Beeinträchtigung des telomeren Positions-Effektes in G 81

0 2 4 6 8 10 12

1 15 29 43 57 71 85 99 113 127 141 155 169 183 197 211 225 239 253 267 281 295 309 323 337 351 365 Probensatz-Zahl

FC-Wert

Hyp(hum)p-G81-Studie UPF-Null-Studie

Abbildung 5.39:Vergleich der mittleren FC-Werte von 375 ORFs, die übereinstimmend in den beiden HDOA-Analysen von upf⁻-Mutanten von der Hyp(human)-ts-Mutante G₈₁als angereichert gefunden wurden. Die Daten-sätze wurden nach den G₈₁-FC-Werten absteigend sortiert.

Die hohe Ähnlichkeit des Anreicherungsmusters zu Hefestämmen mit ausgeschaltetem NMD-mRNA-Abbauweg bleibt aber evident.

5.1.9.5 Anreicherung von Pseudogenen – ein direkter Hinweis auf NMD-Defizienz Eine Transkript-Gruppe mit Akkumulation bei defizienter HYP-Funktion stellten die mRNAs der Pseudogene dar. Sie können für vollständige Proteine codieren, enthalten aber innerhalb der codierenden Sequenz oft ein oder mehrere deaktivierende Elemente wie vorzeitige Stop-Codons und Leserahmenverschiebungen, die zur Verhinderung einer Translation und zu einem verstärkten Abbau solcher Transkripte durch NMD führen. Die Anreicherung ihrer mRNAs liefert daher einen direkten Hinweis auf einen Ausfall des NMD-Abbauweges. Aufgrund ihrer pseudogenen Eigenschaften werden diese ORFs auch dORFs („disabled open reading frames“) genannt. Es wird angenommen, dass in Bäckerhefe bis zu 221 dORFs vorhanden sind, die häufig chromosomal in telomernahen Bereichen codiert sind [HARRISONet al. 2002].

Die sechs BSC-Gene als Vertreter der dORFs wurden früh als „Bypass of Stop Codon“-Gene bezeichnet, da man erkannt hatte, dass zu ihrer Translation vorzeitige Stop-Codons in der Sequenz vom Ribosom überlesen werden mussten. Dennoch ist ihre Translation nachgewiesen [NAMYet al. 2003]. Vier mRNAs dieser sechs Gene zeigen Anreicherung in G81.

ORF Gen FC (37°C)±SD Struktur-Element

YDR275W BSC2 2,03±0,62 Stop-Codon-Überbrückung YLR465C BSC3 tel3,28±1,52 „

YNL269W BSC4 6,26±1,28 „ YNR069C BSC5 tel2,75±1,16 „ YJR155W AAD10 tel3,78±1,15 „

YLR463C tel4,24±0,53 „

YIL164C NIT1 tel2,78±0,93 Stop-Codon-Überlesung zwischen YIL164C und YIL165C

YGL261C tel3,82±0,61 Leserahmenverschiebung

Tabelle 5.18: Anreicherung von Pseudogenen. (tel = subtelomer codiert). Weitere Anreicherungsfaktoren von Pseudogenen und dORFs finden sich im Anhang unter Punkt 7.1.

82

21 56 62

36

67

27

44

16

90

14 18 0

20 40 60 80 100 120

1 2 3 4

ORFs 1-178 ORFs 179-355 ORFs 356-533

165 (31%) telomerische ORFs

ORF-Anzahl

219 (41%) nicht telomerische oder TY-LTR-nahe ORFs

101 (19%) ORFs nahe TY-LTRs

48 (9%) TY-LTRs

Abbildung 5.40:Positionierung der 533 ORFs mit der stärksten Anreicherung in G₈₁im Hefegenom hinsicht-lich ihrer Lage zu Telomeren oder LTR-Elementen von Ty- Retrotransposons. Die Verteilung mit absteigenden FC wurde gedrittelt.

lokalisiert sind, waren in der Mutante angereichert. Demgegenüber akkumulierten nur ca. 7%

(408 von 5863) der nichttelomerisch codierten ORFs in den G₈₁-Stämmen. Die Chipergebnisse zeigen eine Anhäufung von Sequenzen aus Multigen-Familien, deren Mitglieder sich nahe an den Telomeren wiederfinden, wie FLO- (121 Mitglieder), MEL- (123), SUC- (11) oder MAL-Gene (15).

In Saccharomyces cerevisiae sind in gesunden Zellen solche Gene transkriptionell repri-miert, die sich in Telomernähe befinden – einem Genombereich mit von Natur aus geringerer ORF-Dichte als in nicht-telomerischer chromosomaler DNA. Dieses Phänomen wurde telo-merer Positionseffekt (TPE) genannt [GOTTSCHLINGet al. 1990]. TPE nimmt im Normalfall mit steigender Distanz vom Telomer schnell ab. Die Untersuchung der 533 am höchsten expri-mierten ORFs auf ihre chromosomale Lokalisation ergab die Verteilung von Abbildung 5.40.

Dabei wiesen 31% (165 ORFs) eine Lage nahe am Telomer auf. 219 ORFs (41%) zeigten kei-ne telomerische Nähe. Inkei-nerhalb der 533 ORFs lag der Anteil der meisten subtelomerischen ORFs bei den am höchsten angereicherten Probensätzen, wie die Aufteilung der 533

Transkrip-YAL067C ( ) 2,438

SEO1 YAL065C

1,47 YAL064C-A 1,53

YAL063C ( ) 3,62

FLO9 YAL054C

(ACS1) 1,58

YAR071W (PHO11) 5,99 YAL064W

10,86 YAL062W (GDH3) 4,2

YAL061W 0,57

YAL059W (ECM1) 0,51

YAL066W 0,951

YAL068C 3,27

YAL060W (BDH1) 0,89

YAL058W (CNE1) 0,97

YAL056W (GPB2) 0,74

YAR070C YAR069C 1,15

3,60

YAR068W 3,16

YAR073W (IMD1) 2,9 YAR066W

1,41 YAR064W 1,25 YAR053W

2,15 YAR050W (FLO1) 1,54 YAR042W

(SWH1) 0,73 YAR035W

(YAT1) 0,84

YAR047C 1,11 YAR040c

1,02

YNL339C (YRF1-6) 0,88

YAL064C -A 1,53

YAR060C 3,67 Centromer

Chromosom 1 (A)

Chromosom 14 (N)

Chromosom 15 (O)

I

XIV

XV

YNL337W 1,57

YNL336W (COS1) (1,7)

YNL335W 10,87

YNL333W (SNZ2) 1,28

YNL327W (EGT2) 0,28

YNL324W 0,855

YNL323W (LEM3) 0,66

YNL326C 1,44

YNL325C (FIG4) 0,86

YNR077C 1,542 YNR074C YNR073C0,88

3,8 YNR071C 1,08 YNR069C (BSC5) 2,75 YNR068C 4,59 YNR067C (DSE4) 0,13 YNR065C

YNR064C2,95 1,0

YOL166C 1,26

YOL165C (AAD15) 3,54

YOL161C 7,53

YOL160W 1,65

YOL159C 5,46 YOL158C

(ENB1) 2,31

YOL155C

0,29 YOL153C

2,83

TEL15R-YP YOR394W 2,7 YOR393w YOR392W 3,13 YOL150C 0,99 YOL154W

0,38 YOL152W (FRE7) 1,63

YOL151W (GRE2) 0,94

YOL149W (DCP1) 0,83 YNR070W

1,09 YNR063W

0,98

YNR076W (PAU6) 3,79 YNR075W

(COS10) 2,02 YNL334C

(SNO2) 2,13 YNL331C (AAD14 2,61)

YNL330C (RPD3) 0,6

YNL329C

(PEX6) 2,69YNL328C (MDJ2) 1,64

YOL164W 2,74

YOL162W 5,18

YOR391C 3,54 YOR390W 0,84 YOR389W 3,93

YOR388C (FDH1) 3,35 YOR387C

0,33

YOR386W (PHR1) 1,44 YOR385W 1,81 YOR384W (FRE5) 1,04

YOR383C (FIT3) 2,22 YOR382W (FIT2) 2,51 YOR381W

(FRE3) 5,99 YOR380W

(RDR1) 4,62 YOR378W 0,87

YOR379C 1,55 deutlich angereichert

angereichert ohne Änderung abgereichert keine Messung

Abbildung 5.41:Darstellung des Expressionsverhaltens von telomerischen Genen in der G₈₁-HDOA-Analyse.

Stellvertretend für alle 16 Chromosomen ist die teilweise Aufhebung des telomerischen Positions-Effektes (TPE) an den Telomerbereichen der Chromosomen 1, 14 und 15 gezeigt. Die signifikante Häufung von deutlich angerei-cherten ORFs im subtelomerischen Bereich, die in der Wildtyp-Zelle schwächer exprimiert werden, ist an jeweils beiden Telomerbereichen des Chromosoms erkennbar.

ORF Gen Beschreibung FC (37°C)

±SD p

Avg.FC¹

Position im Chromosom YLR233C EST1 TLC1-RNA-assoziierter Faktor involviert in

Telomer-Verlängerung

5,82±0,53 0,00294 2,01 nicht telomerisch YBL088C TEL1 Reaktion auf schadhafte DNA; Telomerase-abhängiger

Telomer- Erhalt 2,89±0,16 0,01220 subtelomer

YLR010C TEN1 involviert in Telomer-Längenregulation und Schutz der Telomerenden

2,88±0,05 0,05220 3,3 nicht telomerisch

YDL146W schwache Ähnlichkeit zu Orc3p 2,36±0,19 0,04850 nicht telomerisch

YKR091W SRL3 Suppressor der rad53-Lethalität; Nukleinsäuremetabolismus 2,36±0,08 0,02290 subtelomer YDR082W STN1 involviert in Telomerlängen-Regulation; könnte funktionell

im Telomer-Metabolismus in der späten S-Phase sein

2,15±0,29 0,05980 2,43 nicht telomerisch YHR119W SET1 involviert in der Chromatin-vermittelten Gen-Regulation 2,08±0,11 0,05870 neben Ty-LTR YJR127C ZMS1 Transkriptionsfaktor mit Ähnlichkeit zum regulat. Protein

Ard1p

2,02±0,27 0,05885 nicht telomerisch YLR453C RIF2 Kernprotein, das sysnergistischen Einfluss auf die

Telomerlänge und den Verlust von Chromosomen hat; bindet telomerische DNA

1,99±0,37 0,03841 subtelomer

YNL261W ORC5 Chromatin-Silencing an HMR und HML 1,96±0,13 0,02350 1,69 nicht telomerisch YIL009C-A EST3 Komponente des Telomerase-Holoenzyms, involviert in

Telomer-Replikation

1,92±0,26 0,03210 neben Ty-LTR YLR318W EST2 103 kD-Protein (basisch), katalytische Untereinheit der

Telomerase, besitzt Aktivität einer reversen Transkriptase 1,89±0,40 0,06027 2,28 nicht telomerisch YKR101W SIR1 involviert am Silencing-Effekt an HMR und HML 1,89±0,36 0,05391 subtelomer

Tabelle 5.19: Angereicherte ORFs, deren Gene an Funktionen des Telomer-Metabolismus beteiligt sind. Die vorletzte Spalte enthält den Anreicherungsfaktor „Avg.FC“ der UPF123-Knock-Out-Studie.

te in drei Expressionsbereiche in Abbildung 5.40 zeigt: 82 der 165 subtelomerischen ORFs lagen im ersten Drittel der nach absteigendem FC-Wert sortierten Probensätzen. Je niedriger der Anreicherungsfaktor war, umso geringer war auch die Wahrscheinlichkeit, einen betref-fenden ORF am Telomer aufzufinden: Nur 27 aus 533 ORFs waren im unteren Drittel der FC-Wert-Verteilung telomer-ständig. Die Beeinträchtigung des subtelomerischen Silencing-Effektes (oder auch TPE) wurde ebenfalls in nmd∆-Hefestämmen beobachtet.

Zur Ausschaltung des TPE passt das Ergebnis, dass unter den Telomer-fernen angereicher-ten Genen sich sowohl in der G81- als auch in der UPF⁻-Analyse einige Gene fanden, die direkt mit der Steuerung telomerischer Funktionen in Zusammenhang stehen; darunter befindet sich das für die katalytische Proteineinheit der Telomerase codierende Gen EST2 und dessen Akti-vator EST1 sowie STN1 und TEN1. Tabelle 5.19 listet weitere Telomer-steuernde Gene auf, die sowohl im nicht telomerischen als auch im telomerischen Bereich codiert sind und hochreguliert erschienen.

Einen Ausschnitt der Beeinträchtigung des telomeren Positions-Effektes durch die einge-schränkte HYP-Funktion zeigt Abbildung 5.41. Die subtelomerischen Bereiche der Chromoso-men 1, 14 und 15 sind exemplarisch für alle anderen ChromosoChromoso-men mit der räumlichen Anord-nung und Angabe Anreicherungsfaktoren FC der einzelnen ORFs dargestellt. Erkennbar wird der hohe Anteil von deutlich angereicherten Genen und ORFs (rote Anfärbung) in der Nähe zu den Telomeren.

Die teilweise Aufhebung des telomerischen Silencings betraf grundsätzlich alle Chromoso-men von 1-16, da subtelomerisch codierte hochregulierte ORFs von allen ChromosoChromoso-men in den 165 Probensätzen enthalten waren. Besonders stark zeigte sich der Effekt jedoch an den Telo-meren der Chromosomen 8 (H) und 15 (O). Unter den subtelomerisch codierten ORFs konnten auf beiden Chromosomen 21 als angereichert bzw. deutlich angereichert identifiziert werden.

Orf Gen Beschreibung FC (37°C)±SD p

Avg.FC CKI Score YKL071W schwache Ähnlichkeit zum nor-1-Protein ausA. parasiticus 4,66±1,00 0,02549 4,65 0,97

YHR180W hypothet. Protein 4,48±1,77 0,03794 2,3 0,75

YIL028W mögliches Pseudogen 4,31±0,37 0,02042 2,58 0,47

YGR144W THI4 involviert in Thiamin-Biosynthese und DNA-Reparatur 4,09±0,81 0,01361 1,38 0,44

YLR036C Ähnlichkeit zu YIL089w 2,96±0,53 0,03140 1,94 0,81

YEL023C involv. in Kontrolle der Zellorganisation 2,85±0,22 0,04910 1,5 0,56

YEL005C VAB2 Vac8p bindendes Protein (31 kDa) 2,60±1,11 0,01240 2,27 0,47

YDR265W PEX10 peroxisomales Assemblierungsprotein - Peroxin 2,57±0,31 0,04490 2,54 0,75 YFR030W MET10 Untereinheit der assimilatorischen Sulfit-Reduktase 2,50±0,22 0,01620 2,26 0,88

YOR005C DNL4 ATP-abhängige DNA-Ligase 2,45±0,07 0,03125 2,03 0,59

YHR001W OSH7 Ähnlichkeit zu Kes1p; benachbart zu QCR10 2,39±1,45 0,05366 1,44 0,44

YDR242W AMD2 Amidase 2,21±0,07 0,04695 2,54 0,59

YMR009W schwache Ähnl. zum regulatorischen Protein mmsR aus P.

aeruginosa 2,19±0,73 0,05322 2,17 0,75

YMR114C Ähnlichkeit zu den konservierten Proteinen yoqW und yoaM 2,19±0,28 0,03919 2,06 0,59

YMR104C YPK2 Protein-Kinase 2,15±0,61 0,05141 1,94 0,44

YDR236C FMN1 Riboflavin-Kinase 2,09±0,07 0,04733 1,78 0,66

YGL154C LYS5 Aminoadipat-Semialdehyddehydrogenase, kleine Untereinheit

(α- Aminoadipat-Reduktase) 2,00±0,25 0,05560 1,56 0,69

Tabelle 5.20: Angereicherte ORFs, die sich im Genom am nächsten zu LTR-Abschnitten von re-trotransposalen Elementen befanden, und die ebenfalls in der HDOA-Studie von UPF123⁻-Mutanten [LELIVELTund CULBERTSON1999] eine reproduzierbare Anreicherung aufwiesen. Die Tabelle stellt einen Aus-schnitt von 136 angereicherten ORFs dar, die in Distanzbeziehung zu LTR-Untereinheiten standen.

5.1.9.7 Anreicherung retrotransposabler Elemente, ihrer LTR-Sequenzen und ihnen

Im Dokument Funktionelle Analyse des Hypusin enthaltenden Proteins in Saccharomyces cerevisiae (Seite 139-143)