Allgemeine Eigenschaften der Auswertungsergebnisse

In unabhängigen Ansätzen wurden je RNA-Fraktion (Nukleus, Cytosol, Gesamtzellen, jeweils bei 25°C und 37°C) zweimal Biotin-gelabelte cRNA-Proben aus Gesamt-RNA-Präparationen als Ausgangsmaterial gewonnen, das aus separat isolierten Hefestämmen von G81 und dem Wildtyp stammte.

Für die nachfolgende Analyse wurden sechs Genchips aus derselben Charge zur Hybridisie-rung gegen die drei Probenpaare von Wildtyp und Mutante der gleichen Temperaturstufe paral-lel eingesetzt. Dieser Ansatz wurde dann noch zweimal mit frisch isoliertem RNA-Material aus unabhängigen Hefekulturen wiederholt. Tab. 5.11 verdeutlicht, dass auf diese Weise der Drei-fachbestimmung 4 Blöcke, bestehend aus 6 Genchiphybridisierungen, die zu 2×6 Vergleichs-paaren von Wildtyp und Mutante führten, resultierten. Aus den digitalisierten

Hybridisierungs-0 200 400 600 800 1000 1200 1400

-1 0 1 2 3

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3

-0,5 0,5 1,5 2,5

Faktor FC

AnzahderProbensätze

anr.

abr.

Abbildung 5.34:Verteilungen des Faktors FC in den aus 9336 Probensätzen bestehenden Datensätzen aus drei vergleichenden Einzel-Genchip-Experimenten. Sie wurden jeweils mit Gesamt-RNA (Kulturen bei 37°C inkubiert) der drei Fraktionsgruppen Nukleus (schwarzer Graph), Cytosol (grün) und Gesamtzelle (rot) durchgeführt.

fluoreszenz-Bildern aus jedem der 36 Einzelchips wurden 36 Datensätze erzeugt und mit Hilfe des Vergleichs-Algorithmensatzes der Affymetrix-Software (siehe Materialien und Methoden) 18 Paar-Vergleichsdatensätze mit FC- und p-Werten berechnet.

Im folgenden wird ein Satz von Oligonukleotiden, 25°C 37°C

Gesamt-RNA

aus: WT G81 WT G81

Nuclei 3 3 3 3

Cytosol 3 3 3 3

Gesamt-Zellen 3 3 3 3 Tabelle 5.11: Aufteilung der insgesamt 36 durchgeführten Genchip-Hybridisierungen.

deren DNA-Sequenzen aus demselben ORF entnom-men wurden, als Probensatz bezeichnet. Demnach re-präsentiert ein Probensatz auf dem Genchip einen spe-ziellen ORF des Hefegenoms.

In Abbildung 5.34 sind die FC-Wert-Verteilungen für vergleichende Chipexperimente, die mit drei ver-schiedenen RNA-Fraktionen (Zellkern, Cytosol, gan-ze Zellen) von Mutante und Wildtyp bei 37°C durch-geführt wurden, unter Einbeziehung aller Probensätze des Arrays dargestellt. Die Grafik belegt die gute Übereinstimmungen der Verteilungen in den Randbereichen. Schwankungen sind in den Median-Umgebungen zu erkennen. Das Datenmaterial zeigt jedoch für den überwiegenden Teil der Transkripte eine Streuung des Anreicherungsfaktors FC um den Wert 1. Der Hauptteil der ORFs zeigt demnach keine signifikante An- oder Abreicherung. Abzulesen ist eine Asym-metrie der Verteilungen im FC-Wert-Intervall von 1,7 bis 4, in dem mehr Transkripte eine An-reicherung aufwiesen als im entsprechenden AbAn-reicherungsintervall. Die Verteilungen in den übrigen Chip-Experimenten der gleichen RNA-Fraktionen sowie alle Vergleiche nach Inkubati-on bei 25°C wiesen die in Abb. 5.34 gezeigte Asymmetrie auf. Die Mehrzahl der angereicherten Kandidaten liegen demnach im Bereich einer schwachen Anreicherung mit Faktoren von 2 bis 6. Auf die speziellen Eigenschaften der zugehörigen Gene wird weiter unten eingegangen.

untere p-Wert-Grenze:≤0,065

Chip-Experiment-Gruppe

anger. Probensät-ze (Durchschnitt)

abger. Probensät-ze (Durchschnitt)

Σ(an+ab) Verhältnis an/ab

Kernisolation 25°C 380 316 696 1,203

Kernisolation 37°C 413 264 677 1,564

Cytosol-Fraktion 25°C 382 331 713 1,154

Cytosol-Fraktion 37°C 419 255 674 1,653

Gesamt-RNA 25°C 423 273 696 1,549

Gesamt-RNA 37°C 364 261 625 1,395

Tabelle 5.12:Anzahl der an- und abgereicherten Transkripte in allen 12 vergleichenden Genchipauswertungen.

Es wurden nur Probensätze einbezogen, deren p-Wert als Signifikanzindikator bei höchstens 0,065 lag. Die Wer-te sind aus den drei EinzelexperimenWer-ten mit den einzelnen mRNA-Isolierungen bei 25 und 37°C arithmetrisch gemittelt.

Für die Interpretation des FC-Wertes als Indikator eines an- oder abgereicherten Transkrip-tes in der Mutante wurde unter Berücksichtigung der FC-Standardabweichungen, die zwischen 5 und 40% lagen, folgende Einteilung gewählt:

FC≥1,7 Anreicherung in G₈₁ gegenüber Wildtyp

−1,7<FC<1,7 keine signifikanten Unterschiede im Expressionsverhalten FC≤ −1,7 Abreicherung in G81 gegenüber Wildtyp

Die Standardabweichung des FC-Faktors im Genchipexperiment, wie hier durchgeführt, ist mit bis zu 40% als hoch anzusehen, liegt aber auch bei Vergleichen mit der Literatur in dieser Größenordnung. Zur Verbesserung der Messgenauigkeit wären weitere Mehrfachbestim-mungen erforderlich. Jedoch musste die Zahl der Replikate aus Kostengründen begrenzt blei-ben. Aufgrund des Auswerteverfahrens über eine Wilcoxon-Statistik konnte die Signifikanz der Messwerte durch Angabe des Vergleichs-p-Wert für jede mRNA auf dem Chip erhöht werden.

So war es möglich, auch bei geringer Replikat-Anzahl verlässliche Aussagen zu treffen.

Der FC-Wert eines Transkriptes wurde als signifikant eingestuft, wenn sein p-Wert unter-halb von 0,065 lag. Dies entspricht einer 6,5%-igen Wahrscheinlichkeit, dass der gemessene Unterschied auch gemessen worden wäre, wenn es sich um zwei identische Wildtyp-RNA-Proben gehandelt hätte. In diesem Fall würde der Messunterschied auf reinem Zufall oder auf Verfahrens-technischen Messfehlern beruhen.

In Tabelle 5.12 spiegelt sich das Ergebnis einer asymmetrischen Verteilung von Abbil-dung 5.34 wider. Dargestellt sind die durchschnittlichen Zahlen an- und abgereicherter Tran-skripte aus den Vergleichen der einzelnen RNA-Fraktionsgruppen. Es wurden nur Probensätze berücksichtigt, deren p-Wert unter 0,065 lag. Die Transkriptzahlen aus den beiden Doppelbe-stimmungen wurden gemittelt. Die Zahl der angereicherten signifikanten Transkripte im FC-Wertbereich von 2 bis 6 lag in allen Fraktionen 16 bis 64% höher als die Zahl der abgereicher-ten. Eine Temperaturabhängigkeit der Asymmetrie oder Spezifität für den Zellkern oder das Cytosol war aus den Daten nicht zu entnehmen.

Die Höhe des Faktors FC lag bei den am höchsten an- bzw. abgereicherten Transkripten etwa der gleiche Größenordnung. Die größte Abreicherung eines Transkriptes in G₈₁ (37°C)

wurde mit einem FC-Wert von durchschnittlich -19,61 gemessen, während der höchste Anrei-cherungsfaktor bei +25,2 lag.

Aus Tabelle 5.12 ist ersichtlich, dass in allen RNA-Unterfraktionen sowohl bei 25°C als auch bei 37°C durchschnittlich knapp 700 ORFs des Hefegenoms eine unterschiedliche Ex-pressionsrate (Summe aus an- und abgereicherten ORFs) aufwiesen. Dies entspricht ca. 11%

von 6430 ORFs, die im Genom von Saccharomyces cerevisiae identifiziert wurden.

5.1.9.2.1 Funktionelle Verteilung Hypp-abhängiger mRNAs

In der Mutante G₈₁ herunter- und heraufregulierte Transkripte aus den drei untersuchten dif-ferentiellen RNA-Fraktionen (nukleäre Geamt-RNA, cytosolische RNA und Gesamt-RNA aus intakten Zellen) wurden auf ihre Zugehörigkeit zu zellbiologischen Funktionsgruppen untersucht. Alle zu ORFs des Hefegenoms gehörenden Probensätze auf dem Chip wurden da-bei in 14 Genfunktionsgruppen eingeteilt. Hierda-bei dienten die Funktionsannotationen aus der

„Comprehensive Yeast Genome Database“ (CYGD) des Münchener Informationszentrums für Proteinsequenzen (MIPS) [MEWESet al. 2002], Stand Juni 2003, als Referenz. Die gewählte Einteilung ist ein Kompromiss, die zellbiologische funktionelle Diversität der beteiligten Gen-produkte in überschaubarer Form darzustellen und dabei dennoch eine notwendige, ausreichend große Aufsplittung der Funktionsgruppen vorzunehmen.

Eine Übersicht über die Verteilung in allen RNA-Fraktionen sowie die Beschreibung der gewählten Einteilung ist Abbildung 5.35 zu entnehmen. Den Kreisdiagrammen lagen die ab-und angereicherten Transkripte der drei RNA-Fraktionen bei 25°C ab-und 37°C zugrab-unde, deren p-Werte unter 0,065 lagen und deren Mengen in Tabelle 5.12 aufgeführt sind. Die FC-Faktoren aus Replikat-Versuchen wurden auch hier gemittelt.

Der Anteil von ORFs mit unbekannter Funktion lag bei beiden Inkubationstemperaturen etwa gleich hoch. Im Falle der angereicherten Kandidaten lag er zwischen 26 und 33% und damit um durchschnittlich 11% höher als im Falle der abgereicherten Genprodukte (13 bis 21%).

Am auffälligsten bei der Verteilung abgereicherter Probensätze ist die hohe Zahl von Ge-nen mit mitochondrialen FunktioGe-nen, vor allem Gene, die sowohl chromosomal als auch mi-tochondrial für Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe codieren. Dieser Anteil lag in allen Diagrammen zwischen 16 und 28%. Bei den angereicherten Spezies lag diese Gengruppe bei nur etwa 3%. Hier spiegeln sich Ergebnisse der proteomischen Analysen wider, die Abrei-cherungen von Atmungskettenkomplexen gezeigt haben (vgl. Abschnitt 5.1.6.1.4 ff.), was eine Übereinstimmung proteomischer und transkriptomischer Ergebnisse bedeutet.

Der Temperaturshift von 25°C auf 37°C wirkte sich kaum auf die Genfunktionsverteilung in den drei RNA-Fraktionen aus. Z.B. besitzen die Diagramme der Kern- und Gesamt-RNA-Fraktionen im Fall der angereicherten Gene bei beiden Temperaturen sehr ähnliche Zusam-mensetzungen. Abweichend von diesem Verhalten fiel in der Überexpressionspopulation der Cytosolfraktion der Anteil von Genen, die an Transkription und Translation beteiligt sind, im Vergleich von 25°C und 37°C um die Hälfte, während der Anteil transposaler Elemente um

3% 5%

8%

3%

6%

9%

5%

1%

7% 2%

12%

4%

2%

33%

4% 5%

8%

25%

3% 9%

1%10%

1,2%

2%

13%

2%

3%

14%

3% 9%

5%

4%

5%

5%

5%

3,4%

9% 4%

13%

3%

31%

1%

Zellkern-RNA

5% 8%

4%

16%

6%

1%

1% 9%

3%

22%

0%

4%

21%

0%

2% 5%

10%

4%

9%

7%

3,3%

0,8%

7% 2,2%

17%

3,1%

2%

28%

5% 5%

7%

28%

4% 10%

1% 7%

2,2%

4%

10%

2%

2,2% 13%

4% 6%

6%

2%

9%

10%

5%

1,7%

6% 1%

14%

5%

2%

28%

angereichert

abgereichert angereichert

4% 6%

8%

20%

2%6%

1,3%6%

4%

21%

1%

1,4%

19%

0,8%

abgereichert

3% 5%

13%

2%

8%

9%

6% 5%

14%

4%

2%

27%

1%

1%

Gesamt-RNA

5% 6%

5,3%

27%

4% 9%

5%

2%

1,3%

3%

12%

1%

1,3%

19%

3% 6%

9%

2%

8%

10%

4%

2%

5% 1%

18%

4%

2%

26%

Cytosolische RNA

3% 5%

10%

21%

3% 6%

7%

0,8%

1%

5%

16%

20%

1,2%

1,1%

25°C

37°C

andere Funktion

Zellzyclus, Replikation, DNA-Metabolismus, Zellkern-Faktoren Energie- und Zuckerstoffwechsel mitochondriale Gene: Funktion, Biogenese, Metabolismus

Metabolismus: Nukleotid-, Lipid-, Co-Enzym-, Stickstoff-Schwefel-,

Amin-Plasmamembran-Transporter, Detoxifikation

Proteine: Aminosäuremetabolismus, Degradation RNA: Prozessierung und Metabolismus Sporulation und geschlechtliche Fortpflanzung

Stress-Antwort

Transkription und Translation Transposale Elemente und Steuerungsgene

Zellwand, Cytoskelett, Signaltransduktion unbekannte Funktion

3,9% 8,6%

4,1%

2,7%

3,7%

4,8%

5,6%

1,8%

5% 2,8%

14,2%

0,9%

5,1%

36,8%

Hefe-Gesamttranskriptom 6233 ORFs

Abbildung 5.35: Funktionelle Einteilung von in G₈₁ ab- und angereicherten Transkripten nach Gen-Chip-Versuchen bei permissiver und restriktiver Temperatur. Das Diagramm rechts neben der Legende zeigt die Funkti-onsgruppeneinteilung für das gesamte Hefe-Transkriptom, dem 6233 ORFs zugrunde liegen. Die Einteilung basiert auf den Funktionsbeschreibungen in der MIPS-CYGD-Datenbank, Stand Juli 2003.

den Faktor drei anstieg. Die spezielle Betrachtung der Expressionsmuster und der sie bildenden Gene im einzelnen unterstrich jedoch das globale Erscheinungsbild der qualitativen Unabhän-gigkeit vom Temperatureinfluss.

Im Vergleich zur Häufigkeit im gesamten Hefe-Genom sind Transposons und Gene zur Kon-trolle dieser Elemente unter den angereicherten mRNAs signifikant angereichert. In den abge-reicherten Fraktionen sind diese Gene unter 2% anwesend. Dies deutet auf eine Rolle Hypps in der Kontrolle der Transposon-Aktivität hin.

Die Verteilung der Genfunktionen des gesamten Hefe-Transkriptoms (Abb. 5.35, Diagramm rechts neben der Legende) besitzt, abgesehen vom Anteil der Gene ohne bekannte Funktion, ei-ne viel größere Ähnlichkeit mit den Diagrammen angereicherter mRNAs sowohl bei 25°C als auch 37°C als mit den Verteilungen abgereicherter Kandidaten. Daraus kann abgeleitet werden, dass eine mögliche Wirkung des Hypusin enthaltenden Proteins, deren Störung in der Mutante G₈₁ zu einer Anreicherung von mRNA-Spezies führt, sich nicht auf eine spezielle Funktions-gruppe von Genen auswirkt, sondern auf ein Subset von Genen, die verschiedene Funktionen der Zelle gleichermaßen betreffen.

Genaues Tabellenmaterial der in der Mutante bei 37°C an- und abgereicherten ORFs kann unter „http://www.biochem.mpg.de/Lottspeich/“ (Stichwort Hypusin) eingesehen werden.

Im Dokument Funktionelle Analyse des Hypusin enthaltenden Proteins in Saccharomyces cerevisiae (Seite 123-129)