Genetische Überprüfung der Doppeldisruption beider HYP-Gene

Die für die Erzeugung der Doppeldisruption eingesetzten Knock-Out-Kassetten sind in ih-rer genetischen Struktur in Abbildung 5.1 dargestellt. Im ersten Schritt wurde das genomi-sche HYP2-Gen, befindlich im Plasmid p21LEU2, durch Einklonieren eines 2,22 kb-LEU2-Fragments in seine genuine SalI-Schnittstelle disruptiert. Das nach PstI-Verdau aus diesem Plasmid erhaltene 3,65 kb Fragment diente zur Transformation des diploiden Hefe-Stammes W303-D, was zu einem homologen Rekombinationsereignis führte. Nach Tetradenanalyse des nun auf LEU⁻-Medium wachsenden Klons W303-D#6-9 wurde eine Ascospore isoliert, die einer haploiden hyp2-Disruptante entsprach [WÖHL1994]. Das nur unter anaeroben Bedingun-gen aktive HYP1-Gen wurde dann in diesem Stamm durch homologe Rekombination mit dem aus dem Vektor p14RB-TRP isolierten 3,6 kb-EcoRI/BamHI-Fragment, welches eine Inserti-on mit einem TRP1-Marker besitzt, deaktiviert. Die erfolgreich disruptierten KlInserti-one besaßen einen UWL⁺-Phänotyp. Nach diesem Vorgehen liegt entsprechend der Länge der auxotrophen Marker im Doppel-Knock-Out-Stamm für den Genlocus des HYP2 eine Verlängerung um 2,2 kbp (+LEU2)-Marker), für den des HYP1 eine Verlängerung um ca. 1,6 kbp (+TRP1-Marker)

TRP1^{(1.6 kb)} A. Kassette für Knock-Out von HYP1:

in Vektor p14EB-TRP

HYP1 HYP1

3,6kb

0,84kb 1,1 kb

EcoRI XhoI SalI (SmaI/NaeI) HindIII AatII SalI BamHI

LEU2^{(2.22 kb)}

HYP2 HYP2

3,65kb

0,908 kb 0,514 kb

PstI XhoI SalI PstI

B. Kassette für Knock-Out von HYP2:

in Vektor p21LEU2

KpnI

Abbildung 5.1:Schematische Darstellung der Knock-Out-Kassetten, die für die Disruption beider in Saccharo-myces cerevisiae vorkommenden HYP-Gene, HYP1 und HYP2, eingesetzt wurden.

A.: In das HYP1-Gen wurde durch die im Gen nur einmal vorkommende Sal I-Schnittstelle zunächst ein Oligo-Linker ligiert, in dessen SmaI- und AatII-Schnittstellen das 1,6 kbp große TRP1-Marker-Gen eingebracht wurde.

Daraus resultierte ein 3,6 kbp EcoRI/BamHI-Fragment im Knock-Out-Vektor p14RB-TRP, das für die homologe Rekombination des Stammes W303# 6-9D, der bereits ein mit LEU2 disruptiertes HYP2-Gen enthielt, eingesetzt wurde.

B.: Das HYP2-Gen wurde durch Einklonieren eines 2,22 kb-Fragments, welches den funktionellen LEU2-Marker enthielt, deaktiviert.

vor. Zur Kontrolle wurden Southern-Blots des Stammes WDHyp2-16Gal und des haploiden Kontrollstammes W303-1MATa angefertigt.

Genomische DNA wurde isoliert und jeweils mit drei verschiedenen Restriktionsendonu-kleasen, EcoRI, BamHI, HindIII, gespalten. Jeweils gleiche Mengen der verdauten DNA wur-den auf ein Agarosegel gelawur-den und die Nukleinsäurefragmente elektrophoretisch aufgetrennt.

Das Ethidiumbromid gefärbte Gel (Abbildung 5.2A) belegt, dass jeweils gleiche Mengen ge-spaltener genomischer DNA der beiden Hefestämme für die Analyse eingesetzt wurden. Die unterschiedlichen Fragmentmuster der drei verwendeten Endonukleasen zeigen eine zunehmen-de Fragmentierung zunehmen-des Hefegenoms von BamHI über HindIII nach EcoRI. Die Nukleinsäure-Banden wurden darauf durch Tank-Blotting auf eine positiv geladenen Nylon-Membran über-tragen.

Zur Sichtbarmachung der Hybridisierungsbanden im Southern-Verfahren wurde eine nicht-radioaktive Detektionsmethode auf Chemolumineszenzbasis gewählt (siehe Materialien und Methoden, Abschnitt 4.2.13, Seite 33).

Der durch UV-Bestrahlung vernetzte Blot wurde im ersten Schritt mit einer Probe gegen die

12.000 bp

2000 bp 3000 bp 4000 bp 5000 bp 6000 bp^{7000 bp} 8000 bp 10.000 bp

1650 bp

1000 bp 900 bp 750 bp 600 bp

W303a W303-h1h2 W303-h1h2 W303-h1h2

W303a W303a

1 2 3 4 5 6

EcoR I BamH I Hind III

A.

W303a W303a W303a W303a W303a W303a

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

HYP1 + HYP2 LEU2 TRP1

A B

EcoR I BamH I Hind III BamH I Hind III Hind III

W303-h1h2 W303-h1h2 W303-h1h2 W303-h1h2 W303-h1h2 W303-h1h2

B.

Abbildung 5.2:Southern-Blot-Analyse des Ausgangsstammes WDHyp2-16Gal (hier als WDH-h1h2 bezeich-net) als haploide hyp2::LEU2- und hyp1::TRP1-Transformante.

A.:Darstellung des Agarosegels für den Tank-Blot. Aufgetragen ist die Doppeldisruptante (Spuren 2, 4, 6) im Ver-gleich mit dem Wildtyp-Stamm W303-1MATa (Spuren 1, 3, 5). Die genomische DNA wurde zuvor mit EcoRI (Spuren 1 u. 2), BamHI (Spuren 3 u. 4) und HindIII (Spuren 5 u. 6) enzymat. gespalten. 10 µg DNA wurden pro Spur auf ein 0,8%iges Agarosegel geladen, die Elektrophorese bei 20V über Nacht durchgeführt. Banden wurden mit Ethidiumbromid im Gel sichtbar gemacht. Die Fragmentgrößen sind in bp angegeben.

B.: Hybridisierung desselben Blots mit drei verschiedenen Proben nacheinander: links HYP-spezifische Probe (er-kennt HYP1 und HYP2 aufgrund hoher Homologie), daneben: Probe gegen LEU2 (Mitte) und gegen TRP1(rechts).

Durch Klammern an den nach Hybridisierung mit der HYP-Probe erhaltenen Banden ist die erwartete Massener-höhung der zum HYP1-Gen-(Klammer A, ca. 1700 bp) und zum HYP2-Gen (Klammer B, ca. 2300 bp) gehörenden Fragmente im HindIII-Verdau angedeutet.

codierende Sequenz des HYP2-Gens hybridisiert. Aufgrund des hohen Identitätsgrades beider codierender HYP-Gen-Bereiche von 91% hybridisierte diese Sonde mit beiden HYP-Genen im Blot, was das Auftreten einer Doppelbande impliziert. Die HYP2-Sonden-Hybridisierung ist im linken Teil von Abbildung 5.2B dargestellt. Spur 5 zeigt die Hybridisierungssignale der HYP-Gene in der Wildtyp-Kontrolle, Spur 6 die der Doppeldisruptante. Es wurde deutlich, dass ein Verdau der genomischen DNA mit HindIII das günstigste Fragmentmuster für die Detektion der Veränderungen in den HYP-Loci aufweist. Im Gegensatz zum EcoRI-Muster wurden die-se unfragmentiert erhalten, was die Planung des Fragmentierungsmusters und somit die Wahl von Hind III als Endonuklease voll bestätigte. In Spur 6 ist ein Massenshift beider Banden in der Doppeldisruptante erkennbar, wobei im gesamten Blot keine neuen mit der HYP2-Probe hybridisierenden Banden zu detektieren waren.

In den Spuren 9 und 10 ist nach Entfernung der HYP2-Signale die Hybridisierung desselben Blots mit einer LEU2-spezifischen Sonde und in den Spuren 11 und 12 die entsprechenden Si-gnale nach einer dritten Hybridisierung mit einer TRP1-Sonde im Hind III-Fragmentspektrum dargestellt. Beide Hybridisierungen zeigen jeweils zwei Banden, die in der Kontrolle und im

Doppel-Knock-Out völlig identisch auftreten (LEU2-Signale bei 12.500 bp, TRP1-Signale bei 2150 bp). Es sind die nativen Loci der LEU2- und TRP1-Gene, die im Stamm W303-1MATa bereits inaktiviert sind. Zusätzlich tritt in Spur 10 ein LEU2-Fragment bei 7600 bp auf, wel-ches dasselbe Molekulargewicht wie das untere Fragment in Spur 6 aufweist. Analog zeigte das in Spur 12 detektierte zusätzliche TRP1-Fragment dieselbe Wanderungsdistanz wie das obere HYP-Fragment in Spur 6 auf. Dies deutet darauf hin, dass in Spur 6 das schwerere HYP-Signal bei 9500 bp die TRP1-Sequenz und das leichtere Fragment bei 6600 bp die LEU2-Sequenz ent-hält, was das in Abbildung 5.1 gezeichnete Bild der gestalteten Knock-Out-Kassetten voll be-stätigt. Ebenso entsprechen die Größendifferenzen zwischen dem leichteren Fragment in Spur 5 und dem LEU2-Fragment in Spur 6 von ca. 2300 bp sowie die Differenz zwischen dem schwe-reren HYP2-Fragment des Wildtyps und dem oberen TRP1-Fragment in der Disruptanten von ca. 1700 bp den nach den Marker-Einfügungen zu erwartenden Größenzuwächsen beider HYP-Gene (vgl. Abbildung 5.1). In beiden Hybridisierungen gegen Marker-HYP-Gene blieben weitere deutliche Signale aus, welche die gleiche Intensität wie die beschriebenen aufwiesen.

Dies zeigte, dass im doppelt disruptierten Ausgangsstamm der HYP2-Genlocus ein LEU2-Gen und der HYP1-LEU2-Genlocus ein TRP1-LEU2-Gen enthielt und beide HYP-LEU2-Gene so erfolgreich aus-geschaltet vorliegen. Ferner waren beide Rekombinationsereignisse homolog, da das Auftreten der Markerbanden und die in ihrer Basenlänge erweiterten HYP-Fragmente bei gleichen Frag-mentgrößen erfolgte. Da keine zusätzlichen TRP1- und LEU2-Signale als die zu erwartenden im Fragmentspektrum des Ausgangsstamms detektiert wurden, konnte man ausschließen, dass andere Genloci als die beabsichtigten von den Eingriffen in das Genom betroffen waren. Das Funktionieren der eingebrachten auxotrophen Marker wurde durch den [Leu/Trp]⁺-Phänotyp des Ausgangsstammes, ausgedrückt durch seine Fähigkeit zum Wachstum in einem Selektiv-medium ohne Leu und Trp, dokumentiert.