4.3 Proteinchemische Methoden
4.3.4 IEF, SDS-PAGE und Proteinnachweis in Gelen
4.3.4.1 2D-Gelelektrophorese
Die zweidimensionale Auftrennung von Proteinen in einer Polyacrylamidmatrix, mit einer iso-elektrischen Fokussierung in der ersten Dimension und einer SDS-PAGE in der zweiten Di-mension, erfolgte nach der bei [GÖRGet al. 1988] und [WERNERet al. 1990] beschriebenen Methode.
4.3.4.2 Isoelektrische Fokussierung
Die angewandten Methoden lehnten sich an die Protokolle von [[GÖRGet al. 1988];
[GÖRGet al. 2000]] an. Für die isoelektrische Fokussierung wurden käufliche (ImmobilineTM) und selbst hergestellte Fokussierstreifen (Methode beschrieben bei [WESTERMEIER1990]) ver-wendet. Benutzt wurde eine per Kryostat (Paratherm FT 20B Electronic) auf konstante 15°C gekühlte Fokussiereinheit (2117 MultiphorTM). Dabei wurden je nach Fokussierstreifenlänge (11 bzw. 18 cm; Breite jeweils 3 mm; Geldicke im gequollenen Zustand: 0,5 mm) und Färbe-methode des 2D-Gels unterschiedliche Gesamtproteinmengen pro Fokussierstreifen aufgetra-gen. Die Auftragung erfolgte durch Inkubation des nichthydratisierten Gelstreifens mit dem geklärten Lysat („in gel sample reswelling“, [GÖRGet al. 1988]) in einem speziellen Trogta-blett aus Plexiglas (Werkstätten MPI für Biochemie) über Nacht. Die Streifen wurden dabei
mit Paraffinöl überschichtet und so vor Austrocknung geschützt. Handelte es sich um „analy-tische“ Gele, die für die Silberfärbung vorgesehen waren, wurde eine maximale Proteinmenge von 100 µg (11 cm Streifen) bzw. 200 µg (18 cm Streifen) verwendet. „Präparative“ Gele wur-den durch auf Coomassie-Farbstoffen basierenwur-den Techniken gefärbt. Für sie wurwur-den maximal 500 µg (11 cm Streifen) bzw. 1000 µg (18 cm Streifen) fokussiert. Nach einer Einwanderungs-zeit von 3 h bei 300 V, 0,1-0,4,mA und 0,1-0,2 W wurde das Spannungsgerät (2297 Macrodrive 5TM) ca. alle 2 h um 300 V höher eingestellt. Auf diese Weise wurde sichergestellt, dass ein kon-stanter Stromfluss von >0,1 mA erhalten blieb. Insgesamt wurden 65 kVh im Fokussierbereich von pH 4,5-5,4, 40 kVh im Bereich von pH 4-7 und 30 kVh im Bereich von pH 4-9 verwendet.
Für die letzte Stunde einer Fokussierung wurde die Spannung auf ca. 1/10 des numerischen Wertes erhöht, der jeweils in kVh zu erreichen war, also auf 3000V, 4000V oder 5000V.
4.3.4.3 SDS-PAGE
Für die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen wurden Polyacrylamidgele modifiziert nach [LAEMMLI1970] benutzt. Diese bestanden aus Sammel- und Trenngel bei einer Schicht-dicke von 1 bis 1,5 mm und einer Trennstrecke von wahlweise entweder 20 cm, 12 cm oder 7 cm. Vor einer SDS-PAGE als zweiter Dimension wurden die IEF-Streifen nach der isoelektri-schen Fokussierung gemäß [WERNERet al. 1990] für 2x 10 min umäquilibriert. Für die SDS-PAGE als zweite Dimension fanden große Gele der Dimensionen 12x12 cm (Dicke 1mm) und 20X20 cm (Dicke 1,5 mm) Verwendung. Nach erfolgter Trennung der Proteine bei 100 V im Sammelgel und 200 V im Trenngel wurden die Gele je nach Fragestellung weiter verwendet.
Die Bestimmung des apparenten Molekulargewichts erfolgte mit Hilfe eines käuflichen Prote-instandards (SDS-BMW, Biorad).
4.3.4.4 Coomassie Blue Färbung
Gele wurden gemäß [FAZEKASDESTGROTHet al. 1963] für 60 min in der Fixier-/Färbelösung inkubiert und anschließend durch in Entfärbelösung inkubiert, die mehrmals gewechselt wurde;
vor der weiteren Verwendung wurden die Gele gründlich mit bidest H2O gewässert.
Fixier-/Färbelösung:
Essigsäure 10%
Methanol 50%
Coomassie Brilliant Blue R250
0,1%
Entfärber:
Essigsäure 10%
Auch modifizierte Coomassie-Färbemethoden wurden eingesetzt, welche auf einer kolloi-dalen Verteilung des Farbstoffes Coomassie-Blue-G beruhten (Protokolle RotiBlue-Stain, Fa.
Roth und beschrieben bei [RABILLOUD2000]). Diese Färbungen besitzen im Vergleich zur herkömmlichen Methode eine bis zum Faktor 3 höhere Sensitivität.
4.3.4.5 Silberfärbung
Die Silberfärbung der 2D- Gele erfolgte nach den Methoden von
[HEUKESHOVENund DERNICK1985] bzw. [HOCHSTRASSERet al. 1988]. Auf die zweite Me-thode sei hier genauer eingegangen.
ZEIT LÖSUNG ZU BEACHTEN
5 min H2O
1 h - über Nacht 40% Essigsäure,10% Ethanol
5 min H2O
30 min 1% Glutaraldehyd, 0,5 M Natriumacetat
3x 10 min H2O
2x 30 min 0,05% NDS
4x 15 min H2O
30 min 0,8% Silbernitrat, 1,32% (v/v) Ammoniumhydroxid, 2% (v/v) 1N Natronlauge
Silbernitrat in 30 mL H2O lösen,NH4OH und NaOH in 200 mL lösen, Ag NO3-Lösung langsam dazugeben
4x 4 min H2O
5 - 10 min 0,005% Citronensäure, 0,1% (v/v) Formaldehyd
Zuerst 250 mL Entwickler auf die Gele geben, abgießen und mit restlicher Lösung zu Ende färben Mindestens 20 min 5 mM Tris/HCl, 2% Essigsäure
Bei dieser Färbemethode war es möglich 6 Gele gemeinsam in einem Färbebehälter parallel zu verarbeiten. Das benötigte Volumen für jede Lösung betrug in diesem Fall 1500 mL.
4.3.4.6 Computerunterstützte Auswertung von 2D-Gelen
Die Gele wurden mit dem Scanner SHARP JX-330 und der entsprechenden Software Lab Scan Version,2.01 (Amersham Pharmacia Biotech) mit einer Auflösung von 150 dpi bzw.300 dpi digitalisiert. Für quantitative Analysen wurde der Scanner mittels eines Graukeils (KODAK;
Kalibriertablett mit 21 Absorptionseinheiten von 0,05-3,05) kalibriert. Die Gele wurden mit Hilfe des Programms ProteomeWeaverr (Version 2.0, Fa. Definiens, München) gemäß den Anleitungen des Software-Herstellers ausgewertet.
4.3.4.7 Spaltung der Proteine in der Gelmatrix
Die Proteinspots von Coomassie Blue gefärbten 2D- Gelen wurden exakt mit einem Skalpell ausgeschnitten. Zur Vergrößerung der Oberfläche wurden die Gelbereiche in Würfel mit ca.
1mm Kantenlänge zerlegt. Die Gelstückchen wurden 5 x 15 min im Schüttler mit H2Obi ge-waschen, bis ein pH-Wert von ca. 6 erreicht war; anschließend wurde mit dem Protokoll für den Verdau mit Trypsin bzw. Endoproteinase LysC begonnen. Die Protokolle des Herstellers (Roche, Mannheim) wurden befolgt und unterschieden sich für beide Enzyme kaum.
Lösungen:
Einfach konzentrierter Spaltpuffer: 50 mM Tris/HCl pH 8,5 Doppelt konzentrierter Spaltpuffer: 100 mM Tris/HCl pH 8,5
DTT-Lösung: 10 mM DTT in doppelt konz. Spaltpuffer
Jodacetamid-Lösung: 50 mM Jodacetamid in doppelt konz. Spaltpuffer 10% Ameisensäure
100% Acetonitril
Es wurden bei jedem Schritt ca. 20 µL Lösung verwendet, gerade soviel, dass die Gelstückchen bedeckt waren. Die Überstände der nachfolgenden Schritte wurden jeweils abpipettiert und verworfen; zwischen den einzelnen Schritten wurde gevortext.
Protokoll für die tryptische Spaltung:
ZEIT LÖSUNG ZU BEACHTEN
Kurz Mit Acetonitril waschen 1 min In Acetonitril inkubieren 5 min In doppeltem Spaltpuffer
inkubieren
1 min In Acetonitril inkubieren 5 min In doppeltem Spaltpuffer
inkubieren
1 min In Acetonitril inkubieren Kurz Mit Acetonitril waschen 30 min
bei 60°C
In DTT-Lösung inkubieren 10 µL Lösung mehr verwenden
1 min In Acetonitril inkubieren 1 min In Acetonitril inkubieren
15 min In Jodacetamid-Lösung inkubieren Kurz Mit Acetonitril waschen
5 min In doppeltem Spaltpuffer inkubieren
1 min In Acetonitril inkubieren 5 min In doppeltem Spaltpuffer
inkubieren
1 min In Acetonitril inkubieren 1 min In Acetonitril inkubieren 10 min
bei 37°C
Ohne Lösung inkubieren bis keine Lösung mehr sichtbar ist
4 h - über Nacht bei 37°C:
In einfachem Spaltpuffer mit Trypsin inkubieren
Verhältnis 1:10 (Enzym:
Proteinmenge)
Trypsin (25 µg) wurde gelöst in 100 µL 1 mM HCl.
4.3.4.8 Elution der Spaltpeptide
Nach der Spaltung wurde mit der Elution begonnen. Es wurden wiederum 20 µL Lösung für die einzelnen Schritte verwendet. Zwischen jedem Schritt wurde gevortext, alle weiteren Über-stände wurden gesammelt und zu einem Peptidgemisch („Spaltmix“) vereinigt.
ZEIT LÖSUNG
5 min In Acetonitril inkubieren 10 min In Acetonitril inkubieren
10 min In 10%-iger Ameisensäure inkubieren 5 min In Acetonitril inkubieren
10 min In 10%-iger Ameisensäure inkubieren 5 min In Acetonitril inkubieren
4.3.4.9 MALDI-Massenspektrometrie
Die durch den Verdau mit Endoproteinasen generierten Peptide wurden in einem ersten Ana-lyseansatz mit verschiedenen Massenspektrometern gemäß der Methode des MALDI-MS-Fingerprintings gemessen. Anwendung fand ein Bruker Reflex III Massen-spektrometer, das mit einem 337 nm Stickstofflaser augerüstet war sowie das MALDI-TOF-TOF-System Proteomics Analyser 4700 (Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt). Mit letzterem wurden auch Tochterionen-MS-Spektren zur Erhaltung von Peptidsequenzinformation angefer-tigt.
Die Standardprozedur am Bruker Reflex III:
1 µL der eluierten Peptidmischung wurde auf das Probenziel aufgetragen; nach Trocknen bei Raumtemperatur wurde die Probe mit 1 µL der Matrixlösung (5 mgα-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) gelöst in 1 ml Acetonitril/Wasser/TFA; 50:50:0,1; v/v/v) überschichtet und nochmals bei Raum-temperatur getrocknet. Die Ausführung der Massen-Analyse erfolgte im positiven Reflektormo-dus bei eingeschalteter „Delayed-Extraktion“ mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, einer Reflektorspannung von 22,8 kV und der Deflektion von Massen kleiner als 500 Da. Für die Aufnahme der Spektren wurden die Signale aus 100-150 Laserimpulsen aufsummiert. Zur Datenbanksuche nach dem Fingerprint-Verfahren wurde das Programm „Profound“ von Prowl und der Algorithmus „PepIdent“ (bei http://www.expasy.ch) verwendet.
4.3.4.10 Elektrospraymassenspektrometrie (ESI-MS)
Ungespaltene Proteineinheiten wie z.B. die affinitätschromatographisch gereinigten N-terminalen Hyp2p-Fusionsproteine (ca. 43 kDa) sowie das aus ihnen durch Thrombin-Spaltung gewonne-ne Hyp2p und von ihm abgeleitete Proteinformen (ca. 18 kDa) wurden für eigewonne-ne Massenbestim-mung mit einem Quadropol-Instrument (API 3000TM, Sciex-AppliedBiosystems) untersucht.
Dazu wurde eine normale ESI-Quelle bei Anlegen der üblichen Flussraten benutzt. Nach Ei-chung der m/z-Skala über Ammonium-Adduktionen von Polyethylenglykol erfolgte die compu-tergestützte Berechnung des Molekulargewichts aus den m/z-Maxima der Ladungsverteilungs-profile mehrfach geladener Ionen nach [COVEYet al. 1988] und [MANNet al. 1989].
Das Gerät konnte optional mit einer Nano-ESI-Quelle ausgestattet werden, was die Untersu-chung von Peptiden und Proteinen auch im Nano-Mol-Bereich (bis oberer Femto-Mol-Bereich) ermöglichte. Gleichzeitig konnte durch die mit Stickstoff beschickbare Kollisionszelle Peptid-sequenzinformation durch Aufnahme von Tochterionenspektren gewonnen werden.
4.3.4.11 Hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Für die Auftrennung des Peptidgemisches wurde eine Mikro-HPLC eingesetzt. Die eluierenden Peptide wurden manuell gesammelt.
Vorsäule: OPTI-GUARD, C8, 1 mm (Wicom)
Trennsäule: MicroCARTr150-l, RP 18, Purospher 5 µm endcapped, 1mm (Merck) Mobile Phase: Solvent A: 0,1% v/v TFA in H2Odd Solvent B: 0,0,8 % v/v TFA in
Acetonitril
Gradient: Säule war mindestens 30 min mit 5% B äquilibriert Zeit Solvent A Solvent B
[min] [%] [%]
0 95 5
60 60 40
85 40 60
90 30 70
95 95 5
Flußrate: 60 µL/min
Detektion: 206 nm und 280 nm an Monitor und Schreiber (KIPP und ZONEN BD40)
Injektion: 95 µL (Probe wurde in H2Odd mit 5 % v/v Ameisensäure gelöst)