Genetische- und molekularbiologische Methoden

Zur Präparation von Plasmiden wurde der QIAprep Spin Miniprep-Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Durchführung von Methoden wie PCR, Restriktionsverdau, Ligation und Agarosegelelektrophorese folgten den Anleitungen in Sambrook (Sambrook et al. 1989) und Maniatis (Maniatis et al. 1982) unter Einbeziehen der Herstellerangaben für die entsprechenden Enzyme. Alle PCR Reaktionen auf chromosomale DNA von T. thermophilus wurden mit der ProofStart Polymerase (Quiagen, Hilden) oder der Phusion Polymerase (Finnzymes) durchgeführt.

DNA-Fragmente wurden zur Reinigung über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mittels QiaQuick Gel Extraction-Kit (Quiagen, Hilden) eluiert. Die Herstellung kompetenter E. coli Zellen und Transformation von E. coli Zellen erfolgte chemisch mittels der Rubidiumchlorid-Methode (Quiagen Expressionist 2003). Aufgrund der natürlichen Kompetenz von Thermus thermophilus gestaltet sich die Transformation mit Fremd-DNA einfach: Eine Übernachtkultur wird 1:20 in 5 ml Trafo-Medium überimpft und 6 Stunden bei 70°C geschüttelt. Dann wurde 1 µg der zu transformierenden DNA ins Medium gegeben und weitere 2 Stunden bei 70°C geschüttelt bevor ausplattiert wurde.

Die Sequenzierung von DNA wurde von der Firma GATC (Konstanz) durchgeführt.

9.5.2. Präparation von chromosomaler DNA

Puffer: TNE Tris pH 8,0 10 mM TNEX (TNE mit 1% Triton X 100)

NaCl 10 mM

EDTA 10 Mm

Material und Methoden

158

Die Präparation von chromosomaler DNA aus E. coli und T. thermophilus erfolgte nach der Methode von Grimberg (Grimberg et al. 1989). Es wurden 2 ml einer Übernachtkultur abzentrifugiert und das Pellet einmal mit 2 ml TNE gewaschen und anschließend in 540 µl TNEX resuspendiert. Durch die Zugabe von 60 µl frisch angesetzter Lysozymlösung (5 mg/ml in H2O) und darauf folgender Inkubation bei 37°C für 20 Minuten wurde die Zellwand abgebaut. Anschließend wurden 30 µl Proteinase K (20 mg/ml in H2O) zugegeben und durch Invertieren gemischt. Nach zweistündiger Inkubation bei 65°C wurde die chromosomale DNA durch Ethanolfällung gewonnen. Dazu wurden 30 µl 5 M NaCl und 1 ml eiskaltes 100% Ethanol zugegeben und die DNA durch vorsichtiges Invertieren gefällt. Sie kann nun mit Hilfe einer Pasteurpipette aufgespult werden, mit 70% Ethanol gewaschen und anschließend getrocknet werden. Dann wurde die DNA mit 400 µl H2O aufgelöst und 30 Minuten bei 37°C geschüttelt. Die Aufbewahrung erfolgte entweder im Kühlschrank oder bei -20°C.

9.5.3. Konstruktion von Plasmiden

Die Plasmide in Tabelle 21 wurden konstruiert, indem die eingefügten Sequenzen mittels der in Tabelle 22 genannten Primer an chromosomaler DNA amplifiziert wurden und über Restriktion (siehe markierte Schnittstellen) und Ligation in die entsprechenden Vektoren eingefügt wurden. Oder durch Umklonieren, indem Sequenzen über Restiktionsverdau aus einem Plasmid ausgeschnitten wurden und in einen Vektor mit entsprechenden Schnittstellen durch Ligation eingefügt wurden.

9.5.4. Stammkonstruktionen

Die E. coli Stämme dieser Arbeit wurden durch P1 Transduktion konstruiert, wie schon von Miller beschrieben (Miller 1972). Deletionen in malP, malQ und malZ wurden nach der Methode von Datsenko und Wanner (Datsenko and Wanner 2000) in Kombination mit dem hitzeinduzierbaren λ -RED Rekombinations-System in Stamm DY330 (Yu et al. 2000) hergestellt. Für multiple Deletionen wurde die Antibiotika Resistenz-Kassette mit Hilfe des pCP20 Plasmids entfernt, das die FLP Rekombinase aus Saccharomyces cerevisiae enthält (Datsenko and Wanner 2000). Alle Stämme sind Derivative von BRE1162 (Bremer et al. 1985) der wiederum selbst ein Derivat von dem Standard lac Deletionsstamm MC4100 ist (Casadaban 1976). BRE 1162 trägt eine transkriptionelle malK-lacZ Fusion. Alle Daten zur mal Genexpression wurden mit Hilfe dieser malK-lacZ Fusion ermittelt. Die Mutation in glgA ist eine glgA::Tn10 Insertion. Stämmen die diese Insertion tragen fehlt Glykogen.

Die Mutation in glk, die zu Beginn routinemäßig als Standard Glk^- Phänotyp verwendet wurde, enthält eine Tn10(cam) Chloramphenicol Resistenzkassette nach Aminosäure 305 in Glk (Meyer et al. 1997).

Während dieser Arbeit wurde klar, dass diese Mutation zwar einen Verlust der Glukokinase Aktivität zur Folge hat, aber dass das C-terminal trunkierte Protein dennoch zur Interaktion mit PtsG fähig ist.

Material und Methoden

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Wir benannten diese Mutation glk15::Tn10(cam) (Meyer et al. 1997). Eine komplette glk Deletion wurde durch die Datsenko/Wanner Methode erhalten. Die Stämme GW26, GW27 und GW28 wurden durch die Transduktion eines P1 Lysats von Stamm TB48 (ΔglgA::cam malT::Tn5) in die Stämme AS40, AS54 und AS 53 erhalten. Selektiert wurde auf Chloramphenicol Resistenz und anschließend wurde auf das Fehlen der Kanamycin Resistenz und dunkle blaue Färbung auf X-Gal Platten gescreent. Dies stellte das Vorhandensein der malT Allele von AS40-54 sicher. Die Stämme behielten den ompR::Tn10 Marker und waren auxotroph für Tryptophan.

9.5.5. EMSA, Elektromobility Shift Assay

Der EMSA wurde wie in Chevance et al. 2006 beschrieben von Marc Erhardt durchgeführt.

9.5.6. Herstellung von Digoxygenin markierten RNA Sonden

Für die Detektion von mRNA mittels Northern Blot Analyse wurden Digoxigenin markierte RNA - Sonden verwendet. Dazu wurde der DIG-Northern-Starter-Kit von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim benutzt.

Zuerst wurden mittels PCR DNA-Fragmente amplifiziert, die 700 bp lang waren und identisch zum Zentrum der zu untersuchenden Gene waren. Als Ziel-DNA diente chromosomale DNA aus T.

thermophilus HB27 und die jeweils angegebenen Primer-Paarungen. An das 5’ - Ende der Primer, die der komplementären Sequenz der zu untersuchenden Gene entsprachen (reverse Primer), wurde die Promotorsequenz (GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGA) der T7 RNA-Polymerase angehängt.

Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden als Template für die T7 RNA-Polymerase benutzt. Um die Digoxigenin markierte RNA-Sonden zu synthetisieren wurde folgender Ansatz für 1,5 Stunden bei 42°C inkubiert:

x µl DNA - Fragmente (1 µg)

4 µl Labeling Mix 5 x

4 µl Transkriptions Puffer 5 x

1 µl RNAse Inhibitor

2 µl T7 RNA - Polymerase

Ansatz für die Herstellung von Digoxigenin markierte RNA - Sonden. Alle Zutaten mit Ausnahme der DNA - Fragmente sind Bestandteile des DIG-Northern-Starter-Kit von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim.

Material und Methoden

160

Als Negativkontrolle diente der gleiche Ansatz ohne DNA. Danach wurden 2 µl DNAse für 15 Minuten bei 37°C in die Ansätze gegeben. Nach der Inkubation wurde zu den Ansätzen je 0,8 µl EDTA (0,5 M pH 8), 2,5 µl LiCl (4 M) und 75 µl eiskaltes Ethanol gegeben (Ansätze durch invertieren gut mischen, aber nicht vortexen). Anschließend wurden die Sonden bei - 20°C über Nacht gefällt. Am nächsten Tag wurden die Proben 15 min bei 4°C und 12 000 g zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Die Pellets wurden einmal mit 70 % Ethanol (eiskalt) gewaschen und schließlich in 100 µl DEPC (0,1 %) aufgenommen.

Um festzustellen, ob und wenn ja, wie gut die Transkription erfolgt war, wurden von den Transkriptionsansätzen Verdünnungsreihen (10 ^{- 1}, 10 ^{- 2}, 10 ^{- 3}, 10 ^{- 4}, je 10 µl) hergestellt. Je 1 µl wurde auf eine positiv geladene Nylon Membran gespottet. Für die Detektion wurde wie in Kapitel 9.6.11 (Detektion) beschrieben vorgegangen.

9.5.7. Präparation von RNA aus Bakterien

Die für Northern Blot Analysen verwendete RNA wurde mittels des RNeasy Mini Kit von QIAgen GmbH, Hilden isoliert. Die dazu verwendeten T. thermophilus Kulturen wurden in MMA mit 1%

(wt/vol) CAA und jeweils 0,4% (vol/vol) des angegebenen Zuckers angezogen.

Nach jeweils 1,5; 3,5; 5; 7; 12; 17; 25; und 55 Stunden wurde ein Zellvolumen das einer Zellmenge von 3,5 x 10⁸ Zellen entsprach 1:1 mit RNA Protect Reagenz der Firma Quiagen vermischt und sofort abzentrifugiert (5000 g, 4°C). Die Zellpellets wurden bis zum Aufschluß bei - 80°C gelagert.

Ansonsten wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren.

Zur Präparation der RNA wurde nach Protokoll von QIAgen wie folgt verfahren: 200 µl TE Puffer mit Lysozym (15 mg/ml) wurden mit 20 µl Proteinase K (20 mg/ml) gemischt und zum Bakterienpellet gegeben. Das Pellet wurde vorsichtig resuspendiert, 10 Sekunden gevortext und anschließend 20 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden 700 µl frisch angesetzter RLT Puffer hinzugegeben und erneut 15 Sekunden gevortext. Die Proben wurden vier Minuten bei 14 000 rpm und Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 500 µl Ethanol (100%) vermischt.

Anschließend wurde genau nach Vorschrift 7 (Protokoll 7) der Anleitung des Kits verfahren.

Die RNA wurde in 2 x 12 µl DEPC Wasser eluiert.

Material und Methoden

161 9.5.8. Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese 0,8% - Agarosegel 0,8 % (w / v) Agarose in 1 x MOPS 10 x MOPS - Puffer 200 mM MOPS

10 mM EDTA 50 mM Na - Acetat

pH 7 (eingestellt mit NaOH)

steril filtriert, im Dunkeln im Kühlschrank aufbewahrt

RNA - Farbmarker (2x) (für RNA - Gelelektrophorese) 0,2 % (w / v) Bromphenolblau

0,2 % (w / v) Xylencyanol

65 % (v / v) Formamid

12 % (v / v) 36,5 %Formaldehyd

4 % (v / v) 50 % Sucrose

20 % (v / v) 10 x MOPS - Puffer

Die für die RNA-Gelelektrophorese verwendete Agaroselösung wurde immer frisch angesetzt. Dazu wurden 0,8 g Agarose in 74 ml sterilem DEPC – Wasser (0,1%) und 10 ml 10 x MOPS-Puffer durch dreimaliges Aufkochen in der Mikrowelle zum Quellen gebracht. Anschließend wurde die Lösung 30 Minuten bei 65°C inkubiert. Nun wurden 8,5 ml Formaldehyd zugegeben und die Lösung nochmals für 30 Minuten bei 65°C inkubiert.

Während des Ansetzens der Agaroselösung wurde eine horizontale Gel-Laufkammer, der entsprechende Gießschlitten und ein Kamm mit Spülmittel gut gereinigt, mit Millipore - Wasser dreimal gespült und unter dem Abzug getrocknet.

Die Gele wurden mit einer Höhe von ca. 0,4 cm gegossen und 1 h bei RT polymerisiert.

Aufgetragen wurden je 1 µg bzw. 0,7 µg der isolierten RNA (jeweils angegeben). Die Proben wurden vor dem Auftragen mit dem entsprechenden Volumen RNA-Farbmarker (2x) versetzt, 10 min bei 65°C denaturiert und kurz auf Eis abgeschreckt. Währenddessen wurde das Agarosegel in 1 x MOPS unter Spannung gesetzt (4 V / cm Elektrodenabstand) und vor dem Auftragen der Proben ca. 10 Minuten laufen gelassen.

Anschließend wurden die Proben zügig geladen und erneut Spannung angelegt (4 V / cm Elektrodenabstand). Unter den so gewählten Bedingungen läuft Xylencyanol (oberer Farbmarker)

Material und Methoden

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etwa auf einer Höhe von 4000 - 6000 Basen, Bromphenolblau (unterer Farbmarker) etwa auf einer Höhe von 500 Basen. Die Laufzeit wurde so gewählt, daß der untere Farbmarker noch ca. 1 cm vom unteren Gel - Ende entfernt war.

Nach dem Lauf wurde das Gel 5 min in 1 x MOPS (5 µg / ml Ethidiumbromid) inkubiert. Das Gel wurde anschließend dreimal für 20 Minuten in Millipore - Wasser entfärbt und unter UV - Licht fotographiert bevor der Northern-Blot (Abschnitt 9.6.11.) durchgeführt wurde.