Regenerierung der Punktmutante G 81 V durch FOA-Screening 69

Die Punktmutante G₈₁V wurde für diese Arbeit neu generiert. Dazu wurde zunächst das Plasmid pRSG313-[G₈₁] amplifiziert und sein GAL1-10-[G₈₁]-Insert sequenziert, um die Punktmutati-on zu beweisen. Nachdem es für korrekt befunden war, wurde es in den Stamm WDHyp2-16Gal transformiert und auf HWL⁻-Glukose-Medium plattiert, was den neuen Hefestamm W303-h1h2-[HYP2/URA3][G₈₁−HYP(hum)/HIS3] erzeugte. Da das URA3-Plasmid pRSG316 seltener verloren ging, konnte auf eine Selektion gegen den U⁺-Phänotyp verzichtet werden.

Gleichzeitig wurde das Wildtyp-HYP(hum) durch Gebrauch der Restriktionsenzyme Bam-HI/XbaI in den pRSG313-Vektor kloniert und das korrekt sequenzierte Plasmid ebenfalls für Transformation des Ausgangsstammes eingesetzt (führte zu W303-h1h2-[HYP2/URA3][WT-HYP(hum)/HIS3]). Vor dem folgenden FOA-Screen wurden die hierfür eingesetzten Koloni-en durch die in Abschnitt 5.1.2 beschriebKoloni-ene Kolonie-PCR-Methode überprüft. Wie

Abbil-N

C Gly 71 (81)

Lys 40 (50)

A.

B.

Lys-Rest

der Hypusinbildung Hyp2p (Hefe)

10 20 30

| | |

S D E E H T F E T A D A G S S A T Y P M Q C S A L R K N G F V V

| | |

10 20 30

40 50 60

| | | |

Hyp2p (Hefe) I K S R P C K I V D M S T S K T G K H G H A K V H L V A I D I F

| | |

40 50 60

70 80 90

| | |

Hyp2p (Hefe) T G K K L E D L S P S T H N M E V P V V K R N E Y Q L L D I D D

| | |

70 80 L G 90

100 110 120

| | |

Hyp2p (Hefe) G F L S L M N M D G D T K D D V K A P E G E L G D S L Q T A F D

| | |

100 110 120

130 140 150

| | |

Hyp2p (Hefe) E G K D L M V T I I S A M G E E A A I S F K E A A R T D

| | |

130 140 150

Hyp(hum)p A D D L D - F E T G D A G A S A T F P M Q C S A L R K N G F V V

Hyp(hum)p L K G R P C K I V E M S T S K T G K H G H A K V H L V G I D I F

Hyp(hum)p T G K K Y E D I C P S T H N M D V P N I K R N D F Q L I G I Q D Mutanten:

G

Hyp(hum)p G Y L S L L Q D S G E V R E D L R L P E G D L G K E I E Q K Y D

Hyp(hum)p C G E E I L I T V L S A M T E E A A V A I K A M A K

rot blau

: -Helices

: -Faltblattstrukturen a

b

Abbildung 5.9: Struktur des Hypps als Ausgangspunkt der Mutagenese. A.: Vergleich der Proteinsequenzen von Hyp2p versus humanem Hypp und Lage der Mutationsstellen an den Resten 81, bzw. 82. Schattierte Kästen um Originalsequenzbereiche kennzeichnen identische Bereiche zwischen beiden Proteinen und stellen evolutiv konservierte Reste dar. Der posttranslational zu Hypusin modifizierte Lysin-Rest K₅₁(bzw K₅₀im humanen Pro-tein) ist violett unterlegt. In der Proteinsequenz aus Methanococcus Jannashii liegt der Hypusinrest an Position 40. Durch die über den Sequenzen angeordneten farbigen Balken ist die Domänenstruktur des Hypps nach der Röntgen-Kristallstruktur-Analyse in Methanococcus jannashii angedeutet. Es handelt sich um ein Zweidomänen-Protein, beide Domänen sind durch eine flexible Übergangssequenz verbunden. Die untersuchte Mutante G₈₁V (human), bzw. G₈₂V (Hefe) liegt in diesem Übergangsbereich.

B.: Darstellung der Röntgenstruktur des Hypps aus Methanococcus jannashii. Das Protein besitzt eine Zweidomä-nenstruktur. Die N-terminale Domäne enthält den Hypusinrest, der exponiert am Extrempunkt eines Turns liegt.

Die C-terminale Domäne besitzt Motivähnlichkeit zu einer SH3-Domäne, bestehend aus einer fünfsträngigenβ -Fass-Struktur. Die Mutationsstelle G₈₁liegt am Anfang der flexiblen Übergangsregion.

dung 5.11 B. darstellt, zeigten die meisten Doppeltransformanten-Klone wie erwartet beide Fragment-Signale bei 421 bp und 720 bp. Drei der Einzelkolonien, die das Doppelbandenmu-ster deutlich aufwiesen, wurden in drei unabhängigen FOA-Selektionen eingesetzt.

Kleinkulturen der drei Einzelklone wurden in UHWL⁻-Medium angezüchtet. Bei Erreichen einer OD₆₀₀ von ca. 0,8 wurde die Inkubation gestoppt und die optische Dichte aller drei Kul-turen exakt auf den gleichen Wert eingestellt und verdünnt. Ca. 1000 Zellen in 80 µL Medium wurden auf 5-FOA-HWL⁻-SSM-Nährplatten ausgebracht und 6 Tage bei 25°C inkubiert. Auf identische Weise wurde mit drei Kolonien verfahren, die nach Transformation des Wildtyp-HYP(hum)-Vektors entstanden. Abbildung 5.11A zeigt eine Übersicht der erhaltenen Kolonie-zahlen der Mutante G₈₁ nach der 5-FOA-Selektion im Vergleich zum Wildtyp. Dabei ergaben sich in drei unabhängig durchgeführten Ansätzen jeweils ähnliche Koloniezahl-Verhältnisse (Wildtyp:Mutante = 3:1). Schon dieses Ergebnis zeigte, dass die Punktmutation einen klaren Abschwächungseffekt auf die HYP-Funktion hatte.

Chromosom V:

hyp2::LEU2

Chromosom X:

hyp1::TRP1

pRSG313-HYP(hum) pRSG313-HYP(hum)G81 (hum.)

Hyp (Wildtyp)

(hum.) (G ) Hyp

81 cDNA

HIS3

cDNA

HIS3

Wildtyp-Kontrolle

WDH(hum)Gal WDHG Gal₈₁

Punktmutante G₈₁

Abbildung 5.10:Schema des durch FOA-Selektion erhaltenen differentiellen Hefe-Stammsystems zur Analy-se der Mutante G₈₁ im Vergleich zum Wildtyp-Protein Hyp(hum)p. Beide Stämme tragen nur das Single-Copy-Plasmid pRSG313-[G₈₁], bzw. pRSG313-HYP(hum) als einzige funktionelle HYP-Gen-Quelle.

Die FOA-Selektion generierte den Stamm WDHG₈₁Gal, der nun die punktmutierte Hypp-Form G₈₁V als einzige Hypp-Quelle exprimierte sowie die zugehörige Wildtyp-Kontrolle WDH(hum)Gal. In dieser war die hefeeigene Wildtypform Hyp2p durch die humane Form Hypp(hum) ersetzt. Das erhaltene differentielle Stammsystem als Ausgangssystem der phä-notypischen Charakterisierung ist im Schema von Abbildung 5.10 abgebildet.

Nach den unabhängig durchgeführten 5-FOA-Selektionen wurden wiederum Kolonie-PCR-Experimente (siehe Abbildung 5.11C) mit jeweils 20 erhaltenen Kolonien von WDHG81Gal und der Wildtyp-Kontrolle WDH(hum)Gal als Templat durchgeführt. Dargestellt sind jeweils 6-7 Einzelüberprüfungen pro FOA-Screen der Mutante. Die PCR-Ergebnisse des Wildtyps zeigten dabei ein ähnliches Bild (nicht gezeigt). In allen Fällen wurde lediglich das Frag-ment der Größe 421 bp im Gegensatz zur Positivkontrolle amplifiziert, die beide Plasmidsorten pRSG316(URA3) und pRSG313(HIS3), als Ausgangs-DNA enthielt. Dies zeigte den sicheren Verlust des URA-Plasmids in allen überprüften koloniebildenden Hefezellen an und wies das pRSG313-X-Plasmid als einzige HYP-Gen-Quelle im differentiellen Stammsystem aus. Die aus den drei unabhängigen FOA-Screens erhaltenen Mutanten werden im Folgenden mit G₈₁(1-3) bezeichnet.

2000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

1

D Y H 2 3 4 5 6 7 8 9

10 1112 13 14 15 16 1718 19

2000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

1

D Y H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 1617 18 19 20 B.

vor FOA

C.

nach FOA

563

502

603

175 166 192

0 100 200 300 400 500 600 700

FOA-Screen 1 FOA-Screen 2 FOA-Screen 3

Einzelkolonienzahl pRSG-WT-HUM

pRSG-G -HUM81

A.

Abbildung 5.11:Verlauf der 5-FOA-Selektionen zur Regenerierung des Mutanten-Stammes WDHG₈₁Gal und der zugehörigen Wildtyp-Kontrolle.

A.: Anzahl erhaltener Kolonien aus drei unabhängigen FOA-Screens nach Ausplattierung gleicher Zellzahlen von Wildtyp- und Mutanten-Vorläuferkulturen auf 5-FOA-haltigem HWL⁻-SSM.

B.: Kolonie-PCR-Experiment von Klonen nach der Transformation des HIS3-Plasmids in den Ausgangsstamm. Es wurden in jeder PCR-Reaktion beide in Abbildung 5.3 beschriebene Primerpaare simultan eingesetzt. Die meisten Klone zeigen ein Amplifizierungsmuster aus zwei Banden. Drei der so positiv getesteten Kolonien wurden in drei unabhängigen 5-FOA-Screenings eingesetzt.

C.: Kolonie-PCR-Reaktionen mit Kolonien, die nach den drei FOA-Screenings erhalten wurden. Die Spuren 1-7 sind zugehörig zu FOA-Screen 1, Spuren 8-14 zu FOA-Screen 2, Spuren 15-20 zu FOA-Screen 3. Der selektive Druck des 5-FOA führte sicher zu Hefekolonien, deren Zellen das URA3-Plasmid verloren hatten. Nur das pRS-313-spezifische Fragment der Länge 421 bp wurde jeweils amplifiziert. Spuren D, H und Y sind das PCR-Ergebnis der drei Positivkontrollen: D:HIS3- und URA3-Plasmid; H: nur HIS3-Plasmid; Y: nur URA3-Plasmid als Templat eingesetzt.

Wildtyp

Mutante G81 Klon 1 WDHG Gal₈₁

WDH(hum)Gal

WDHG Gal81 Mutante G81

Klon 2

Selektivmedium: HWL -Galaktose/Raffinose

-25°C 37°C

Abbildung 5.12:Wachstum der Mutante G₈₁ im Vergleich zum Wildtyp WDH(hum)Gal bei 25°C und 37°C.

Ein Wildtyp-Klon und zwei aus unabhängigen FOA-Selektionen erhaltene Mutantenstämme wurden auf Galaktose haltigem HWL⁻-Medium ausgebracht und 7 Tage bei den unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Beide Mu-tantenstämme zeigten langsameres Wachstum als der Wildtyp und ausgeprägte Temperatursensitivität. Bei 37°C zeigte G₈₁kein Wachstum.

5.1.4 Wachstumsverhalten des Hefestammes WDHG₈₁Gal im Vergleich zum Wildtyp Im Vergleich zum Wildtyp-Stamm WDH(hum)Gal zeigte die Mutante WDHG₈₁Gal schon nach Ausplattierung auf 5-FOA-HWL⁻-Selektivmedium ein deutlich langsameres Wachstum. Die erhaltenen Kolonien hatten eine hellere, weniger bräunliche Färbung als der Wildtyp. Im ersten Schritt der phänotypischen Charakterisierung galt es, die Temperatursensitivität des Mutanten-Stammes gegenüber dem Wildtyp zu überprüfen. Beide Stämme wurden dazu auf HWL⁻ -Mediumplatten mit einer Mischung aus Galaktose und Raffinose als Kohlenstoffquellen ausge-strichen und bei 25°C und 37°C inkubiert. Abbildung 5.12 zeigt das langsamere Wachstum der Mutante bei 25°C und ihre ausgeprägte Temperatursensitivität bei 37°C. Bei dieser restriktiven Temperatur war kein weiteres Wachstum zu beobachten. Die Aufzeichnung von Wachstums-kinetiken ermöglichte den Blick auf das genaue Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp bei permissiver (25°C) und restriktiver (37°C) Temperatur (Abbildungen 5.13 und 5.14). Aus den unterschiedlichen FOA-Isolierungen gewonnene Wildtyp- und Mutanten-stämme wurden in Flüssig-Selektivmedium angezüchtet. In den Über-Nacht-Kulturen befanden sich alle Stämme am Ende der logarithmischen Wachstumsphase und wurden auf die gleiche Zelldichte eingestellt. Dies geschah durch photometrische Messung der optischen Dichten bei 600 nm und anschließender Verdünnung, bzw. Aufkonzentrierung. Der kinetische Zuwachs der Zelldichte der Kulturen bei 25°C ist in Abbildung 5.13 dargestellt. Die Mutante zeigte dabei eine reproduzierbare Verdopplungsperiode in der logarithmischen Phase von ca. 6 h, während die des Wildtyps bei 3 h lag.

Nach Anlegen der restriktiven Temperatur von 37°C zeigte sich, wie erwartet, ein beschleu-nigtes Wachstum des Wildtyps. G₈₁-Zellen verdoppelten sich innerhalb der ersten zwei Stunden nach Anlegen der hohen Temperatur genau einmal. Danach trat ein vollständiger Wachstums-stopp ein.

Um eine Reversibilität der Wachstumsarretierung zu prüfen, wurden zwei Kolonien der Mu-tanten G₈₁(1) und (2) auf HWL⁻-Gal-SSM ausplattiert und bei 25°C für 6 Tage inkubiert. Pro

0 4 8 12 16 20 24 0

1 2 3 4 5 6 7

G81 (3) G81 (2) G81 (1) WT (1) WT (2)

OD

600

Zeit [h]

25°C

Abbildung 5.13:Wachstumverhalten von drei G₈₁-Mutantenstämmen im Vergleich zum Wildtyp HYP(hum) bei 25°C (permissive Temperatur). Alle Stämme wurden aus jeweils unterschiedlichen 5-FOA-Selektionen erhalten.

0 4 8 12 16 20 24

0 1 2 3 4 5 6 7

OD600

Zeit [h]

G81 WT-HYP(hum)

37°C

Abbildung 5.14:Wachstumskinetik des Hefestammes WDHG81Gal im Vergleich zum Wildtyp (Expression von HYP(hum)) bei 37°C (restriktive Temperatur).

Platte ergaben sich etwa 400 Einzelkolonien, die darauf für weitere 48 h bei 37°C gelagert wurden. Von den Petrischalen wurden Replika-Plattierungen auf frische SSM-Platten angefer-tigt und diese erneut bei permissiver Temperatur für eine Dauer von 6 Tagen inkubiert. Dabei zeigte ein kleiner Anteil der pro Einzelkolonie vorhandenen Zellen eine Wiederaufnahme des Wachstums, was auf eine Arretierung mit Teilreversibilität der Hefezellen hinwies.

Daher wurde eine Viabilitätsstudie von arretierten und nicht arretierten Zellen durchgeführt (siehe unten Kapitel 5.1.10, Seite 139).

Im Dokument Funktionelle Analyse des Hypusin enthaltenden Proteins in Saccharomyces cerevisiae (Seite 80-86)