisphosphat allosterisch reguliert.
Dabei wirkt Fruktose-1,6-Bisphosphat hemmend auf GlgA, während AMP zu einer verstärkten Enzymaktivität führt.
Durch den Abbau von Glykogen entstehen nach einigen Zwischenstufen letztendlich Maltodextrine (α-1,4-glykosidisch verknüpfte Glukosemoleküle mit unterschiedlicher Kettenlänge). Maltotriose, eines der entstehenden Endprodukte des Glykogen-Katabolismus, ist der Induktor von MalT, dem zentralen transkriptionellen Aktivator aller mal Gene in E. coli. Zellen, die in der Abwesenheit von Maltodextrinen im Medium angezogen werden, zeigen dennoch eine gewisse Induktion der MalT- abhängigen Gene, ein Phänomen, das als endogene Induktion bezeichnet wird (Decker et al. 1993).
2.2. Glykogen-Metabolismus in Escherichia coli
Die Synthese von Glykogen wird hauptsächlich durch drei Enzyme katalysiert: Die ADP-Glukose- Pyrophosphorylase GlgC (Baecker et al. 1983), die ADP-Glukose (aktivierte Glukose) synthetisiert, GlgA und GlgB. Die Glykogen-Synthase GlgA katalysiert die Bildung einer glykosidischen Bindung zwischen dem C1-Atom der aktivierten Glukose und dem nicht-reduzierenden C4-Ende der wachsenden Glykogenkette, die als „Primer“ fungiert (Kumar et al. 1986). Das Verzweigungsenzym GlgB fügt durch α-1,6-glykosidische Bindungen Seitenverzweigungen an den Glykogenhauptstrang an (Baecker et al. 1986)
Der Glykogenabbau erfolgt durch das Zusammenspiel zweier Enzyme. Zunächst spaltet die Glykogen- Phosphorylase GlgP vom nicht-reduzierenden Ende des Glykogenstrangs die α-1,4-glykosidischen Bindungen phosphorolytisch ab. Dabei wird ein Glykosylrest auf ein Phosphat-Molekül übertragen und somit entstehen letztendlich Maltotetraosyl- und Maltotriosylseitenketten die α-1,6-glykosidisch mit dem Glykogenhauptstrang verbunden sind und Glukose-1-Phosphat (Chen and Segel 1968, Yu et al. 1988). Das so entstehende Glykogen wird auch als „Phosphorylase limited glycogen“ bezeichnet,
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da es nun kein Substrat mehr für GlgP darstellt. Die Maltotetraosyl- und Maltotriosylseitenketten werden im Folgenden Substrat für das Debranching-Enzym GlgX, welches die α-1,6-glykosidische Bindung zum Hauptstrang spaltet, wodurch die linearen Maltodextrine Maltotetraose und Maltotriose entstehen. Glukose-1-Phosphat wird durch Pgm, die Phosphoglukomutase, zu Glukose-6-Phosphat isomerisiert, das anschließend in die Glykolyse fließt (Lu and Kleckner 1994, Dauvillée et al. 2005).
Abbildung 2: Schema des Glykogen-Abbaus in E. coli (Dauvillée et al. 2005, Dippel and Boos, 2005).
Die Abstände zwischen den Verzweigungspunkten im Glykogen sind nicht maßstabsgetreu. Die Glykosylreste sind als Kreise angegeben, horizontale Verbindungen stellen α-1,4-glykosidische Verknüpfungen dar, gebogene Pfeile repräsentieren α-1,6-glykosidische Verbindungen. Ausgefüllte Kreise sollen beim Nachvollziehen der Herkunft der linearen Dextrine helfen. Das Schema beinhaltet die Synthese des Glykogens durch GlgA, GlgB und GlgC, sowie die Bildung des
„Phosphorylase limited Glykogens“ durch GlgP und die Entstehung von Maltotetraose und Maltotriose durch das Debranching-Enzym GlgX.
2.3. Die Enzyme des Maltosesystems in E. coli
Für die effiziente Aufnahme und die sich anschließende Verwertung von Maltose und Maltodextrinen werden in E. coli 10 verschiedene Gene benötigt, die auf verschiedenen, über das ganze Chromosom verteilten, Genloci lokalisiert sind (Boos and Shuman 1998). LamB kodiert für das Maltoporin, und fungiert als spezifische Diffusionspore, über die zunächst die Aufnahme der Maltodextrine über die
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Außenmembran erfolgt. LamB ist außerdem der Rezeptor für den Bakteriophagen λ (Randall- Hazelbauer and Schwartz 1973). Der weitere Transport der Maltodextrine über die Cytoplasmamembran wird durch einen Bindeprotein-abhängigen ABC-Transporter bewerkstelligt.
MalEFGK2 ist eines der am besten untersuchten ABC-Transportsysteme von dem 2007 die Kristallstruktur gelöst wurde (Oldham et al. 2007).
Der MalEFGK2 Komplex besteht aus einem hochaffinen (KD = 1 µM), löslichen Maltose/Maltodextrin Bindeprotein, MalE (auch MBP genannt)(Spurlino et al. 1991), das im Periplasma für die Erkennung und Bindung des Substrats zuständig ist. Der Transportkanal durch die Cytoplasmamembran wird von zwei integralen Transmembranproteinen, MalF und MalG, gebildet (Covitz et al. 1994, Dassa and Muir 1993, Froshauer et al. 1988). Das MalK-Homodimer ist im Cytoplasma lokalisiert und fest mit den beiden Membrankomponenten MalF und MalG verbunden. Durch die von MalK katalysierte Hydrolyse von ATP wird Substrat aktiv gegen den Konzentrationsgradienten über die Membran transloziert (Schneider and Hunke 1998, Davidson and Chen 2004). Die Auswertung der 2007 gelösten Kristallstruktur des gesamten Komplexes ergab, dass durch die Bindung von MalE an die Transmembrandomänen MalF und MalG eine Konformationsänderung in den Nukleotidbindestellen von MalK ausgelöst wird, die die ATP-Hydrolyse stimuliert (Oldham et al. 2007, Davidson et al.1992). Eine detailierte Beschreibung des MalEFGK2 Komplexes ist in Teil II dieser Arbeit in Abschnitt 6.2 zu finden.
Der Abbau von Maltose und Maltodextrinen zu Glukose und Glukose-1-Phosphat, den Endprodukten des Maltodextrinstoffwechsels, wird in E. coli hauptsächlich durch drei Enzyme katalysiert: MalP, MalQ und MalZ.
Maltotetraose und längere Dextrine sind Substrat der cytoplasmatischen Maltodextrinphosphorylase MalP die als Produkte kürzere Dextrine und α-Glukose-1-Phosphat bildet (Schwartz and Hofnung 1967, Dippel et al. 2005). MalP spaltet vom nicht-reduzierenden Ende der Maltodextrine durch Phosphorylierung einen Glukoserest ab (Schwartz 1987, Watson et al. 1997). Letztendlich entstehen durch die von MalP katalysierte Reaktion Maltotriose, die kein Substrat mehr für MalP darstellt, und α-Glukose-1-Phosphat das durch Pgm in Glukose-6-Phosphat umgewandelt wird und anschließend in die Glykolyse einfließt (Lu and Kleckner 1994). MalP-Mutanten können noch auf Maltose wachsen, akkumulieren aber große Mengen an langen Maltodextrinen. Letzteres ist auf die Reaktion der Amylomaltase MalQ, einer monomeren, cytoplasmatischen Maltodextrin-Glukanotransferase, zurückzuführen (Monod and Torriani 1950, Wiesmeyer and Cohn 1960b, Pugsley and Dubreuil 1988).
MalQ bildet in einer Transferreaktion aus Maltodextrinen einschließlich Maltose als Produkt Glukose und längere Maltodextrine (Wiesmeyer and Cohn 1960a, Palmer et al. 1973, Dippel and Boos 2005).
Nachdem die glykosidische Bindung des Dextrins gespalten wird und der reduzierende Anteil entlassen wurde, bildet MalQ mit dem verbleibenden Dextrinylrest einen Übergangszustand. Dieser wird durch den Transfer des Dextrinylrestes auf das nicht-reduzierende Ende eines Dextrinakzeptors
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wieder aufgelöst. Bei dieser Transferreaktion bleibt die Anzahl der glykosidischen Bindungen konstant und nur wenn die entstehende Glukose durch andere Enzyme aus dem Gleichgewicht entfernt wird, findet ein weiterer Transfer der Glukoseeinheiten in Richtung langkettiger Dextrine statt. Diese Aufgabe übernimmt im Fall der Glukose das Enzym Glukokinase, Glk, welches die Umwandlung zu Glukose-6-Phosphat katalysiert. Mutanten in MalQ können nicht mehr auf Maltose wachsen, wohl aber auf Maltodextrinen mit einer Kettenlänge von mindestens 4 Glykosylresten, da diese Substrat von MalP sind.
In der Summe werden von MalP also längere Maltodextrine aus der Reaktion entzogen und gleichzeitig Glukose-1-Phosphat gebildet, während MalQ die aus dieser Reaktion entstehenden kürzeren Dextrine wieder zu längeren aufpolymerisiert und Glukose bildet.
Abbildung 3: Enzymaktivitäten von MalQ, MalZ und MalP (verändert nach Boos and Shuman 1998).
Die Aktivität der Amylomaltase, MalQ, ist links im Bild angedeutet, die der Maltodextrin-Glukosidase, MalZ, in der Mitte und die der Maltodextrin-Phosphorylase, MalP, rechts im Bild. Nach dem Transport der Maltose durch den Bindeprotein- abhängigen ABC-Transporter ins Cytoplasma werden Maltosyl-, Maltotriosyl-, Maltotetraosyl- (und so weiter) Reste von der Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose (und so weiter) auf die hineinkommende Maltose übertragen. Bei diesem von MalQ katalysierten Prozess wird Glukose freigesetzt. Maltotetraose und längere Dextrine sind Substrate der Maltodextrin- Phosphorylase, MalP, die Glukose-1-Phosphat und ein Maltodextrin bildet, das um einen Glykosylrest verkürzt ist. Die Maltodextrin-Glukosidase, MalZ, erkennt Maltotriose und längere Maltodextrine und spaltet Glukose vom reduzierenden Ende der Maltodextrine ab. Die Enzymaktivität der periplasmatischen Amylase, MalS, die längere Maltodextrine bevorzugt zu Maltohexaose im Periplasma abbaut, wird in diesem Schema nicht berücksichtigt.
Zwei weitere katabole Enzyme des Maltodextrinstoffwechsels sind die periplasmatische α-Amylase MalS (Freundlieb and Boos 1986, Schneider et al. 1992) und die cytoplasmatische Maltodextrin- Glukosidase MalZ (Tapio et al. 1991). Beide Enzyme sind wichtig, jedoch nicht essentiell für die Maltose- bzw. Maltodextrinverwertung (Reyes et al. 1986, Schneider et al. 1992).
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Die Hauptaktivität von MalZ ist der Abbau von längeren Maltodextrinen durch die Abspaltung von Glukose vom reduzierenden Ende der Ketten durch Hydrolyse der glykosidischen Bindung (Tapio et al. 1991). Kleinstes Substrat von MalZ ist Maltotriose, als Produkt dieser hydrolytischen Spaltung entstehen somit Maltose und Glukose (Abbildung 3). Durch die von MalZ katalysierte Reaktion werden also längere Dextrine und unter ihnen auch der Induktor von MalT, Maltotriose, abgebaut.
MalZ zeigt in vitro neben der Maltodextrin-Glukosidaseaktivität auch eine Cyclodextrinaseaktivität und kann γ-Cyclodextrin spalten (Peist et al. 1996). Welche Rolle diese Aktivität in vivo spielt blieb bisher unklar, da γ-Cyclodextrin kein Substrat für E. coli darstellt. Kürzlich machten Mitarbeiter der Gruppe um Park in Korea die interessante Beobachtung, dass die Amylomaltase, MalQ, auch Cyclodextrin-transferaseaktivität zu besitzen scheint (persönliche Mitteilung von Prof. Boos., Park et al. unpublished). Das bedeutet, dass MalQ aus linearen Maltodextrinen Cyclodextrine bilden kann.
MalZ kann dann die von MalQ gebildeten γ-Cyclodextrine wieder spalten.
MalS ist ein Ca2+-abhängiges monomeres Enzym, das zwei Disulfidbrücken ausbildet (Spiess et al.
1997). Durch hydrolytische Spaltung werden im Periplasma längere Dextrine von MalS gespalten und können dann als kürzere Dextrine über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Maltotriose ist das kleinste Substrat von MalS (Freundlieb and Boos 1986). Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von längeren Maltodextrinen mit mehr als sechs Glukoseeinheiten als bevorzugtes Hauptprodukt Maltohexaose frei (Freundlieb et al. 1988).
Abbildung 4: Modell des Glykogen-Abbaus und der Bildung von Maltotriose.
Die Glykosylreste sind als Kreise angegeben, horizontale Verbindungen stellen α-1,4-glykosidische Verknüpfungen dar, gebogene Pfeile repräsentieren α-1,6-glykosidische Verbindungen. Ausgefüllte Kreise sollen beim Nachvollziehen der Herkunft der linearen Dextrine helfen. Nur Maltotetraose, nicht aber Maltotriose ist Substrat von MalP. Glukose-1-Phosphat wird von der Phosphoglukomutase zu Glukose-6-Phosphat umgewandelt um dann in die Glykolyse zu gelangen. Die Glukokinase, Glk, katalysiert die Bildung von Glukose-6-Phosphat aus Glukose.
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2.4. MalQ und seine komplexe Rolle im Maltodextrinstoffwechsel
Die Aktivität von MalT, dem Aktivator des Maltosesystems, ist abhängig von der Bindung von ATP und Maltotriose (Richet and Raibaud 1989, Schreiber and Richet 1999, Schwartz 1987). Maltotriose fungiert als Induktor des Maltosesystems, der den Aktivator, MalT, durch Bindung in seine katalytisch aktive Form überführt. Der interne Spiegel des Induktors für die mal Genexpression, Maltotriose, wird wie schon im vorhergehenden Abschnitt beschrieben von einer Reihe von Enzymen beeinflusst. In der Abwesenheit von Maltodextrinen im Medium wird ausgehend vom Glykogen in der Zelle durch eine Reihe von Abbauschritten letztendlich Maltotriose gebildet, die wiederum das Maltosesystem induziert, was als endogene Induktion bezeichnet wird. MalP bildet aus längeren Dextrinen Maltotriose und Glucose-1-Phosphat, MalZ dagegen baut die entstehende Maltotriose weiter zu Glukose und Maltose ab (Dippel et al. 2005). Die Rolle der Amylomaltase, MalQ, für die endogene Induktion ist dagegen schwerer zu verstehen. Von ihr werden für den Maltodextrinstoffwechsel zwei gegenläufige Reaktionen katalysiert. Einerseits reduziert sie die Menge an Maltotriose durch das Aufpolymerisieren zu längeren Dextrinen und Glukose, welche dann durch Glukokinase-abhängige Phosphorylierung aus dem Gleichgewicht entfernt wird. Andererseits kann MalQ Maltotriose aus Maltose neu bilden, um ausreichende Mengen an internem Induktor in der Zelle bereitzustellen. Dies ist speziell wichtig, um dem Abbau von Maltotriose durch MalZ entgegenzuwirken. Wenn Maltose von außerhalb in die Zelle gelangt ist dies auch die vorherrschende Reaktion durch die Maltotriose gebildet wird. In malQ Mutanten ist die glykogen-abhängige endogene Induktion hoch, speziell wenn MalZ fehlt, was dafür spricht, dass Maltotriose tatsächlich der interne Induktor ist (Ehrmann and Boos 1987).
Abbildung 5: Amylomaltase, MalQ, und ihre Rolle im Maltose/Maltodextrinstoffwechsel.
Die Glykosylreste sind als Kreise angegeben, horizontale Verbindungen stellen α-1,4-glykosidische Verknüpfungen dar.
Maltotriose, der Induktor des Maltosesystems, ist in einem Kasten gezeigt. Maltose wird durch zwei ausgefüllte Kreise angezeigt, Glukose durch einen Kreis. Maltotetraose besteht aus vier Kreisen. Nur Maltotetraose, nicht aber Maltotriose ist Substrat von MalP.
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2.5. Transkriptionelle Regulation des mal-Regulons - MalT und sein Induktor Maltotriose
Vor 47 Jahren entdeckten Jacob und Monod (Jacob and Monod 1961) die induzierbare Synthese der Lac-Enzyme in E. coli, die seitdem unsere Denkweise über die differentielle Genexpression geprägt hat. Das vorgestellte Operon-Modell über die Regulation der Genexpression in Prokaryoten definiert Begriffe wie Promotor, Operator und Repressor. Der vorgestellte Mechanismus postulierte eine Interaktion des Induktors mit dem Repressor, die das Abfallen des Repressors vom Operator bewirkt, und damit Genexpression erlaubt.
In der Folge wurden weitere Modellsysteme erforscht, die nun nicht nur negativ von Repressoren, sondern auch positiv von Aktivatoren reguliert wurden. Eines der ersten Beispiele hierfür war das Arabinosesystem aus E. coli, das im Gegensatz zum von Jacob und Monod vorgestellten lac-Operon sowohl negativ, als auch positiv reguliert wird (Engelsberg and Wilcox 1974, Schleif 1996). Das Maltosesystem aus E. coli war das erste System, von dem man annahm, dass es ausschließlich unter positiver Kontrolle steht (Hofnung 1974, Schwartz 1967). Die Vorstellung, dass die Mechanismen der Genregulation auf einer einfachen negativen oder positiven Rückkopplungsschleife beruhen, und das Regulatorprotein gleichzeitig der Sensor für das Vorhandensein des jeweiligen Zuckers ist, hielt sich bis in die 70er Jahre hinein. Heute wissen wir, dass es abgesehen von diesen Regulationsmechanismen noch weitere komplexe Netzwerke gibt, die unterschiedliche Signale oder Informationen wie zum Beispiel die Verfügbarkeit von verschiedenen Kohlenstoffquellen oder den Gesamtzustand des Stoffwechsels einer Zelle dazu benützen, um gezielt die Transkription oder Aktivität von Effektorproteinen zu regulieren (Stock et al. 2000, Smolen et al. 2000).
Das Phänomen der Katabolitenrepression ist ein komplexer Mechanismus, bei dem die Aufnahme einer bestimmten Kohlenstoffquelle und ebenfalls die Transkription der hierfür notwendigen Gene durch die Anwesenheit einer bevorzugten Kohlenstoffquelle (z. B. Glukose) solange unterdrückt wird, bis diese aufgebraucht ist (Wanner et al. 1978, Postma et al. 1993). In E. coli beruht dies auf der fehlenden Aktivierung cAMP/CAP-abhängig (catabolite activator protein) transkribierter Gene.
Glukose vermittelte Katabolitenrepression wird durch den Transport von Glukose durch das Phospho- Transferase-System (PTS) ausgelöst. Das Glukose-PTS besteht aus verschiedenen allgemeinen, cytoplasmatischen Komponenten: HPr (heatstable oder Histidin carrying protein, ptsH) und EI (Enzym I, ptsI) und aus den substratspezifischen Komponenten EIIAGlc, EIIBGlc und EIICGlc. EIIAGlc liegt frei vor, wohingegen EIIBGlc membrangebunden und EIICGlc in der Membran vorliegt.
Ausgehend vom Phosphoenolpyruvat (PEP) wird ein Phosphatrest über die Enzyme HPr, EI und EIIAGlc auf EIIBCGlc (ptsG) übertragen. Bei Transport von Glukose durch das Glukose-spezifische PTS wird dann die Phosphatgruppe von EIIBCGlc –P auf die transportierte Glukose übertragen, wodurch diese in Glukose-6-Phosphat umgewandelt wird. Die Phosphorylierung von EI setzt die
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Dimerisierung des Proteins voraus, was den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dieser Phosphorylierungskaskade darstellt. Durch die zuckerabhängige Dephosphorylierung (Transport und Phosphorylierung von Glukose), beziehungsweise die PEP-abhängige Phosphorylierung, liegen die PTS-Proteine entweder vermehrt in der dephosphorylierten, oder vorwiegend in der phosphorylierten Form vor. Unter Bedingungen, bei denen EIIAGlc hauptsächlich in dephosphorylierter Form vorliegt (wenn z. B. Glukose transportiert wird), wird die Adenylatcyclase nicht aktiviert. Die Adenylatcyclase katalysiert die Bildung von cyclischem AMP (cAMP) aus ATP (und wird von phosphorylierten EIIAGlc stimuliert) (Review von Botsford and Harman 1992, Postma et al. 1993). cAMP wird von CAP (catabolite activator protein), einem Transkriptionsfaktor, gebunden und ermöglicht dann die Transkription vieler Gene. Bei Transport von Glukose liegt EIIAGlc hauptsächlich in der dephosphorylierten Form vor, daher ist der cAMP/CAP-Spiegel gering und reicht nicht aus, um die meisten der cAMP/CAP-abhängigen Gene zu aktivieren. Unter diesen Genen sind solche, die für Proteine kodieren, die für den Transport und den Abbau alternativer Kohlenstoffquellen gebraucht werden. Dazu gehören unter anderem auch Gene des Maltose-Regulons (malT, und die Gene welche für das Transportsystem malEFG kodieren. Abbildung 6) (Chapon 1982 a/b, Postma et al. 1993).
Wenn EIIAGlc hauptsächlich in der dephosphorylierten Form vorliegt kommt es außerem zu einem weiteren Phänomen, dem Induktorausschluss („inducer exclusion“). Dabei bindet dephosphoryliertes EIIAGlc an Permeasen oder Enzyme verschiedener nicht-PTS-Systeme und verhindert daduch die Aufnahme der entsprechenden Substrate. Darunter befinden sich auch ABC-Transporter (z.B. das Maltosesystem) (Richet and Søgaard-Andersen 1994, Chapon 1982 a/b, Postma et al. 1993).
Abbildung 6: Schematische Darstellung von Katabolitenrepression und Induktorausschluss
Dargestellt werden die Proteine des Glukose-PTS (EIIBCGlc, EIIAGlc), die allgemeinen löslichen Komponenten des PTS (HPr, EI), die Adenylatcyclase (CyA), das Maltose ABC-Transportsystem (Maltosebindeprotein MBP,
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Membrankomponenten MalF/G, ATPase-Untereinheit MalK) und das „catabolite activator protein“ CAP. Pfeile mit (+) und (-) bedeuten positiven oder negativen Einfluss den die entsprechenden PTS-Proteine auf andere Transportsysteme oder Enzyme ausüben. P kennzeichnet die Phosphorylierung eines Proteins. PEP steht für Phosphoenolpyruvat, Mal für Maltose, Glc für Glukose und Glc-6-P für Glukose-6-Phosphat. Die Phosphorylierungskaskade findet ausgehend von PEP über EI, HPr und EIIA auf EIIB statt. Von hier aus wird der Phosphatrest dann auf die transportierte Glukose übertragen.
Innerhalb der letzten Jahre kam ein weiteres großes Feld der Regulation in den Focus der Wissenschaft: kleine, nicht-kodierende RNA Moleküle. Diese kleinen regulatorischen RNAs können sowohl die Aktivität von Proteinen beeinflussen, als auch auf die Stabilität und Translation von mRNAs einwirken. Sie wurden bei vielen verschiedenen Organismen gefunden wobei sie bei Bakterien in zwei unterschiedliche Klassen eingeteilt werden: Die erste, bisher weitaus größere Gruppe (mit bisher mindestens 20 Mitgliedern in E. coli) wirkt über die Basenpaarung mit der jeweiligen Ziel-mRNA, und beeinflusst somit die Stabilität und die Translation dieser mRNA. So führt beispielsweise die Akkumulierung von Phospho-Zuckern wie Glukose-6-Phosphat zu einer schnellen Degradierung der ptsG mRNA, die für den Haupt-Glukosetransporter IICBGlc kodiert (Morita et al.
2003). Dies geschieht unter der Beteiligung von RNase E und dem Degradasom (Morita et al. 2004).
Die Destabilisierung der ptsG mRNA wird durch eine kleine Antisense-RNA verursacht, SgrS, deren Synthese durch Phospho-Zucker Stress induziert wird (Kimata et al. 2001, Vanderpool and Gottesman 2004). Kleine RNAs fungieren somit als post-transkriptionelle Regulatoren der Genexpression (Gottesman 2002, Gottesman 2004, Storz et al. 2004). Bei dieser Klasse der RNAs ist ein RNA- Chaperon-Protein, Hfq, an der Regulation beteiligt. Die zweite Klasse von RNAs verändert die Aktivität von Proteinen. Gut untersuchte Beispiele in E. coli sind CsrB uns CsrC, zwei RNAs die an CsrA, einen translationellen Protein-Regulator, binden und dadurch inhibieren (Gudapaty et al. 2001, Jackson et al. 2002).
Im Folgenden soll die Rolle von MalT, dem zentralen Aktivator aller mal Gene, beschrieben werden, der ein Schlüsselelement in einem komplizierten Regulationsnetzwerk darstellt (Boos and Böhm 2000).
Mit einem Molekulargewicht von 103 kDa ist MalT ein ungewöhnlich großer Transkriptionsfaktor, unter dessen Kontrolle alle mal Gene stehen (Richet and Raibaud 1989). MalT Mutanten exprimieren nahezu keinerlei mal Gene und sie können nicht mehr auf Maltose wachsen. Einzige Ausnahme bildet malZ, dessen Synthese nicht nur von MalT kontrolliert wird, sondern unter Osmostress auch unabhängig von MalT induziert wird (Boos and Shuman 1998, Dippel et al. 2005). Von MalT wurde schon vor längerer Zeit angenommen, dass es in der Zelle in einem Gleichgewicht von zwei unterschiedlichen Formen vorliegt, und dass aktives MalT an spezifische MalT-Boxen bindet und so die Transkription der Zielgene stimuliert (Schwartz 1987). Die inaktive, monomere Form wird durch Bindung des Induktors Maltotriose in die oligomere, aktive Form überführt (Schreiber and Richet 1999). In Wildtyp Stämmen entsteht aufgrund der Enzymaktivitäten der Amylomaltase MalQ und der
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Maltodextrinphosphorylase MalP ständig neue Maltotriose, welche als Induktor für MalT wirkt, das dann die Transkription der mal Gene induziert.
Punktmutationen von MalT deuten ebenfalls auf die oben beschriebene Wirkungsweise des Aktivators hin. Diese malTc Mutanten zeigen eine Konstitutivität der mal Gene, so dass anzunehmen ist, dass MalT entweder eine erhöhte Affinität für den Induktor aufweist, oder unabhängig vom Induktor aktiv wird. Zusätzlich zur Bindung des Induktors Maltotriose (Kd ca. 20 µM) ist für die vollständige Aktivierung und Oligomerisierung von MalT außerdem noch die Bindung, nicht aber die Hydrolyse, von ATP notwendig (Kd ca. 0,4 µM) (Dardonville and Raibaud 1990, Raibaud and Richet 1987, Richet and Raibaud 1987). Weitere Argumente für eine Bindung der aktiven, multimeren Form von MalT an die Zielpromotoren lieferte die Kooperativität der Bindung an die in den Promotoren vorhandenen MalT-Boxen. Außerdem konnte auch für die Promotorbindung von MalT eine Abhängigkeit von der Anwesenheit der beiden Effektoren Maltotriose und ATP nachgewiesen werden (Richet and Raibaud 1987). Die MalT-Boxen beinhalten eine bestimmte Konsensussequenz (5`- GGGGA(G/T)GAGG- 3`), die sich nicht in der sonst üblichen -35 Region der Gene befindet, sondern im -37,5 oder -38,5 Bereich der MalT-abhängigen Gene (Vidal-Ingigliardi et al. 1991). Zusätzlich zu den für die Transkriptionsaktivierung notwendigen Effektoren Maltotriose und ATP unterliegen unter anderem malT selbst (beziehungsweise die malA Region) und die Gene die für das ABC- Transportsystem kodieren malEFGK (beziehungsweise die malB Region), der vorhin beschriebenen Katabolitenrepression und werden somit nur in der Anwesenheit von einem Komplex aus cAMP und dem catabolite activator protein (CAP) transkribiert (Richet and Søgaard-Andersen 1994, Chapon 1982 a/b, Postma et al. 1993). Die Expression von MalT wird also in der Gegenwart von Glukose reprimiert.
Die von MalT aktivierten Gene des mal Systems liegen auf verschiedenen Loci des E. coli Genoms.
Die malB Region bei 91,4 min beinhaltet die Gene die für die Transportproteine kodieren. Sie sind in zwei divergent transkribierten Operonen (malEFG und malK, lamB, malM) angeordnet. MalP und malQ liegen zusammen mit dem gegenläufig orientierten malT auf der malA Region bei 76,5 min. Die Gene, welche für MalZ und MalS kodieren, befinden sich auf getrennten Loci bei 9,1 min (malZ) und bei 80,5 min (malS) (Abbildung 7).
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Abbildung 7: Genetische Organisation des Maltose-Regulons in E. coli.
Obere Skizze: malA Region bei 76,5 Minuten. Die einzelnen Gene werden durch schwarz umrandete Kästen dargestellt. Die MalT-Bindestelle ist in gelb als Strich dargestellt. Die cAMP/CAP-Bindestelle wird durch einen blauen Strich symbolisiert.
Die schwarzen Pfeile stellen den Transkriptionsstart dar. Die Skizze ist nicht maßstabsgetreu in Bezug auf die Länge der Gene.
Mittlere Skizzen: malZ bei 9,1 Minuten und malS bei 80,5 Minuten. Die Gene werden durch schwarz umrandete Kästen dargestellt. Die MalT-Bindestelle ist in gelb als Strich dargestellt. Der schwarze Pfeil stellt den Transkriptionsstart dar. Die Skizze ist nicht maßstabsgetreu in Bezug auf die Länge der Gene.
Untere Skizze: malB Region bei 91,4 Minuten. Die einzelnen Gene werden durch schwarz umrandete Kästen dargestellt. Die MalT-Bindestellen sind in gelb als Strich dargestellt. Die cAMP/CAP-Bindestellen werden durch einen blauen Strich symbolisiert. Die schwarzen Pfeile stellen den Transkriptionsstart dar. Die Skizze ist nicht maßstabsgetreu in Bezug auf die Länge der Gene.
Bisher konnte nur ein Teil der Struktur von MalT gelöst werden (Steegborn et al. 2001). Das gesamte Protein besteht aus vier Domänen (DT1-DT4). Die konservierten Sequenzmotive zur ATP-Bindung, Walker A und Walker B, befinden sich in der N-terminal lokalisierten Domäne 1 (DT1, aa 1-242).
DT4 (aa 808 ff) bildet ein DNA-bindendes Helix-Turn-Helix-Motiv. Die beiden dazwischenliegenden Domänen DT2 (aa 243-437) und DT3 (aa 438-807) scheinen für die Maltotriosebindung und die Oligomerisierung verantwortlich zu sein (Danot 2001).
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2.6. Die Aktivität von MalT wird durch direkte Protein-Protein- Interaktion beeinflusst
Abgesehen von der Steuerung der MalT-Aktivität durch die Bindung des Induktors Maltotriose und des Effektors ATP, unterliegt die Aktivität von MalT zusätzlich noch der Regulation die durch die Interaktion mit anderen Proteinen gesteuert wird. Bisher sind drei Proteine identifiziert worden, die direkt mit MalT interagieren: MalK, MalY und Aes.
MalK ist die ATPase-Untereinheit des Maltosetransporters in E. coli. Die ATPase-Untereinheit besteht aus einer N-terminalen Nukleotid-Binde-Domäne (NBD) zur ATP-Bindung und einer C-terminalen regulatorischen Domäne (RD). Die C-terminale Domäne von MalK ist in zwei regulatorische Prozesse verwickelt (Böhm et al. 2002). Erstens wird MalK durch Enzym IIAGlc, einer Komponente des PTS (Phospho Transferase System) für Glukose, reguliert (Nelson and Postma 1984, Dean et al. 1990, Böhm et al. 2002). Abhängig von dem Vorhandensein von PTS-Zuckern kann Enzym IIAGlc entweder in der phosphorylierten oder in der unphosphorylierten Form in der Zelle vorliegen. In der unphosphorylierten Form, wenn beispielsweise ein PTS-Zucker wie Glukose vorhanden ist, bindet Enzym IIAGlc an MalK und verhindert dadurch die Aufnahme von Maltose über den ABC-Transporter.
Die Inhibierung wird wieder aufgehoben, wenn nur noch wenig oder keine Glukose mehr vorhanden ist, und Enzym IIAGlc wieder phosphoryliert wird. Dieser regulatorische Prozess definiert die Hierarchie in der die Zucker verwertet werden und ist als „Inducer exclusion“ bekannt. Der zweite bekannte Regulationsmechanismus beruht auf der Inhibierung der Aktivität von MalT, dem Aktivator des Maltosesystems, durch MalK. Hierbei bindet MalK die monomere, inaktive Form von MalT, das wiederum nicht mehr für die Transkriptionsaktivierung zur Verfügung steht (Reyes and Shuman 1988, Panagiotidis et al. 1998, Boos and Böhm 2000, Böhm et al. 2002, Joly et al. 2004). Dieser zweite Regulationsmechanismus von MalK soll im Folgenden genauer beschrieben werden.
Ein Zusammenhang zwischen dem Transportvorgang und der Genregulation durch MalT wurde schon früh anhand von Mutanten in malK vermutet (Hofnung et al. 1974). Diese Mutanten in der malB Region führen zu einer konstitutiven Expression von malQ (malA Region) und allen anderen MalT- abhängigen mal Genen, obwohl die entsprechenden Stämme für den Maltosetransport negativ sind (Kühnau et al. 1991). Im Gegensatz zu der Konstitutivität dieser malK Mutanten wurde festgestellt, dass die Überexpression von malK zu einer völligen Repression der MalT-abhängigen Genexpression führt. Ist allerdings gleichzeitig ein malTc Allel vorhanden oder wird zusätzlich malT überexprimiert, so hebt sich diese Repression wieder auf (Reyes and Shuman 1988). Die Eigenschaft von MalK als Repressor zu wirken ist scheinbar nicht nur an den Transport sondern auch an seine enzymatische Funktion gebunden. Hierfür sprechen zwei weitere Mutantenklassen: Mutationen in den Transmembrandomänenproteinen MalF (malF500 Allel) und MalG führen zu den sogenannten Bindeprotein-unabhängigen Mutanten, die Maltose/Maltodextrine auch in Abwesenheit von MalE
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(MBP) transportieren können. Diese Mutationen bewirken, dass MalK durch die veränderte Membrankomponente konstitutiv ATP hydrolisiert und eine erhöhte, partiell konstitutive, mal Genexpression stattfindet. Im Gegensatz dazu wird die ATPase-Aktivität von MalK im Wildtyp nur durch die Interaktion mit dem substratbeladenen Bindeprotein stimuliert. Diese Beobachtung spricht dafür, dass im aktiven Komplex während Substrattransport stattfindet, MalK nicht mehr als Repressor wirken kann. Mutanten die einen Aminosäureaustausch im ABC-Signature-Motiv tragen (malK941 Allel) können zwar noch ATP binden, es aber nicht mehr hydrolisieren. Diese Klasse von Mutanten wird als MalK Superrepressoren bezeichnet, da sie in der Lage sind, sogar in Mutanten die das malTc Allel tragen und somit konstitutiv malT exprimieren, die MalT-abhängigen Gene zu reprimieren (Kühnau et al. 1991, Schmees and Schneider 1998a, Schmees and Schneider 1998b).
1998 konnten H. Shuman und seine Mitarbeiter biochemisch nachweisen, dass MalT und MalK in vitro miteinander interagieren (Panagiotidis et al. 1998). Der Mechanismus der der Repression durch MalK zugrunde liegt ist also eine direkte Interaktion des aktiven, transportierenden MalEFGK2
Komplexes mit MalT, wobei der Transkriptionsaktivator in seiner inaktiven Form stabilisiert und an MalK gebunden wird. Somit ist die klassische Rolle des Transportsystems in der Induktion nun nicht mehr nur die Bereitstellung des Induktors Maltotriose durch den Transport über die Membran, sondern ist vielmehr direkt durch seine Transportaktivität und die Sequestrierung des Regulatorproteins MalT an der Regulation der mal Genexpression beteiligt (Boos and Böhm 2000, Joly et al. 2004, Böhm and Boos 2004).
Abbildung 8: Der Maltose/Maltodextrin-Transportvorgang reguliert die Aktivität von MalT.
MalG/F bilden die Transmembrankomponenten des Transporters, MBP ist das periplasmatische Bindeprotein und MalK die ATPase-Untereinheit (Homodimer). MalTi steht für inaktives, monomeres MalT. MalTa steht für aktives, multimeres MalT.
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Wenn kein Transport stattfindet wird monomeres MalTi an die Membran sequestriert und somit inaktiviert. Unklar ist wieviele MalT-Moleküle an MalK binden können. Im Bild sind schematisch zwei dargestellt, was bisher nicht bewiesen werden konnte. Während des Transportvorgangs wird MalTi frei und kann mit Maltotriose und ATP in die transkriptionsaktive Form überführt werden.
Ein weiteres Effektorprotein, dessen Interaktion mit MalT nachgewiesen werden konnte, ist Aes. Das cytoplasmatische Protein wurde während der Suche nach anderen Proteinen die MalT inaktivieren können gefunden, die mit Hilfe einer Expressionsgenbank von E. coli durchgeführt wurde. Aes weist eine signifikante Sequenzähnlichkeit zu Lipasen auf, allerdings entpuppte sich das gereinigte Enzym unbekannter physiologischer Funktion als eine Acetylesterase, die keine Lipaseaktivität besitzt (Peist et al. 1997, Joly et al. 2002). Mutationen in aes zeigen keinen Phänotyp und dennoch verhält sich Aes in Bezug auf die Repression der mal Genexpression genauso wie MalK, was auf dieselbe Wirkungsweise des Proteins hindeutet. Eine Überexpression von Aes hat eine totale Repression der mal Gene zur Folge, die auf den Verlust der Aktivität von MalT zurückzuführen ist. Maltotriose kann dieser Repression entgegenwirken, ebenso wie die Einführung eines MalTc Allels, wodurch die reprimierende Wirkung durch die konstitutive Expression der mal Gene stark vermindert wird. 2002 konnten Joly und Mitarbeiter zeigen, dass Aes mit MalT um die Bindung des Induktors Maltotriose konkurriert, indem es mit der N-terminalen Domäne von MalT (DT1) interagiert (Joly et al. 2002). In einer weiteren Studie wurden 2002 von Schlegel et al. 26 verschiedene MalT Mutanten isoliert, die sich alle im ersten Drittel von malT befinden und konstitutiv für die mal Genexpression sind, partiell unabhängig vom Induktor Maltotriose (Schlegel et al. 2002). Die Messungen der Transkriptionsaktivität erfolgten mittels einer malE-lacZ Fusion in einem ∆malK Stammhintergrund, wobei einige dieser Mutanten resistent gegen Aes waren, was darauf hindeutet, dass sich in dieser Region die Interaktionsstelle mit MalT befindet.
Das dritte und vorerst letzte Protein das nachweislich mit MalT interagiert ist die dimere Cysthathionase (β–CS–Lyase) MalY (Zdych et al. 1995, Clausen et al. 2000, Schlegel et al. 2002).
Das Maltosesystem zeigt das Phänomen der endogenen Induktion, das heißt, sogar in der Abwesenheit von extern im Medium vorhandenen Maltodextrinen ist die Basalexpression der mal Gene relativ hoch (Decker et al. 1993). Dieser Befund ist auf die endogene Produktion des Induktors Maltotriose zurückzuführen, der beim Abbau von Glykogen entsteht. Auf MalY stieß man indirekt während der Suche nach Enzymen, die zur internen Synthese des Induktors Maltotriose beitragen. Im Verlauf der Transposonmutagenese wurde das malI Gen isoliert (Ehrmann and Boos 1987). Resultat einer Insertionsmutante in malI ist eine dramatische Reduktion des „uninduzierten“ (oder vielmehr endogen induzierten) Levels der Basalexpression der mal Gene. Entgegen der Erwartung ein Enzym zu finden, welches den Induktor synthetisiert, kodiert malI für ein typisches Repressorprotein (Reidl et al. 1989).
Der Repression durch MalI unterliegen zwei Gene, die divergent zu malI auf einem Operon lokalisiert sind: malY und malX. In malI Nullmutanten ist folglich die Expression von malY und malX
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dereprimiert, was einen erhöhten Level an MalY-Protein in der Zelle zur Folge hat, der wiederum für die mal Genrepression verantwortlich ist (Reidl and Boos 1991). Die physiologische Bedeutung von MalX ist unklar, es ist ein Enzym II eines PTS das bei Überexpression Glukose und Maltose transportiert aber nicht phosphoryliert. Der Transport ist sehr ineffizient und daher wird angenommen, dass es sich nicht um die natürlichen Substrate handelt.
Das Dimer der Cysthathionase MalY besteht aus zwei identischen Untereinheiten von je 43,5 kDa, die beide ein Pyridoxal-5`-Phosphat als Kofaktor enthalten (Zdych et al. 1995). Das nicht homologe Gen metC kodiert für ein Enzym, MetC, das ebenfalls Pyridoxal-5`-Phosphat als Cofaktor trägt und dieselbe Reaktion wie MalY katalysiert. MetC ist an der Biosynthese von Methionin beteiligt (Review Artikel von Old et al. 1991). MetC Mutanten sind auxotroph für Methionin, können aber von malI Mutanten komplementiert werden, da diese MalY konstitutiv synthetisieren, welches die Funktion von MetC übernehmen kann. Dennoch bleibt die Funktion von MalY in der Zelle und die Frage, weshalb es an der Regulation des Maltosesystems beteiligt ist ungeklärt.
Durch biochemische Versuche konnte gezeigt werden, dass MalY reversibel mit MalT interagieren kann. Dieser Komplex kann durch Gelfiltrationsexperimente nachgewiesen werden und zeigt deutlich, dass nur die monomere Form von MalT an MalY bindet. Die gesamte Stöchiometrie des für die MalT Transkription inaktiven Komplexes ist sehr wahrscheinlich MalT-MalY2-MalT (Schlegel et al. 2002).
Der Induktor Maltotriose wirkt der Interaktion der beiden Proteine entgegen, aber die Bindung von Maltotriose an MalT wird reduziert, wenn MalY vorhanden ist (Schreiber et al. 2000). Durch in vitro Versuche in einem MalT-abhängigen Transkriptionsansatz mit gereinigten Komponenten konnte ebenfalls gezeigt werden, dass MalY mit der Transkriptionsaktivatorfunktion von MalT interferiert und dass Maltotriose dieser Inhibierung entgegenwirkt (Schreiber et al. 2000).
Die β-CS-Lyase-Aktivität von MalY ist nicht für die Repression der mal Genexpression notwendig, und so wurden Mutanten isoliert, die noch immer als Repressoren wirken ohne β-CS-Lyase-Aktivität zu besitzen, und Mutanten, die immer noch β-CS-Lyase-Aktivität besitzen, aber eine MalY-vermittelte Repression der mal Gene verhindern (Zdych et al. 1995). 2000 wurde von Clausen und seinen Mitarbeitern die Kristallstruktur von MalY gelöst (Clausen et al. 2000). Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Positionen der Aminosäurereste, die für die verminderte Repressoraktivität von MalY zuständig sind, zwar in der Primärsequenz an unterschiedlichen Positionen lokalisiert sind, in der Kristallstruktur aber ein gemeinsames Cluster an der Oberfläche bilden, das vermutlich die Interaktionsstelle mit MalT darstellt.
