3. Material und Methoden
3.5. Bearbeitung des Probenmaterials
3.5.1. Genomnachweis von PCV 2 mit Hilfe der PCR
3.5.1.3. Polymerase-Kettenreaktion
Mastermix:
Substanz µl
10 fach Taq Puffer 5
MgCl 2 5
DNTP Mix 25mM 0,5 Primer PCV 75 10pm/µl 1 Primer PCV 1073 10pmol/µl 1 Taq Polymerase 5u/µl 0,5
Wasser 32
Gesamtvolumen 45
Verwendete Primer:
Primer Sequenz 5´ - 3´
PCV75 GGG TGT TCA CGC TGA ATA ATC CTT CGG
PCV1073 CCA GGA CTA CAA TAT CCG TGT AAC C
Dieser Reaktionsansatz von 45 µl wurde in ein 0,2 ml-safe-locked Eppendorf-Gefäß überführt und 5 µl Template-DNA hinzugefügt.
3.5.1.3. Polymerase-Kettenreaktion
Der Reaktionsansatz aus Mastermix und Template wurde zusammen mit den positiven und negativen Kontrollen in den Thermocycler GeneAmp PCR System 9700 der Firma PE Applied Biosystems ( Norwalk, USA ) verbracht.
Der Thermocycler wurde wie folgt programmiert:
Denaturierung 94°C, 20 sec Annealing 62°C, 20 sec Extension 72°C, 45 sec Extensionsschritt nach dem
letzten Zyklus 72°C, 7 min Zykluszahl (Gewebe) 30
Zykluszahl (Nasentupfer) 40
3.5.1.4. Gelelektrophorese
Für die Gelelektrophorese wurde ein 1% iges Agarosegel verwandt. Hierzu wurde 1 g Macro Abgarose (Advanced Biotechnologies Ltd., Surrey, UK) in 80 ml LiChrosolv® Wasser für Chromatographie (Merck, Darmstadt) und 20 ml Tris-Borat-EDTA-Puffer (Merck, Darmstadt) bei 70°C unter Rühren in einem Erlenmeyerkolben aufgelöst.
Der flüssige Agar wurde dann auf ca. 60°C abgekühlt, 5µl Ethidiumbromidlösung (1mg/ml) (Merck, Darmstadt) hinzugefügt und die Gellösung anschließend blasenfrei in einen zuvor mit Klebeband abgedichteten Gelträger (Biotech Fischer, Giessen) ausgegossen. Anschließend wurde ein Kamm eingesetzt und das Gel ausgehärtet.
Nach Erstarren des Geles wurde es mit den Taschen zur Kathode gerichtet in die Elektrophorese-Kammer (Biotech Fischer, Giessen) überführt, Kamm und Klebeband entfernt, und die Kammer wurde mit einem 1:5 verdünnten TBE-Puffer (Merck, Darmstadt) gefüllt, bis die Oberfläche des Geles bedeckt war.
5 µl des zuvor kurz zentrifugierten PCR-Amplifikats wurden dann pro Probe zusammen mit 10 µl Glycerol-Gelladepuffer (Tabelle 3) in einer Mikrotiterplatte gemischt und 5 µl dieses Gemisches in Geltaschen pipettiert. Pro Gel waren 20 Geltaschen vorhanden, die mit bis zu 16 Proben, einer Positivkontrolle, den 2 Negativkontrollen und einem DNA-Leiter (DNA Molecular Weight Marker No. 6; 0,15-2,1 kbp/ Boehringer, Mannheim) befüllt wurden.
Anschließend wurde die Kammer geschlossen und eine Spannung von 99 V für eine Laufzeit von 90 Minuten angelegt.
Tabelle 3 : Glycerol-Gelladepuffer:
5,0 ml Glycerin wasserfrei (Merck, Darmstadt)
0,025g Bromphenolblau-Natriumsalz (Merck, Darmstadt) ad 10 ml Aqua bidest.
3.5.1.5. Photodokumentation
Die Auswertung der Gele erfolgte mit dem System Alpha-Imager 1220 (Biozym, Hess.
Oldendorf). Unter UV-Licht-Anregung mittels Transilluminator (312 nm Wellenlänge) wurde das Gel bei einer Sekunde Belichtungszeit mit einer digitalen Kamera photographiert. Dieses Bild wurde anschließend mittels Thermodrucker ausgedruckt und als Datei auf dem Computer gespeichert. Beispielhaft wird solch ein Ausdruck im Ergebnisteil in Abbildung 13 dargestellt.
3.5.2. Amplifikatsequenzierung
Zur Überprüfung der hier angewandten PCV2 – PCR wurde eine zyklische Sequenzierung eines Amplifikats aus dem PCV2–positiven Untersuchungsmaterial durch die Firma BIOZYM ( Hessisch – Oldendorf ) durchgeführt.
Hierbei wird die Didesoxy – Methode nach SANGER ( 1992 ) mit dem zyklischen Ablauf einer PCR verbunden. Diese Methode ermöglicht die Sequenzierung geringer Template – Mengen und die Durchführbarkeit der Reaktion bei hohen Temperaturen. Letztere erleichtert die Sequenzierung sekundärstrukturreicher Matrizen.
Mittels des verwandten „Thermo Sequenase Cy5,5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit“
der Firma VISIBLE GENETICS INC. ( Toronto, Kanada ), der mit dem Farbstoff Cy5,5 Dye markierte Nukleotide und das Enzym Thermo – Sequenase beinhaltet, wurden über die PCR markierte Amplifikatfragmente produziert. Durch den Abgleich dieser farbmarkierten Fragmente konnte die Basenabfolge entschlüsselt werden.
3.5.2. Histologie
Auswahl des Materials:
Bei den neugeborenen und drei Wochen alten Ferkeln beider Gruppen wurden aufgrund fehlender pathomorphologischer Veränderungen nur jeweils 5 Tiere pro Gruppe und Altersstufe zufällig ausgewählt, lediglich die beiden neugeborenen Ferkel mit PCV2 – Nachweis aus Gruppe 1 wurden gezielt mit in die Untersuchungen einbezogen. Von diesen 20 Ferkeln wurden pathohistologische Schnitte von Leber, Milz und inguinalem Lymphknoten angefertigt.
Bei den als verendet oder moribund zur Sektion eingegangenen Tieren sowie bei den Kontrolltieren beider Gruppen wurde ein pathohistologisches Screening von Lunge, Leber, Milz, Niere, Tonsille und inguinalem Lymphknoten vorgenommen, bei Tieren mit dem Verdacht auf PDNS wurde zusätzlich die Haut mit in die Untersuchung mit einbezogen.
Aus dem Sektionsmaterial vom Schlachthof wurden Schnitte der bronchialen Lymphknoten angefertigt. Hierbei wurden aus beiden Gruppen von Tieren eines frühen Schlachttermins jeweils 5 Tiere ausgesucht, die sowohl im PCV2 – Genomnachweis wie auch serologisch negativ bzw. positiv waren. Ebenso wurden aus beiden Gruppen von Tieren des letzten Schlachttermins jeweils 5 Tiere ausgewählt die im PCV2-Genomnachweis positiv bzw.
negativ waren ( eine Serologie lag hier nicht vor ). Bei den positiven Tieren wurden, wenn möglich, Tiere ausgewählt, die zusätzlich Lungenveränderungen zeigten.
Anfertigen und Auswerten der Schnitte:
Aus dem Sektionsmaterial, das mindestens für 8 Wochen in Formalin fixiert wurde, wurden ca 3-4 mm dicke Organstücke passender Größe geschnitten, in vorher beschriftete Kapseln gebettet, eingedeckelt und anschließend wieder in Formalin fixiert.
Die Vorbereitung der Schnitte erfolgte in den automatischen Gewebeentwässerungs- und –einbettsystem TECHNO-TECH 1 ( Pathotec, Schmalkalden ). Hier wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe ( 2x45 min in 80 % igem Alkohol, 2x45 min in 90 % igem Alkohol, 1x45 min in 99 % igem Alkohol) entwässert, der Alkohol wurde dann durch ein Intermedium verdrängt ( 2x90 min in Xylol), im letzten Schritt wurden die Schnitte 2 mal für 2 Stunden paraffinisiert.
Anschließend fand das Gießen der Blöcke an der Ausgießstation PRO EMCI ( Pathotec, Schmalkalden ) statt. Die auf ca. 60 °C vorgewärmten Schnitte wurden der Kapsel entnommen und mit einer vorgewärmten Pinzette in ein zuvor mit 62°C heißem Paraffin
befüllten Metallförmchen positioniert. Dabei muß die Schnittfläche plan am Boden liegen.
Auf einer -2°C kalten Platte wurden die Blöcke dann ausgekühlt und nach dem Erstarren den Metallförmchen entnommen. Die Anfertigung der Schnitte fand an dem Rotationsmicrotom HM 340E ( Microm, Walldorf ) statt. Die Paraffinblöcke wurden zunächst für 15 min auf einer –12°C kalten Platte durchgekühlt und dann in das Microtom eingespannt. Zügig, um eine zu starke Erwärmung zu verhindern, wurden die Blöcke kurz vorgetrimmt, bis eine geeignete Schnittfläche vorhanden war. Je nach Größe des Blockes wurden 2 – 4 Schnitte mit einer Dicke von ca 3 µ erstellt, die sofort in ein ca. 40°C warmes Wasserbad überführt wurden. Von dort wurden sie auf einen zuvor beschrifteten Objektträger gezogen, der dann in ein Trockengestell einsortiert und anschließend für 15 min in einem auf 70°C erhitzten Wärmeschrank zur Entparaffinisierung und Trocknung gestellt wurde. Nach mindestens einer weiteren Stunde Trocknung bei Zimmertemperatur wurden die Präparate in dem vollautomatischen Färbeautomat Robot Stainer HMS760 ( Microm, Walldorf ) mit Haematoxylin – Eosin gefärbt (einzelne Arbeitsschritte siehe Tabelle 4 ) und zum Schluß in dem Eindeckelautomat Cover Tech CT5 ( Microm, Walldorf ) mit einem Deckgläschen versehen. Die fertigen histologischen Präparate wurden unter dem Lichtmikroskop begutachtet und ausgewertet, die Ergebnisse wurden protokolliert.
Tabelle 4 : HE –Färbung mit dem Robot Stainer HMS760 ( Microm, Walldorf ) Arbeitschritte: 1. Xylol
Einordnung der pathohistologischen Befunde
Anhand der pathohistologischen Befunde wurden die zur Sektion gekommenen Tiere beider Gruppen in zwei Kategorien eingeteilt.
1. Tiere, die pathohistologische Veränderungen zeigen, die mit einer PCV2-Infektion assoziiert werden ( PMWS, PDNS, PNP).
2. Tiere, die solche Veränderungen nicht zeigen.
Als Leitsymptome für eine Einordnung in Kategorie 1 galten hierbei:
Lymphozytäre Depletion, multinukleäre Riesenzellen oder vermehrte Anzahl histiozytärer Zellen in den lymphatischen Geweben Lymphknoten, Tonsille und Milz; interstitielle Nephritis oder Glomerulonephritis; Hepatitis sowie interstitielle Pneumonie und PNP.
Das Ausmaß dieser Veränderungen wurde mit geringgradig ( = 1 = 1 Punkt), mittelgradig ( = 2 = 2 Punkte ) oder hochgradig ( = 3 = 3 Punkte ) bewertet.
Durch Addieren dieser vergebenen Punkte wurde für jedes Tier ein Score gebildet ( siehe Tabellen 10 und 12 ).Um eventuelle Zufallsbefunde auszugrenzen wurden nicht nur Tiere mit einem Score von 0 in Kategorie 2 eingeordnet, sondern auch Tiere mit einem Score von 1.
Tiere mit höheren Werten wurden der Kategorie 1 zugeordnet.
3.5.3 Serologie
Ausgewähltes Material
Eine PCV2 – Serologie wurde durchgeführt bei:
- Neugeborene Ferkel aus Gruppe 1 (n=20) und Gruppe 2 (n=16), sowie 15 Muttersauen - 3 Wochen alte Ferkel aus Gruppe 1 (n=20) und Gruppe 2 (n=20)
- Klinisch gesunde Tiere (Gruppe 1: n=20, Gruppe 2: n=12 ) und kranke Tiere (Gruppe 1:
n=22, Gruppe 2: n=12) der 12. Lebenswoche
- Klinisch gesunde Tiere (Gruppe 1: n=20, Gruppe 2: n=10) und kranke Tiere (Gruppe 1:
n=20, Gruppe 2: n=5) der 16. Lebenswoche
- Schlachtschweine aus Gruppe 1 (n=32) und Gruppe 2 (n=23) Eine PPV – Serologie wurde durchgeführt bei:
- Klinisch gesunde Tiere (Gruppe 1: n=20, Gruppe 2: n=12 ) und kranke Tiere (Gruppe 1:
n=22, Gruppe 2: n=12) der 12. Lebenswoche
- Klinisch gesunde Tiere (Gruppe 1: n=20, Gruppe 2: n=10) und kranke Tiere (Gruppe 1:
n=20, Gruppe 2: n=5) der 16. Lebenswoche
- Schlachtschweine aus Gruppe 1 (n=32) und Gruppe 2 (n=23)
Eine PRRSV – Serologie wurde durchgeführt bei:
- Klinisch gesunde Tiere (Gruppe 1: n=20, Gruppe 2: n=12 ) und kranke Tiere (Gruppe 1:
n=22, Gruppe 2: n=12) der 12. Lebenswoche
- Klinisch gesunde Tiere (Gruppe 1: n=20, Gruppe 2: n=10) und kranke Tiere (Gruppe 1:
n=20, Gruppe 2: n=5) der 16. Lebenswoche
- Schlachtschweine aus Gruppe 1 (n=32) und Gruppe 2 (n=23)
Nachweismethoden:
Die PPV- und PRRSV – Serologie wurde vom Institut für Innovative Veterinärdiagnostik ( IVD ) der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.