Aus der Aussenstelle für Epidemiologie in Bakum
und der Klinik für kleine Klauentiere und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Epidemiologie, klinische Erscheinungsformen, Pathomorphologie und Diagnostik der porzinen Circovirusinfektion
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Jens Tschachtschal
aus Hofgeismar
Hannover 2000
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. M. Wendt
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. M. Wendt
2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. rer. nat. I. Greiser de Wilke
Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2000
Gefördert durch den Interessenverband der Schweinehalter Nordwestdeutschlands
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Einleitung 10
2. Schrifttum 11
2.1. Geschichte des porzinen Circovirus (PCV) 11
2.2. Taxonomische Einordnung, Struktur und Eigenschaften
des porzinen Circovirus 12
2.3. Die ätiologische Bedeutung von PCV2 15
2.3.1. Die ätiologische Bedeutung von PCV2 für das Krankheitsbild PMWS 15 2.3.2. Die mögliche ätiologische Bedeutung von PCV2
für andere Krankheitsbilder 20
2.4. Epidemiologie 21
2.5. Pathogenese 24
2.6. Krankheitsbilder 27
2.6.1. Postweaning multisystemic wasting syndrome ( PMWS ) 27
2.6.1.1. Klinik 27
2.6.1.2. Pathomorphologie 28
2.6.2. Weitere Krankheitsbilder, die mit einer PCV2 – Infektion
assoziiert werden 30
2.6.2.1. Porzines Dermatitis-Nephropathie-Syndrom 30 2.6.2.2. Proliferativ-nekrotisierende Pneumonie 31
2.6.2.3. Infektiöser kongenitaler Tremor 32
2.7. Diagnostische Verfahren 33
2.7.1. Genomnachweis 33
2.7.1.1. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) 33
2.7.1.2. In situ Hybridisierung ( ISH ) 35
2.7.2. Immunhistochemie 36
2.7.3. Immunzytochemie 36
2.7.4. Nachweis von Antikörpern 37
3. Material und Methoden 38
3.1. Herkunft und Haltung der Tiere 38
3.2. Untersuchungen im Bestand 40
3.3. Sektion und Asservation der entnommenen Proben 44
3.4. Untersuchungen auf dem Schlachthof 44
3.5. Bearbeitung des Probenmaterials 46
3.5.1. Genomnachweis von PCV2 mit Hilfe der PCR 46
3.5.1.1. DNA – Isolierung 46
3.5.1.2. Herstellung des Master – Mixes 49
3.5.1.3. Polymerase – Kettenreaktion 49
3.5.1.4. Gelelektrophorese 50
3.5.1.5. Photodokumentation 51
3.5.2. Amplifikatsequenzierung 51
3.5.3. Histologie 52
3.5.4. Serologie 54
3.5.4.1. PPV – Serologie 55
3.5.4.2. PRRSV – Serologie 55
3.5.4.3. PCV2 – Serologie 56
3.5.5. Bakteriologische Untersuchungen 56
3.6. Erfassung betrieblicher Leistungsdaten 57
3.7. Statistische Auswertung der erhobenen Daten 57
4. Ergebnisse 58
4.1. Klinische Beobachtungen 58
4.1.1. Klinische Beobachtungen bei Gruppe 1 58
4.1.2. Klinische Beobachtungen bei Gruppe 2 60
4.2. Pathologisch – anatomische Befunde 65
4.2.1. Pathologisch – anatomische Befunde bei Gruppe 1 65 4.2.2. Pathologisch – anatomische Befunde bei Gruppe 2 68
4.3. Pathohistologische Befunde 77
4.3.1. Pathohistologische Befunde bei Gruppe 1 77 4.3.2. Pathohistologische Befunde bei Gruppe 2 83 4.4. Ergebnisse des PCV2 – Genomnachweises über die PCR 94
4.4.1. Ergebnisse der Sequenzierung 94
4.4.2. Ergebnisse des PCV2 – Genomnachweises bei Gruppe 1 96 4.4.3. Ergebnisse des PCV2 – Genomnachweises bei Gruppe 2 100 4.4.4. Vergleich des PCV2 – Genomnachweises aus Organen und
Nasentupfern 103
4.5. Ergebnisse der Serologie 104
4.5.1. Ergebnisse der PRRSV – Serologie 104
4.5.2. Ergebnisse der PPV – Serologie 104
4.5.3. Ergebnisse der PCV2 – Serologie 104
4.6. Auswertung betrieblicher Leistungsdaten 109
4.6.1. Auswertung bei Gruppe 1 109
4.6.2. Auswertung bei Gruppe 2 109
5. Diskussion 110
5.1. PCV2 – Genomnachweis über die PCR 110
5.2. Klinische Beobachtungen 113
5.3. Pathomorphologische Befunde 115
5.4. Serologische Ergebnisse 120
5.5. Bakteriologische Ergebnisse 124
5.6. Leistungsdaten 125
5.7. Ausblick 126
6. Zusammenfassung 127
7. Summary 129
8. Literaturverzeichnis 131
Abkürzungen
Arc. pyogenes Arcanobacterium pyogenes
AK – Virus Virus der Aujeszkyschen Krankheit
bp Basenpaare
Bord. bronchiseptica Bordetella bronchiseptica
CAV Chicken Anemia Virus
CsCl Cäsiumchlorid E. coli Escherichia coli
ELISA enzyme linked immunosorbent assay
IIF indirekter Immunfluoreszenztest
IFA immunfluoreszence assay
IPMA immunoperoxidase – monolayer assay
IIPT indirekter Immunoperoxidasetest
ISH in-situ-Hybridisierung Häm. parasuis Hämophilus parasuis
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex n. typ. nicht typisiert
ORF open reading frame (offener Leserahmen) Past. multocida Pasteurella multocida
PCR polymerase chain reaction
PCV Porzines Circovirus
PCV1 Porzines Circovirus Typ 1 PCV2 Porzines Circovirus Typ 2
PBFD Psttacine beak and feather disease PBS phosphate buffered saline
PDNS Porzines Dermatitis – Nephropathie Syndrom
p.i. post infectionem
PK 15 „porcine kidney“, Schweinenierenzelllinie PMWS Postweaning multisystemic wasting syndrome PNP Proliferative und nekrotisierende Pneumonie
PPV Porzines Parvovirus
PRCV Porzines respiratorisches Coronavirus
PRRSV Virus des porzinen respiratorischen und reproduktiven Syndroms SIV Schweineinfluenza-Virus
Strept. suis Streptococcus suis
TBE Tris-Borat-EDTA TGEV Virus der transmissiblen Gastroenteritis
1. Einleitung
Die Infektion mit porzinem Circovirus ist in jüngster Zeit Gegenstand zahlreicher Untersuchungen geworden.
Erste Berichte über ein neues Krankheitsbild, genannt „Postweaning multisystemic wasting syndrome“ (PMWS), beobachtet 1991 in einem Schweinebestand in Saskatchewan (Kanada), datieren von 1996 (HARDING et al. 1996).
Wenngleich die klinische Symptomatik betroffener Schweine relativ unspezifisch war, so konnte man bei diesen Tieren jedoch typische pathomorphologische, insbesondere pathohistologische Veränderungen beobachten.
Als mögliches ätiologisches Agens für dieses Krankheitsbild wurde ein Virus beschrieben, daß zwar schon seit Jahren bekannt ist, aber bisher als apathogen erachtet wurde : das porzine Circovirus (PCV) (CLARK 1997).
In der folgenden Zeit mehrten sich Berichte über Ausbrüche von PMWS auch aus vielen europäischen Ländern, so zum Beispiel Spanien (SEGALES et al. 1997), Frankreich (LE CANN et al. 1997) und Nordirland (KENNEDY et al. 1998).
Untersuchungen von ALLAN et al. (1998) ergaben Unterschiede zwischen PCV-Isolaten, die bei Tieren mit PMWS gefunden werden konnten und dem bereits seit Jahren als Kontaminante einer PK-15-Zellinie bekannten PCV. Die Subtypen 1 und 2 des porzinen Circovirus werden seitdem unterschieden.
Im Herbst 1998 wurde porzines Circovirus Typ 2 im Zusammenhang mit PMWS in Deutschland erstmals im Kreis Nienburg nachgewiesen (HINRICHS et al. 1999a).
Die Ergebnisse der hier beschriebenen Feldstudie, durchgeführt in einem schweinehaltenden Betrieb im Kreis Vechta, in dem seit Herbst 1998 PCV2 nachgewiesen ist, sollen dazu dienen, offene Fragen im Bereich von Ätiologie, Epidemiologie, Klinik , Pathomorphologie und Diagnostik der porzinen Circovirusinfektion zu klären.
2. Schrifttum
2.1. Geschichte des Porzinen Circovirus
Das porzine Circovirus wurde 1974 von der Berliner Virologin TISCHER als Kontaminante einer stabilen PK-15 Zelllinie ( abgeleitet aus Schweinenieren ) entdeckt (TISCHER et al.
1974).
Bereits kurze Zeit später wurde dieser Entdeckung keinerlei besondere Bedeutung mehr beigemessen, da in serologischen Feldstudien in Ost- und Norddeutschland Seroprävalenzen von über 85% bei Schlachtschweinen festgestellt werden konnten, diese aber mit keinerlei klinischer oder pathomorphologischer Symptomatik verbunden waren. Auch bei Wildschweinen in Ostdeutschland konnten Antikörper gegen PCV nachgewiesen werden (TISCHER et al. 1986 ).
Bei der experimentellen Infektion von 9 Monate alten Schweinen konnte PCV zwischen dem 3. und 6. Tag p.i. aus Nasentupfern und zwischen dem 13. und 16. Tag p.i. aus Kotproben auf Zellkulturen angezüchtet werden. Weiterhin konnten ab der 1. Woche p.i. rapide steigende Antikörpertiter beobachtet werden. Klinisch zeigten diese Tiere jedoch keine Symptomatik, und nach ihrer Tötung wurden weder pathomorphologische Veränderungen beobachtet, noch konnte man PCV aus Organen reisolieren. Auch bei Infektionsversuchen an neugeborenen Ferkeln beobachtete man lediglich steigende Antikörpertiter, aber keinerlei Klinik oder pathomorphologische Veränderungen (TISCHER et al. 1986).
Zusammenfassend wurde daraus geschlossen, daß es sich bei dem porzinen Circovirus um ein zwar in der deutschen Schweinepopulation weit verbreitetes, aber apathogenes Virus handelt (TISCHER et al. 1986).
Nach dem Auftreten des erstmals 1991 in Südkanada beobachteten „postweaning multisystemic wasting syndromes“ (HARDING 1996) wurde die Rolle des porzinen Circovirus 1997 als mögliches Pathogen erneut untersucht, als es CLARK (1997) gelang, PCV-Antigen in Geweben von an PMWS erkrankten Tieren nachzuweisen. Dabei schien es sich hierbei um eine neue Variante des bereits bekannten PCV zu handeln, denn während die Feldisolate von an PMWS erkrankten Schweinen aus Kanada, den USA und Frankreich eine 96% ige Nucleotidsequenzhomologie zeigen, bestand zu dem aus der PK-15 Zelllinie isolierten PCV nur eine Nucleotidsequenzhomologie von weniger als 80% (HAMEL et al.
1998; MEEHAN et al. 1998; MOROZOV et al. 1998).
Fortan wurde zwischen dem als Kontaminante der PK-15 Zelllinie bekannten und nun als PCV1 bezeichneten porzinen Circovirus und dem bei Schweinen mit PMWS isolierten und nun als PCV2 bezeichneten porzinen Circovirus unterschieden.
2.2. Taxonomische Einordnung, Struktur und Eingenschaften des porzinen Circovirus
Nach seiner Entdeckung 1974 wurde das PCV korrekt als einzelsträngiges, unbehülltes DNS- Virus mit einer Länge von 1,76 kb klassifiziert, das zirkulär und an den Enden kovalent gebunden ist (TISCHER et al. 1982; BUHK et al. 1985; MEEHAN et al. 1997). Es ist mit einem Durchmesser von 17 nm sehr klein, unbehüllt und besitzt ein ikosahedrales Nulkleokapsid (TISCHER et al. 1987).
Die Dichte im CsCl-Gradienten beträgt 1,33-1,34. Es wird durch saure Umgebung (pH=3), Chloroform oder hohe Temperaturen (56°C und 70°C) nicht inaktiviert (ALLAN et al.
1994b). Durch Behandlung infizierter Zelllinien mit D-Glucosamin konnte die Zahl der PCV- Antigen enthaltender Zellen erheblich gesteigert werden (TISCHER et al. 1987).
Heute gehört das porzine Circovirus zu der Familie der Circoviridae (LUKERT et al. 1995), zusammen mit verschiedenen Circoviren, die bei Vögeln und Pflanzen vorkommen.
Taxonomie der Familie Circoviridae ( LUKERT et al. 1995 )
Genus Circovirus
Psittacine Beak and Feather Disease Virus (PBFDV) Chicken Anemia Virus (CAV)
Porcine Circovirus (PCV)
Nicht eingeordnete Viren der Familie Banana Bunchy Top Virus (BBTV) Coconut Foliar Decay Virus (CFDV) Subterranean Clover Stunt Virus (SCSV)
Die Ultrastruktur von PCV wurde von STEVENSON et al. (1999) anhand der permanent infizierten PK-15 Zelllinie untersucht. Hierbei stellten sie neben einer großen Anzahl von intrazytoplasmatischen Einschlüssen, die vorwiegend im perinukleären Raum zu finden waren, in einzelnen Zellen auch intranukleäre Einschlüsse fest. STEVENSON et al. (1999)
unterschieden bei diesen Einschlüssen, die rund bis oval und elektronendicht waren, zwischen zwei Typen. Der erste Typ war klein (0,1-0.5 µm) und nicht von einer trilaminaren Membran umhüllt. Einige enthielten im Durchmesser 10-14 nm große lockere Aggregate von ikosahedralen Nukleokapsiden oder kaum geformte parakristalline Bereiche. Die Einschlüsse des zweiten Types waren größer (0,5-5 µm ) und zahlreicher. Sie waren deutlich abgegrenzt und umrandet von einer trilaminaren Membran. Ihre Elektronendichte war größer als die der kleinen Einschlüsse und sie enthielten unterschiedliche Mengen an Virionenaggregaten. Die Virionen formierten sich gewöhnlich zu parakristallinen Bereichen, manchmal jedoch nur zu losen Aggregaten. Intranukleäre Einschlüsse waren nicht Membran gebunden und oft assoziiert mit kleinen Nukleoli und Aggregaten von Heterochromatin (STEVENSON et al.
1999).
Das Genom von PCV2 ist mit einer Größe von 1768 Nucleotiden um 9 Nucleotide länger als das von PCV1 (HAMEL et al. 1998; MOROZOV et al. 1998). Die Genomsequenz nach HAMEL et al. (1998) ist in Abbildung 1 zu sehen. Laut MOROZOV et al. (1998) beträgt die Nucleotidsequenzhomologie zwischen PCV1 und PCV2 76%, auch MEEHAN et al. (1998) bestätigen, dass sie unter 80% liegt. Etwas abweichend davon berichten HAMEL et al. (1998) von einer Nucleotidsequenzhomologie von 69 %, wobei die erste Hälfte des Genoms zu 82%
übereinstimmt, die zweite Hälfte zu 62% (HAMEL et al. 1998). Bei Feldisolaten von Tieren mit PMWS lag die Nucleotidsequenzhomologie dagegen bei 96% (MOROZOV et al . 1998), was auf eine weitgehende Identität innerhalb der Variante PCV2 hinweist.
Abbildung 1: PCV2 – Genomsequenz nach HAMEL et al. (1998)
Die unterstrichenen Bereiche sind die Ansatzstellen der in dieser Arbeit verwandten PCV2 - spezifischen Primer PCV 75 und PCV 1073 (MOROZOV et al. 1998)
1 ACCAGCGCAC TTCGGCAGCG GCAGCACCTC GGCAGCACCT CAGCAGCAAC ATGCCCAGCA 61 AGAAGAATGG AAGAAGCGGA CCCCAACCAC ATAAAAGGTG GGTGTTCACG CTGAATAATC 121 CTTCCGAAGA CGAGCGCAAG AAAATACGGG AGCTCCCAAT CTCCCTATTT GATTATTTTA 181 TTGTTGGCGA GGAGGGTAAT GAGGAAGGAC GAACACCTCA CCTCCAGGGG TTCGCTAATT 241 TTGTGAAGAA GCAAACTTTT AATAAAGTGA AGTGGTATTT GGGTGCCCGC TGCTACATCG 301 AGAAAGCCAA AGGAACTGAT CAGCAGAATA AAGAATATTG CAGTAAGGAA GGCAACTTAC 361 TTATTGAATG TGGAGCTCCT CGATCTCAAG GACAACGGAG TGACCTGTCT ACTGCTGTGA 421 GTACCTTGTT GGAGAGCGGG AGTCTGGTGA CCGTTGCAGA GCAGCACCCT GTAACGTTTG 481 TCAGAAATTT CCGCGGGCTG GCTGAACTTT TGAAAGTGAG CGGGAAAATG CAGAAGCGTG 541 ATTGGAAGAC CAATGTACAC GTCATTGTGG GGCCACCTGG GTGTGGTAAA AGCAAATGGG 601 CTGCTAATTT TGCAGACCCG GAAACCACAT ACTGGAAACC ACCTAGAAAC AAGTGGTGGG 661 ATGGTTACCA TGGTGAAGAA GTGGTTGTTA TTGATGACTT TTATGGCTGG CTGCCGTGGG 721 ATGATCTACT GAGACTGTGT GATCGATATC CATTGACTGT AGAGACTAAA GGTGGAACTG 781 TACCTTTTTA GGCCCGCAGT ATTCTGATTA CCAGCAATCA GACCCCGTTG GAATGGTACT 901 GGAAGAATGC TACAGAACAA TCCACGGAGG AAGGGGGCCA GTTCGTCACC CTTTCCCCCC 961 CATGCCCTGA ATTTCCATAT GAAATAAATT ACTGAGTCTT TTTTATCACT TCGTAATGGT 1021 TTTTATTTTT CATTTAGGGT TTAAGTGGGG GGTCTTTAAG ATTAAATTCT CTGAATTGTA 1081 CATACATGGT TACACGGATA TTGTAGTCCT GGTCGTATAT ACTGTTTTCG AACGCAGTGC 1141 CGAGGCCTAC GTGGTCCACA TTTCTAGAGG TTTGTAGCCT CAGCCAAAGC TGAGTCCTTT 1201 TGTTATTTGG TTGGAACTAA TCAATAGTGG AGTCAAGAAC AGGTTTGGGT GTGAAGTAAC 1261 GGGAGTGGTA GGAGAAGGGT TGGGGGATTG TATGGCGGGA GGAGTAGTTT ACATATGGGT 1321 CATAGGTTAG GGCTGTGGCC TTTGTTACAA AGTTATCATC TAGAATAACA GCAGTGGAGC 1381 CCACTCCCCT ATCACCCTGG GTGATGGGGG AGCAGGGCCA GAATTCAACC TTAACCTTTC 1441 TTATTCTGTA GTATTCAAAG GGTATAGAGA TTTTGTTGGT CCCCCTCCCG GGGGGAACAA 1501 AGTCGTCAAT ATTAAATCTC ATCATGTCCA CCGCCCAGGA GGGCGTTCTG ACTGTGGTAG 1561 CCTTGACAGT ATATCCGAAG GTGCGGGAGA GGCGGGTGTT GAAGATGCCA TTTTTCCTTC 1621 TCCAACGGTA GCGGTGGCGG GGGTGGACGA GCCAGGGGCG GCGGCGGAGG ATCTGGCCAA 1681 GATGGCTGCG GGGGCGGTGT CTTCTTCTGC GGTAACGCCT CCTTGGATAC GTCATAGCTG 1741 AAAACGAAAG AAGTGCGCTG TAAGTATT
2.3. Die ätiologische Bedeutung von PCV2
2.3.1. Die ätiologische Bedeutung von PCV2 für das Krankheitsbild PMWS
Der kausale Zusammenhang zwischen der Infektion mit PCV2 und dem Krankheitsbild PMWS war lange Zeit umstritten , zum einen, da in ersten Infektionsversuchen die Henle – Koch`schen Postulate nicht erfüllt werden konnten und zum anderen, da virale und bakterielle Koinfektionen bei diesem Krankheitsbild eine Rolle zu spielen scheinen. Im folgenden werden verschiedene Infektionsversuche beschrieben.
i.) Die Arbeitsgruppe ELLIS et al. (1999) infizierte intranasal je eine Gruppe drei Tage alter gnotobiotische Ferkel entweder mit einem PCV2-Inokulat, mit Lymphknotenhomogenisat von Tieren mit PMWS oder mit negativem Kontrollgewebe.
Die Tiere wurden im Alter von 5 Wochen getötet. Bei allen mit Virus oder Lymphknotenhomogenisat infizierten Tieren fand man für PMWS typische pathomorphologische Veränderungen, wie generalisierte Lymphadenopathie, Hepatitis, Nephritis, interstitielle Pneumonie, Myokarditis und Gastritis, jedoch wurde bei der viralen Reisolierung aus den betroffenen Geweben über PCR und Immunhistochemie nicht nur PCV2, sondern auch porzines Parvovirus (PPV) nachgewiesen. Diese Tiere zeigten ebenso mittlere bis hohe Antikörpertiter gegenüber PCV und mittlere Antikörpertiter gegenüber PPV.
Bei den Kontrolltieren konnten weder Läsionen noch Virus oder Virus – spezifische Antikörper entdeckt werden.
Das Krankheitsbild PMWS wurde hierbei nicht durch alleinige Infektion mit PCV reproduziert. Durch die Koinfektion mit PPV konnten in diesem Versuch die Henle – Koch´schen Postulate folglich nicht erfüllt werden.
ii.) In einem weiteren Versuch infizierten ALLAN et al. (1999a) Kolostrum – frei aufgezogene Ferkel im Alter von 1 – 2 Tagen intranasal mit PCV2 und/oder PPV.Die erste Gruppe erhielt ein reines PCV2 – Inokulat, die zweite Gruppe ein reines PPV – Inokulat, die dritte Gruppe ein kombiniertes PCV2/PPV – Inokulat und die vierte Gruppe ein Chloroform – behandeltes kombiniertes PCV2/PPV – Inokulat. Eine Kontrollgruppe blieb unbehandelt. Die Tiere wurden 21 – 26 Tage nach Infektion getötet und untersucht. Die Kontrolltiere und diejenigen, die lediglich mit PPV infiziert waren, zeigten weder klinische Zeichen, noch konnten bei ihnen Läsionen oder virales Antigen entdeckt werden.
Eins der Tiere, die mit PCV2 allein infiziert worden waren, wurde lethargisch und kümmerte.
Bei allen Tieren dieser Gruppe konnten geringgradige bis mittelgradige histopathologische Veränderungen der lymphatischen Gewebe beobachtet werden, die in der Regel lymphozytäre
Depletion, histiozytäre Infiltration und amphophile intrazytoplasmatische und intranukleäre Einschlusskörper beinhalteten. Ein Tier zeigte eine geringgradige histiozytäre Infiltration der Leber. PCV2-Antigen konnte bei 3 von 4 Tieren in unterschiedlicher Häufung in Lymphknoten, Tonsille, Milz, Leber, Lunge, Lunge, Thymus und Pankreas nachgewiesen werden.
Die Tiere, die ein kombiniertes PCV2/PPV – Inokulat oder ein Chloroform - behandeltes PCV2/PPV – Inokulat erhielten, wurden lethargisch und zwei von ihnen starben.
Pathomorphologisch zeigte sich die Mehrzahl dieser Tiere ikterisch, bei einigen konnten weiterhin Hepatomegalie und Ödeme in Nierenbecken und Mesenterium des Kolons beobachtet werden. Die histopathologischen Veränderungen bei diesen Tieren waren identisch mit denen, die ausschließlich mit PCV2 infiziert worden waren, jedoch stärker ausgeprägt. Zusätzlich wurden Leberzellnekrosen beobachtet.
Bei allen Tieren wurde PCV2-Antigen wiederum in Lymphknoten, Tonsille, Leber, Milz, Lunge, Nieren, Thymus und Pankreas nachgewiesen, PPV-Antigen fand sich in geringer Menge bei 3 von 5 Tieren dieser Gruppe vorwiegend in Niere und Leber.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, daß eine Koinfektion mit PPV bei PCV2 – infizierten Schweinen, diese für die Entwicklung des Krankheitsbildes PMWS predisponiert.
iii.) BALASCH et al. (1999) infizierten eine Gruppe von Schweinen ( 8 Tiere, frei von PRRSV, AK – Virus, TGEV, PRCV, PPV, SIV und Rotlauf ) im Alter von 8 Wochen intranasal mit PCV2 – Virus. Eine zweite Gruppe ( 2 Tiere ) wurde als Negativkontrolle gehalten. Die Hälfte der Tiere beider Gruppen wurde am 14. Tag p.i. getötet, die andere Hälfte am 21. Tag p.i..
Die Kontrolltiere zeigten während des gesamten Versuches keinerlei klinische Symptomatik.
In der Gruppe der infizierten Schweine entwickelte ein Tier über einige Tage einen wässrigen Durchfall, 5 Tiere entwickelten am 12. Tag p.i. Fieber, das bei 3 Tieren bis zum 14. Tag p.i.
anhielt. Ebenso konnte bei den infizierten Tieren gegenüber der Kontrollgruppe eine verminderte Gewichtszunahme festgestellt werden.
Pathomorphologische Veränderungen konnten lediglich bei einigen der infizierten Tiere in mäßiger Form beobachtet werden. Makroskopisch sah man bei 3 Tieren eine leichte Vergrößerung der mesenterialen Lymphknoten und bei 2 von diesen zusätzlich auch eine leichte Vergrößerung der Peyer´schen Platten. Mikroskopisch konnte in 2 Schweinen eine leichte bis mäßige entzündliche histiozytäre Infiltration der Lymphknoten beobachtet werden.
Bei jeweils einem Tier fand man entweder eine histiozytäre Entzündung im periarteriolären Lymphsystem der Milz verbunden mit Synzytienbildung, eine multifokale interstitielle Pneumonie, eine interstitielle Nephritis oder eine systemische monozytäre Perivaskulitis.
Virale Nukleinsäure fand sich bei 4 der am 14. Tag p.i. getöteten Tiere und 2 der am 21. Tag p.i. getöteten Tiere in geringer bis mäßiger Menge vorwiegend in den lymphatischen Organen, wobei die Kontrolltiere allesamt negativ waren.
Serologisch zeigten 4 der 10 Tiere am Tag der Inokulation Antikörper gegen PCV1. Die Titer blieben während des Versuchs gleich oder verringerten sich. Ein zu Beginn des Versuchs PCV1-negatives Schwein serokonvertierte während des Versuchs. Im Bezug auf PCV2 waren alle Tiere zu Beginn des Versuchs seronegativ. Die Kontrolltiere blieben seronegativ, während alle inokulierten Schweine zum Zeitpunkt der Tötung eine Serokonversion mit hohen Titern zeigten.
Als Fazit dieses Versuches stellten die Autoren fest, daß die klinischen Symptome und pathomorphologischen Veränderungen, die in Fällen des PMWS beobachtet werden, allenfalls in stark abgeschwächter Form reproduziert wurden. Außerdem erschwerte die geringe Anzahl der Probanden die Interpretation der Befunde.
iiii.) Über eine experimentelle Infektionen von 3 Wochen alten Ferkeln, die in utero mit PRRS infiziert waren, berichtete PLANA-DURAN (1999).
5 Wurfgeschwister im Alter von drei Wochen, deren Muttertier am 90. Trächtigkeitstag mit PRRSV infiziert worden war und die seronegativ für PCV2 waren, wurden intranasal mit einem Homogenisat eines an PMWS erkrankten Tieres (seronegativ für PRRSV, PPV, AKV, SIV, und Rotlauferreger) infiziert. Als Kontrolle bekamen 2 weitere Wurfgeschwister intranasal lediglich PBS verabreicht.
Zwei der infizierten und eins der Kontrolltiere wurden am 14. Tag p.i., die restlichen am 20.
Tag p.i. getötet. 4 der 5 infizierten Tiere zeigten über mehrere Tage Fieber. Während dieser Periode begannen sich bei diesen Tieren die Leistenlymphknoten deutlich abzuzeichnen.
Ebenso gingen die Tageszunahmen bei den infizierten Tieren erheblich zurück.
Eine Serokonversion konnte lediglich bei 2 der 3 am 20. Lebenstag verbliebenen infizierten Schweine festgestellt werden. Die Kontrolltiere zeigten pathomorphologisch keinerlei Veränderungen, wohingegen bei den infizierten Tieren eine generalisierte Lymphknotenhyperplasie (3/5), Splenomegalie und Hyperplasie der weißen Milzpulpa (3/5), Lungenverfestigung (2/5) und Hämorrhagien in den Mesenteriallymphknoten beobachtet werden konnte.
Mikroskopisch zeigten alle infizierten Tiere in unterschiedlich ausgeprägter Form eine lymphozytäre Depletion und histiozytäre Infiltration in den Lymphorganen mit zahlreichen intrazytoplasmatischen Einschlusskörperchen, sowie eine interstitielle Pneumonie. Über in- situ-Hybridisation konnte in den Geweben aller infizierter Schweine in unterschiedlicher Menge typische Virusnukleinsäure festgestellt werden.
Trotz undeutlicher klinischer Symptomatik ließen sich in diesem Versuch Läsionen vergleichbar mit Fällen von PMWS bei den infizierten Tieren reproduzieren, jedoch bleibt die Bedeutung der Koinfektion mit PRRSV für die Pathogenese von PMWS unklar.
iiiii.) KENNEDY et al. (2000) berichteten über die erfolgreiche Reproduktion von PMWS im Infektionsversuch durch alleinige Infektion mit PCV2. In Anlehnung an vorausgegangene Versuche wurden wiederum verschiedene Gruppen Kolostrum-frei aufgezogener Ferkel entweder mit PCV2 oder PPV allein, oder mit PCV2/PPV kombiniert infiziert. Wiederum zeigten die doppelt infizierten Tiere die deutlicheren klinischen und pathomorphologischen Veränderungen, wie Ikterus, Hepatomegalie und vergrößerte Nieren. Histopathologisch konnten Makrophageninfiltration, Formation von Synzytien und zytoplasmatische und nukleäre amphophile Einschlusskörperchen in lymphatischem Gewebe festgestellt werden.
Weiterhin konnten in den Lebern Hepatitiden und Zellnekrosen, in den Nieren interstitielle Nephritiden und Pyelitiden, sowie interstitielle Pneumonien in den Lungen beobachtet werden. Bei den lediglich mit PCV2 infizierten Schweinen konnte nur bei einem Tier klinische Veränderungen beobachtet werden, aber die beschriebenen histopathologischen Veränderungen waren bei allen Tieren, wenn auch in abgeschwächter Form, vorhanden. In allen veränderten Organe konnte PCV2-Antigen nachgewiesen werden.
Aufgrund dieser Ergebnisse sehen KENNEDY et al. (2000) die Henle-Koch´schen Postulate erfüllt, räumten aber ein, daß Koinfektionen, wie in diesem Fall mit PPV, den Schweregrad der Erkrankung erhöhen und somit eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von PMWS haben können.
Virale Koinfektionen konnten in Feldstudien immer wieder bei Fällen von PMWS nachgewiesen werden. Oftmals konnte neben PCV2 das PRRSV nachgewiesen werden (LE CANN et al. 1997; HINRICHS et al. 1999a; LAROCHELLE et al. 1999).
Unter Bezugnahme auf diese Tatsache infizierten HARMS et al. (2000) Kolostrum – frei aufgezogene Ferkel im Experiment entweder oronasal nur mit PRRSV oder aber kombiniert mit PRRSV und PCV2. Dabei wurde bei den doppelt infizierten Tieren im Versuchsverlauf eine sehr viel höhere Morbidität und Mortalität festgestellt. Auch im Sektionsbild zeigten
diese Tiere stärker ausgeprägte interstitielle Pneumonien als die lediglich mit PRRSV infizierten Tiere, was auf einen synergistischen Effekt der beiden Erreger hinwies.
ELLIS et al. (2000) konnten in einer Feldstudie in 69 Fällen von PMWS bei allen Tieren PCV2 nachweisen, in 12 dieser Fälle zusätzlich PPV. Sie schlossen daraus, daß eine Koinfektion mit PPV in manchen Fällen sicherlich eine Rolle gespielt haben kann, aber nicht grundsätzlich eine Bedingung für die klinische Manifestation von PMWS ist.
In einer weiteren Studie wird berichtet, daß in Fällen von PMWS auch Läsionen gefunden werden konnten, die mit bakteriellen Infektionserregern in Verbindung gebracht werden, z.B.
Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida ( DEL POZO 1999 ).
In Dänemark wurden 1991 Fälle von Lungeninfektionen mit dem an sich opportunistischen Keim Pneumocystis carinii beschrieben, die sich im Nachhinein als Fälle von PMWS herausstellten. Dieser Keim konnte auch bei 5% der in Kanada von PMWS betroffenen Schweine isoliert werden ( CLARK 1997 ).
Berücksichtigt man die für diese Erkrankung spezifischen histopathologischen Veränderungen der lymphatischen Geweben legen diese Erkenntnisse die Vermutung nahe, die Infektion mit PCV2 könnte für die davon betroffenen Tiere eine immunsuppressive Wirkung haben ( DOMINGO 1999b ). Hierfür fehlt jedoch bis heute der experimentelle Beweis.
Andererseits muß eine Infektion mit PCV2 nicht zwangsläufig mit klinischen und pathomorphologischen Veränderungen gekoppelt sein ( LAROCHELLE et al. 1999 ).
Bei gesunden Schweinen mit Kontakt zu an PMWS erkrankten Tieren ist PCV2 in der Regel nachweisbar, dies muß jedoch nicht mit klinischer Symptomatik oder deutlichen pathomorphologischen Befunden einhergehen. Weiterhin zeigen gesunde Schweine, die im Alter von 3-4 Monaten Kontakt zu an PMWS-erkrankten Schweinen hatten, zum Zeitpunkt der Schlachtung hohe PCV2 - Antikörper-Titer, wobei pathomorphologische Veränderungen nicht zu beobachten sind und PCV2 in den Geweben nicht mehr nachweisbar ist (DOMINGO u. SEGALES 1999). Auch HARDING (1999) berichtet über hohe Seroprävalenzen gegenüber PCV2 in Schweineherden, die keinerlei klinische Anzeichen von PMWS zeigen.
2.3.2. Die mögliche ätiologische Bedeutung von PCV2 für andere Krankheitsbilder
Bereits im Jahr 1994 wiesen HINES und LUKERT in einem Infektionsversuch auf die mögliche ätiologische Rolle von PCV für einen infektiösen kongenitalen Tremor bei neugeborenen Ferkeln hin. Sie infizierten Sauen im letzten Drittel der Trächtigkeit intranasal/oral und subkutan mit einem PCV-Inokulat, das sie von einem Ferkel mit kongenitalen Tremor gewonnen und auf Schweinenierenzellen kultiviert hatten. Die Mehrzahl der Ferkel dieser Sauen zeigte nach der Geburt einen leichten Tremor, der 2 bis 3 Wochen anhielt. Aus diesen Ferkeln ließ sich das Virus auch reisolieren, womit er die Henle – Koch´schen Postulate erfüllt sah. Wichtig ist hierbei jedoch, daß zum Zeitpunkt dieses Versuches noch nicht zwischen PCV1 und PCV2 unterschieden wurde und somit nicht klar ist, mit welchem der beiden Varianten der Versuch durchgeführt wurde.
Als weitere mögliche Ursachen für einen kongenitalen Tremor werden in der Literatur eine intrauterine Schweinepestinfektion, genetische Übertragung verschiedener rezessiver Erbanlagen ( Schwedische Landrasse – British Saddleback ), sowie Trichlorfon-Intoxikation nach Behandlung tragender Sauen ( Neguvon®) beschrieben (WENDT u. BICKHARDT 1997).
PCV2 wird neben dem Krankheitsbild PMWS in letzter Zeit auch mit anderen Krankheitsbildern in Verbindung gebracht, wobei die ätiologische Bedeutung von PCV2 hierbei noch unklar ist und ein kausaler Zusammenhang zwischen Nachweis des Virus und diesen Krankheitsbildern nicht eindeutig bewiesen ist.
Eine bedeutende Erkrankung stellt hierbei das porzine Dermatitis-Nephropathie-Syndrom (PDNS) dar. Bei dieser Erkrankung soll es sich um eine Typ-III-Hypersensitivitätsreaktion handeln ( HIGGINS 1993; HELIE et al. 1995 ).
In ersten Berichten stehen bakterielle Erreger noch im Mittelpunkt der Betrachtung. So stellten WHITE u. HIGGINS ( 1993 ) eine Infektion mit Actinobacillus pleuropneumoniae bei einigen Tieren mit PDNS fest. In einer Studie von DURAN et al. (1997) konnten bei einigen Tieren diverse bakterielle Erreger isoliert werden , z.B. Arcanobacterium pyogenes (Arc.
pyogenes), Pasteurella multocida (Past. multocida), Hämophilus parasuis (Häm. parasuis) und Bordetella bronchiseptica (Bord. bronchiseptica). Bei anderen Tieren war kein ätiologisches Agens nachweisbar. THOMSON et al. (1998) vermuteten aufgrund ihrer Untersuchungen, daß Past. multocida eine Rolle bei der Entstehung von PDNS haben könnte.
Mehrere Veröffentlichungen weisen auf eine ätiologische Rolle des PRRSV in der Pathogenese von PDNS hin (SEGALES et al. 1998a; THIBAULT et al. 1998; GELMETTI et al. 1999 ).
Über den Nachweis von PCV2 in Zusammenhang mit PDNS berichten SEGALES et al.
(1998b) und ROSELL et al. (2000). Hierbei konnte jedoch in vielen Fällen auch PRRSV nachgewiesen werden. Auch GRESHAM et al. (2000) bestätigen in ihren Untersuchungen, PCV2 in den betroffenen Geweben von an PDNS erkrankten Tieren isoliert zu haben.
Seit einiger Zeit wird die Infektion mit PCV2 mit einem weiteren Krankheitsbild in Zusammenhang gebracht, der porzinen proliferativen und nekrotisierenden Pneumonie (PNP).
In älterer Literatur wurden als Verursacher dieser speziellen Pneumonieform das PRRSV und Schweineinfluenza – Virus vermutet ( MORIN et al. 1990; BIKOUR et al. 1994; MAGAR et al. 1994 ). In einer Feldstudie konnten HINRICHS et al. (1999b) in fast allen Fällen dieses pathomorphologischen Krankheitsbildes PCV2 nachweisen, in der Mehrzahl der Fälle jedoch mit einer PRRSV-Koinfektion. Auch CLARK und HARDING (1998) sowie KIUPEL et al.
(1999) beschreiben Fälle von proliferativen und nekrotisierenden Pneumonien in Korrelation mit dem Nachweis von PCV2, ordneten sie jedoch unter dem Symptomkomplex PMWS ein.
2.4. Epidemiologie
Die vorliegenden Kenntnisse zur Verbreitung von PCV stammen zumeist aus serologischen Studien aus der Zeit vor 1995. Mit den Techniken, die in diesen Studien vor dem Auftreten von PMWS benutzt wurden ( Immunoperoxidase-Monolayer-Assay (IPMA) und Immunfluorescence-Assay (IFA) ) kann nicht zwischen PCV1 und PCV2 unterschieden werden. Neuere Studien lassen eine begrenzte Kreuzreaktion zwischen PCV1 und PCV2 vermuten (SEGALES 1999b, RODRIGUEZ-ARRIOJA et al. 2000). Die Seroprävalenz von PCV2 ist sehr viel höher als die von PCV1. Diese Daten suggerieren, dass PCV2 möglicherweise das vorherrschende Virus in der Population ist, und daß die beobachteten PCV1-Titer Ausdruck der existierenden Kreuzreaktion sein könnten. Ohne jedoch systematische serologische Untersuchungen über beide Viren anzustellen und den genauen Grad der Kreuzreaktivität zu kennen, wird es schwierig sein, diese Ungewissheit aufzuklären (SEGALES 1999b, RODRIGUEZ-ARRIOJA et al. 2000).
Untersuchungen zu PCV1:
Serumantikörper gegenüber PCV1 konnten in vielen Ländern weltweit festgestellt werden, so z.B. in Deutschland (TISCHER et al., 1982, 1986, 1995), Kanada (DULAC et al., 1989), Neuseeland (HORNER 1991), Großbritannien (EDWARDS u. SANDS 1994) und Nordirland (ALLAN et al. 1994b).
TISCHER et al. (1986) berichteten in einer serologischen Studie über das Vorkommen von Antikörpern gegnüber PCV1 bei Schlachtschweinen an mehreren Schlachthöfen in Nord- und Ostdeutschland über Seroprävalenzen von 77 bis 95%. Auch in den Seren von Wildschweinen in Ostdeutschland konnten positive Antikörper Titer gefunden werden.
Kein Nachweis gelang dagegen in den Seren von Rindern, Schafen, Ziegen, Hühnern, Puten, Mäusen oder Menschen über IIF ( TISCHER et al. 1982; ALLAN et al. 1994b ). In einer späteren Studie von TISCHER et al. (1995) gelang es über den ELISA niedrige Titer von PCV-Antikörpern in den Seren von Menschen (30%), Mäusen (12-69%) und Rindern (35%) zu finden.
Bei der Untersuchung verschiedener Altersgruppen unterschiedlicher Herkünfte wurde übereinstimmend festgestellt, daß die Prozentzahl der PCV-negativen Seren mit zunehmenden Alter abnahm, während die Titer anstiegen (TISCHER et al. 1995). In seropositiven Betrieben konnten hierbei Prävalenzen von 89,8 % bei Mastschweinen, 73,6% bei Jungsauen und 91,4%
bei Altsauen festgestellt werden.
In einer kanadischen Studie wurde PCV über IFA in 55% der Seren einer kommerziellen Schweineherde festgestellt und bei 26% der Seren, die auf einen Schlachthof bei Sauen gesammelt wurden. (DULAC u. AFSHAR 1989).
Bei Felduntersuchungen in 27 kanadischen Schweineherden konnten SUH et al. (1998) PCV- Antikörper in 26 dieser Herden finden. Hierbei zeigten sich 66% der Sauen, 87% der Saugferkel, 26% der Aufzuchtferkel und 63% der Mastschweine positiv.
ALLAN et al. (1994b) berichten über den Abfall maternaler Antikörper bei Ferkeln im Alter von 8 bis 9 Wochen und einem Wiederanstieg zwischen der 13. und 15. Woche. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, daß das Virus am Ende der Absetzphase (etwa in der 10. – 12. Lebenswoche) rezirkuliert, wobei die Titer der Saug- und Absatzferkel maternalen Ursprungs sind und die Titer der Mastschweine von einer Infektion stammen.
Im Bezug auf die Übertragungsmöglichkeiten von PCV1 konnten TISCHER et al. (1986) nach experimenteller Infektion neugeborener seronegativer Ferkel 13 und 14 Tage p.i. PCV1 in Fäzes und Nasenschleim nachweisen.
Über den Nachweis eines PCV – ähnlichen Virus in Fällen von kongenitalem Tremor und der Reproduktion dieser Symptome nach experimentaler Infektion tragender Sauen berichten HINES und LUKERT (1994), jedoch wurde dieses PCV – ähnliche Virus nicht näher charakterisiert.
Auch ALLAN et al. (1995) berichteten über den Nachweis von PCV1 in 2 totgeborenen Ferkeln in einer Felduntersuchung, was auf die Möglichkeit der vertikalen Transmission hinweist.
Untersuchungen zu PCV2
Zur Zeit gibt es nur wenig veröffentlichte Daten zur Seroprävalenz, Ausscheidungsmöglich- keiten und Übertragung von PCV2. Eine epidemiologische Studie in Ost – Kanada zeigte, daß PCV2 – Antikörper weit verteilt waren (COTRELL et al. 1999). In dieser Studie wurden sowohl SPF – Herden, große Mastbetriebe als auch kleine Mast- und Zuchtbetriebe untersucht. In all diesen unterschiedlichen Betriebsformen konnten PCV2 – Antikörper gefunden werden. Die Serokonversion fand hier bei Ferkeln in der Regel 3 – 4 Wochen nach dem Absetzen statt.
HARDING (1999) verglich 25 kanadische Schweineherden mit und ohne klinische Zeichen auf PMWS auf PCV2-Antikörper-Titer. Dabei wurden unabhängig von dem Vorhandensein klinischer Anzeichen in den verschiedenen untersuchten Altersgruppen nahezu identische AK-Titer gefunden. Bei den Saugferkeln betrug die Seroprävalenz ca 80%, wahrscheinlich bedingt durch maternale Antikörper. Durch den Abfall dieser Antikörper konnte bei Absatzferkeln lediglich eine Prävalenz von ca. 45% festgestellt werden. Bei Aufzuchtschweinen kam es zur Serokonversion mit einer Prävalenz von 73-90%, die dann bei den Schlachtschweinen sogar 97-100% betrug.
Berichte über die Ausscheidung von PCV2 unter Feldbedingungen liegen zur Zeit kaum vor.
Jedoch deutet der Nachweis von PCV2 in Abortmaterial (WEST et al. 1999) auch hier auf die Möglichkeit einer vertikalen Übertragung hin.
In neuesten Studien wurde über die Virusexkretion nach experimenteller Infektion gnotobiotischer Ferkel mit PCV2 berichtet. Bei diesen Tieren konnte PCV2 31 Tage p.i. in Kot, Speichel und Augentupfern nachgewiesen werden (KRAKOWKA, persönliche Mitteilung, zitiert nach ALLAN u. ELLIS 2000)
Berichte über PMWS im Zusammenhang mit PCV2 liegen mittlerweile aus Kanada (HARDING 1996), den USA (DAFT et al. 1996), Frankreich (LE CANN et al. 1997), Spanien (SEGALES et al. 1997), Nordirland (KENNEDY et al. 1998), Deutschland
(HINRICHS et al. 1999a), Korea (CHOI u. CHAE 1999) und Japan (ONUKI et al. 1999) vor.
Eine weite Verbreitung von PCV2 innerhalb der Schweinepopulation ist daher wahrscheinlich, weitere epidemiologische Studien sind jedoch notwendig, um verlässliche Aussagen hierzu machen zu können.
2.5. Pathogenese
Umfassende Kenntnisse im Bezug auf die Pathogenese von PMWS und anderer mit der PCV2- Infektion assoziierter Krankheiten liegen bis heute nicht vor. Die bisherigen Studien stammen überwiegend aus der Zeit, als PMWS noch unbekannt war, beziehungsweise zwischen PCV1 und PCV2 noch nicht unterschieden wurde.
Bei ersten experimentellen Infektionen von Schweinen mit PCV1 konnte einige Tage nach intranasaler Inokulation Virus aus Nasen- und Kottupfern isoliert werden, nicht jedoch post mortem aus Organen. Selbiges gelang bei einem nicht experimentell infizierten Kontakttier, was auf eine horizontale Transmission des Virus hinwies. Keines dieser Tiere zeigte pathomorphologische Veränderungen (TISCHER et al. 1986). Auch nach experimenteller Infektion gnotobiotischer Ferkel mit PCV2 konnte das Virus 31 Tage p.i. in Speichel, Fäzes und Augentupfer nachgewiesen werden (KRAKOWKA, persönliche Mitteilung, zitiert nach ALLAN u. ELLIS 2000).
Bei einer Feldstudie an Schweinefeten konnten ALLAN et al. (1995) zwar keine Antikörpertiter gegenüber PCV (nicht typisiert (n. typ.)) feststellen, wohl aber PCV (n. typ.) in den Geweben von 2 totgeborenen Ferkeln. Eine vertikale Infektion schien dadurch möglich und das Fehlen von Antikörpern bei den Neugeborenen legte nahe, daß eine transplazentale Infektion sehr selten ist und vor der fetalen Immunkompetenz stattfindet.
Über die vertikale Transmission von PCV (n. typ.) berichteten außerdem HINES und LUKERT (1994) im Zusammenhang mit kongenitalem Tremor bei Saugferkeln, bei dem sie PCV aus Niere, Dünndarm, Zäkum und Kolon auch reisolieren konnten, sowie WEST et al.
(1999), die bei einem Wurf abortierter und totgeborener Ferkel bei mehreren Tieren PCV2- Antigen in Leber, Lunge, Niere und Herz feststellen konnten. Welche Rolle die vertikale Übertragung für die Ausbreitung des Virus und für die Erkrankung infizierter Tiere spielt, ist dennoch fraglich.
ALLAN et al. (1994a) zeigten, daß PCV (n. typ.) sich in Makrophagen und Monozyten von Schweinen und Rindern vermehren kann.
Eine in-vitro-Immunfunktionsstudie an PCV (n. typ.) infizierten porzinen Alveolar- makrophagen von MC NEILLY et al. (1996) zeigte keinen Einfluß auf die Expression von Fc- und Komplement- Rezeptoren oder ihre Fähigkeit, Komplement-umhüllte Candida-krusei- Zellen zu töten und phagozytieren. Jedoch konnte 4 Tage nach Inokulation von Alveolarmakrophagen mit PCV eine erhöhte Expression von MHC- Klasse 1-Antigenen beobachtet werden und eine Reduktion der MHC-Klasse 2-Antigen-bildender Zellen 8 Tage nach Inokulation. Zusätzlich wurde eine signifikante (p<0,05) Reduktion der Makrophagen- mediierten, Mitogen-induzierten Lymphozytenproliferation nach Inokulation mit PCV beobachtet. Diese Ergebnisse indizierten, daß eine PCV – Infektion das Immunsystem beeinflussen kann.
Nach experimenteller Infektion von Schweinen konnten ALLAN et al. (1995) mittels Virusisolierung und Immunhistochemie PCV-Antigen (n. typ.) in einer Reihe von Geweben des lymphatischen Systems, der Lunge und des Darms feststellen. Das Virus dominierte hierbei in Milz, Thymus und Lungengewebe und war mit Makrophagen/Monozyten, Histiozyten, Thymusmakrophagen und/oder Antigen-präsentierenden Zellen assoziiert. Dies ließ eine mögliche pathogene Rolle von PCV bei Immundysfunktionen vermuten, wie man sie auch bei anderen Mitgliedern der Familie Circoviridae, z.B. dem Chicken Anemia Virus (CAV), kennt. Jedoch zeigten auch diese Schweine keine pathomorphologischen Veränderungen.
Bei dem Krankheitsbild PMWS und den anderen mit der PCV2-Infektion assoziierten Krankheiten wird PCV2 regelmäßig aus einem breiten Spektrum an Organen nachgewiesen.
Zielorgan sind dabei wieder die lymphatischen Gewebe.
So fand man PCV2 bei Tieren mit PMWS in Lunge, Leber; Milz, verschiedenen Lymphknoten, Tonsille, Peyer´schen Plaques, Niere und Pankreas ( ALLAN et al. 1998;
MOROZOV et al. 1998; CHOI u. CHAE 1999; KIUPEL et al. 1999; MC NEILLY et al.
1999; ROSELL et al. 1999). Auch bei weiteren Infektionsversuchen von BALASCH et al.
(1999) und ALLAN et al. (1999a) konnte dies bestätigt werden, wenn auch der Nachweis von PCV2 nicht zwangsläufig mit deutlichen Organveränderungen verbunden war.
Beim porzinen Dermatitis-Nephropathie-Syndrom (PDNS), bei dem vermutet wird, dass es auf einer Typ-III-Hypersensitivitätsreaktion beruht, konnte PCV2 ebenfalls in diesem breiten Spektrum von Organen nachgewiesen werden, nicht aber in den beschädigten Gefäßen und Glomeruli (ROSELL et al. 2000).
Zielzellen der PCV- Infektion (n. typ.) sind laut ROSELL et al. (1999) hauptsächlich Monozyten/Makrophagen und Antigen präsentierende Zellen, weniger epitheliale Zellen, wie
renale Tubuluszellen oder bronchioläre Zellen, sowie endotheliale Zellen, Hepatozyten und Lymphozyten. CHOI u. CHAE (1999) fanden das Virus in Makrophagen von Leber, Milz, Peyer´schen Plaques und Lunge sowie in Hepatozyten und renalen Tubulusepithelzellen.
KIUPEL et al. (1999) gelang der Nachweis in bronchialen und intestinalen epithelialen Zellen, Makrophagen und T- und B-Lymphozyten. Hierbei stellt sich die Frage, ob der Nachweis von PCV (n. typ.) in den Zellen des Immunsystems eine primäre Folge der Infektion ist, oder sekundär durch Phagozytose von Virus oder Virus-infizierter Zellen als Teil eines Clearance-Mechanismus (Makrophagen) oder durch Endozytose im Rahmen der Antigen-Präsentation (B-Zellen) bedingt ist (KIUPEL et al. 1999). Die Replikation von PCV (n. typ.) in Monozyten in vitro (ALLAN et al. 1994a) unterstützt die These der Infektion von Makrophagen in vivo, die Tatsache, daß sich virale Nukleinsäure hauptsächlich im Zytoplasma von Makrophagen anfindet, deutet eher auf Phagozytose von viralen Partikeln als auf Infektion und Replikation hin (STEVENSON et al. 1999).
Obwohl PCV1 keinen zytopathogenen Effekt zeigt (TISCHER et al. 1982), weisen die zahlreichen Nachweise von PCV in abgeschilferten Bronchialepithelien und in Makrophagen und Lymphozyten depletierter lymphatischer Organe erkrankter Tiere auf eine mögliche Zytopathogenität von PCV2 hin (KIUPEL et al. 1999).
Da PCV (n. typ.) Bronchialepithelien infizieren kann und mit deren Abschilferung assoziiert ist, sollte es als mögliche Ursache für nektrotisierende Bronchiolitiden beim Schwein in Betracht gezogen werden (KIUPEL et al. 1999). Der Nachweis von PCV (n. typ.) in den Zottenepithelien des Darmes könnte ein Hinweis dafür sein, daß das Virus eine Rolle bei Durchfallerkrankungen bei Schweinen spielt (KIUPEL et al. 1999). Die Bedeutung des Nachweises von PCV-DNA in epithelialen Schleimhautzellen für die Übertragung von PCV ist unbekannt, jedoch könnte sie als Ausgangspunkt für die Infektion anderer Zelltypen wichtig sein. Ebenso könnten abgeschilferte PCV-infizierte Epithelien des Respirations- und Intestinaltraktes eine wichtige Rolle bei der Übertragung von PCV spielen (KIUPEL et al.
1999).
Die obengenannten Hypothesen werden durch Kenntnisse über das Psittacine Beak and Feather Disease Virus (PBFDV) gestützt, das ebenfalls der Familie der Circoviridae angehört und dem PCV sehr ähnlich ist. Es hat einen Tropismus zu Epithelien von Federn und Follikeln und vermehrt sich dort in den basalen Schichten (LATIMER et al. 1991). Weiterhin repliziert es sich vorwiegend in Makrophagen und weniger häufig in epithelialen Zellen von Schnabel, Rachen, Gaumen, Ösophagus, Kropf und Krallen (LATIMER et al. 1990). In vielen
lymphatischen Geweben ist PBFDV im Zytoplasma von Makrophagen zu finden, während in Darmepithelien hauptsächlich die Zellkerne betroffen sind (LATIMER et al. 1990). Große Mengen von PBFDV können bei infizierten Tieren in Federstaub und Fäzes nachgewiesen werden (RITCHIE et al. 1991).
PCV (n. typ.) kann im Gegensatz zu PBFDV in Endothelien der dermalen Blutgefäße nachgewiesen werden, nicht jedoch in kutanen Epithelzellen (KIUPEL et al. 1998).
Weitere Studien werden nötig sein, um die Pathogenese der an die Infektion mit PCV2 assoziierten Krankheiten zu klären und die hier aufstellten Hypothesen zu bestätigen oder zu widerlegen. Insbesondere sollte hierbei der Frage der Virusausscheidung und der Übertragungsmechanismen, der Beeinflussung des Immunsystems durch eine Infektion mit PCV2 und der Rolle von Koinfektionen eine besondere Bedeutung beigemessen werden.
2.6. Krankheitsbilder
2.6.1 PMWS
2.6.1.1. Klinik
Das Krankheitsbild PMWS wird gewöhnlich bei Absatzferkeln im Alter zwischen 6 und 15 Wochen beobachtet, selten sind auch Saugferkel betroffen (HARDING 1996; DEL POZO 1999). Klinisches Leitsymptom ist hierbei das Kümmern dieser Tiere. Zumeist sind Ferkel betroffen, die zum Zeitpunkt des Absetzens gut entwickelt waren. Es setzt ein mitunter über Wochen fortschreitender Gewichtsverlust ein, der im Endstadium der Erkrankung zu einem massiven klinischen Krankheitsbild führt (DAFT et al. 1996; HARDING 1996, 1999; LE CANN et al. 1997; SEGALES et al. 1997).
Sehr häufig wird bei erkrankten Tieren zusätzlich eine Dyspnoe beobachtet, die je nach Ausprägung mitunter lebensbedrohend sein kann. Im Rahmen bakterieller Sekundärinfektionen mit lungenpathogenen Erregern tritt diese Dyspnoe zusammen mit Husten auf ( HARDING 1999 )
Weiterhin fallen erkrankte Tiere oft durch Anämie, die in der Regel nicht regenerativ ist und oft mit Leukopenie einhergeht, sowie durch bereits klinisch vergrößerte inguinale Lymphknoten auf ( HARDING 1996, 1999; LE CANN et al. 1997; SEGALES et al. 1997).
Auch Durchfälle, bei denen andere enteropathogene Erreger nicht nachgewiesen werden können, gehören zum klinischen Bild von PMWS. Sie sind typischerweise profus und
homogen braun, oft zeigen betroffenen Tiere zusätzlich eine Dehydratation ( HARDING 1996, 1999 ).
In seltenen Fällen weisen erkrankte Tiere einen Ikterus auf (DAFT et al. 1996; HARDING et al. 1996, 1999; LE CANN et al. 1997; SEGALES et al. 1997). In ersten Veröffentlichungen von HARDING (1996) ist weiterhin von selten auftretenden zentralnervösen Störungen in Fällen von PMWS die Rede, in neueren Publikationen desselben Autors wird dies nicht mehr erwähnt (HARDING 1999).
Nicht jedes erkrankte Tier muß all diese klinischen Anzeichen zeigen, aber in betroffenen Betrieben wurden diese Leitsymptome in unterschiedlicher Kombination und Ausprägung gewöhnlich über eine gewisse Zeitspanne beobachtet. Insbesondere die am häufigsten beobachteten Symptome Kümmern und Dyspnoe sollten, obwohl sie nicht pathognomonisch sind, Anlass dazu sein, PMWS differentialdiagnostisch in Betracht zu ziehen und weiterführende Untersuchungen zur Abklärung einzuleiten ( HARDING 1999 ).
Angaben über die Morbidität schwanken zwischen 1-60 Prozent ( HARDING 1996; CLARK 1997; DEL POZO 1999), wobei sie gewöhnlich gering ist. In betroffenen Herden sind die erkrankten Tiere oftmals diffus in der Population verteilt und nicht auf bestimmte Gruppen beschränkt (HARDING 1996). Die Letalität kann bei akuten Ausbrüchen bis zu 20 Prozent betragen (HARDING 1996; CLARK 1997), DOMINGO u. SEGALES (1999) berichten sogar über Letalitäten zwischen 50-90 Prozent.
Dabei können andere gleichzeitig auftretende virale und bakterielle Infektionen vermutlich für besonders hohe Verluste verantwortlich sein (DOMINGO u. SEGALES 1999).
Erkrankte Tiere sprechen gewöhnlich auf eine antibiotische Behandlung nicht an (HARDING 1996; SEGALES et al. 1997; DOMINGO u. SEGALES 1999).
2.6.1.2. Pathomorphologie
Makroskopische Befunde: Tiere mit PMWS zeigen in der Sektion zumeist vergrößerte inguinale Lymphknoten, oft liegt eine generalisierte Lymphadenopathie vor (LE CANN et al.
1997; CLARK u. HARDING 1998; KENNEDY et al. 1998; SEGALES 1999a). Dabei stellen sich diese Lymphknoten im Anschnitt homogen weißlich dar, gelegentlich haben sie auch einen großflächig nekrotisierenden Charakter mit weißlichen, z. T. zusammenfließenden Bezirken von unregelmäßiger Form oder mit gestauten Bezirken (SEGALES 1999a).
Die Lunge ist in der Regel nicht kollabiert, verfestigt oder gummiartig. Ihre Oberfläche ist fleckig und zeigt ein lobuläres Muster in verschiedenen Farbabstufungen über grau-bräunlich, gelb bis rosa (LE CANN 1997; CLARK u. HARDING 1998; SEGALES 1999a;).
Verdichtungen der apikalen Lappen durch bakterielle Sekundärinfektionen treten häufig auf (DOMINGO u. SEGALES 1999).
Weniger häufig findet man Ikterus, atrophische oder blasse Lebern, die mit hellen Flecken gemustert sei können, Magenulzera in der Pars oesophagea und vergrößerte und blasse Nieren, die weiß gefleckt sein können (CLARK u. HARDING 1998; SEGALES 1999a).
Gelegentlich soll auch eine vergrößerte fleischige Milz und wässriger Darminhalt beobachtet werden können (CLARK u. HARDING 1998).
Mikroskopische Befunde:
Lymphknoten: In den Lymphorganen ( Lymphknoten, Tonsillen und Peyerschen Platten) sind unterschiedliche Grade an Depletion von Lymphozyten mit generalisiertem Verschwinden von Lymphfollikeln festzustellen (CLARK 1997; KENNEDY et al. 1998;
SEGALES 1999a). Weiterhin wird eine Infiltration von histiozytären Zellen von unterschiedlicher Intensität beobachtet, lokalisiert besonders in den subkapsulären und Mark- Sinus und in den Lymphfollikeln. In schweren Fällen erstreckt sie sich praktisch über das gesamte Parenchym des Organs. Zwischen den Entzündungszellen stellt man häufig das Vorhandensein von multinukleären Synzytien fest, sowohl in den subkapsulären und Mark- Sinus als auch in den Resten der Lymphfollikel. Im Zytoplasma histiozytärer Zellen findet man basophil anfärbbare sphärische Einschlüsse variabler Anzahl und Durchmessers (CLARK 1997; SEGALES 1999a).
Milz: In der Milz sind die Veränderungen in der Regel weniger deutlich als in den anderen Lymphorganen. Man beobachtet nur einen unterschiedliche Grad an lymphozytärer Depletion der periarteriolären Lymphozytenscheiden, manchmal mit Infiltration von Histiozyten und sehr selten mit Bildung von Synzitien. Gelegentlich sind die Veränderungen in diesem Organ nekrotisierend. In diesen Zonen findet man gewöhnlich Thrombose und Entzündung von Blutgefäßen , die wahrscheinlich die Ursache der Nekrose sind (SEGALES 1999a).
Lunge: Die Lunge zeigt gewöhnlich eine interstitielle Pneumonie sehr variabler Intensität, generell von subakuten Charakter (SEGALES 1999a). Die Veränderungen sind charakterisiert durch Verbreiterung der Alveolarsepten aufgrund der Infiltration von mononukleären Entzündungszellen ( besonders Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen), die man öfter auch in der Umgebung von Bronchien und Bronchiolen antrifft (CLARK 1997; SEGALES 1999a). Weniger häufig findet man Entzündungszellen und Synzitien in den Alveolarlumen.
Wenn eine kranio-ventrale Lungenverfestigung auftritt, handelt es sich um eine katarrhalisch- eitrige Bronchopneumonie, mit polymorphkernigen Neutrophilen im Inneren der Bronchien, Bronchiolen und Alveolen, ausgelöst durch eine bakterielle Sekundärinfektion (SEGALES
1999a). CLARK und HARDING (1998) berichten außerdem über progressive Nekrose und Abschilferung von bronchialen und bronchiolären Epithelien, die zu Stenosen führen können.
Leber: Neben gesunden Lebern beobachtet man Läsionen sehr unterschiedlicher Intensität, von geringgradigen entzündlichen Infiltraten bis zu periportaler oder diffuser Entzündung und massivem Verlust von Leberzellen. In schweren Fällen treten Leberzellen mit Apoptose auf und unterschiedliche Grade des Verlusts der Organisation der Lebersinusoide. Die schwerste Leberveränderung besteht in unterschiedlichem Grad von periportaler Fibrose mit totalem Verlust der Organisation der Lebersinusoide (SEGALES 1999a; CLARK u. HARDING 1998).
Niere: Die Niere zeigt eine lympho-histiozytäre interstitielle Nephritis mit multifokaler Verteilung (SEGALES 1999a; CLARK 1997), oft kombiniert mit Vaskulitis und Lymphangitis. Dabei kann man kortikal eine tubuläre Atrophie bis hin zu regenerativer Hyperplasie beobachten. Das intertubuläre Bindegewebe ist ödematös mit fibroblastischer Proliferation (CLARK 1997). Die Intensität der Läsionen ist variabel von leichten, makroskopisch nicht sichtbaren Fällen, bis zu schweren Fällen, die denen entsprechen, bei denen man makroskopisch weißliche Flecken in der Nierenrinde findet (SEGALES 1999a).
CLARK u. HARDING (1998) beobachteten weiterhin gelegentlich eine nicht-suppurative Myokarditis, zerebrale Leptomeningitis und eine fokale azinäre Zellatrophie des Pankreas, verbunden mit Verlust von Zymogengranula und histiozytärer Zellinfiltration.
2.6.2 Weitere Krankheitsbilder, die mit einer PCV2- Infektion assoziiert werden
2.6.2.1. Porzines Dermatitis Nephropathie Syndrom (PDNS)
Klinik: Klinisches Leitsymptom beim Krankheitsbild PDNS sind die Hautveränderungen, die zu Beginn der Erkrankung oftmals nur aus kleinen roten Papeln im Perianal- und Flankenbereich bestehen, die sich schnell zu erythematösen Plaques und Hautblutungen vergrößern können und konfluieren und sich schließlich auch auf Abdomen, Thorax und Akren ausweiten (WHITE u. HIGGINS 1993; DROLET et al. 1997; DURAN et al. 1997;
SEGALES et al.1998a; THIBAULT et al. 1998). Bei geringgradig betroffenen Tieren können diese Hautveränderungen spontan wieder verschwinden, während bei chronisch erkrankten Tieren Krusten und Narben an den veränderten Hautbezirken beobachtet werden können ( SMITH et al. 1993; DURAN et al. 1997; SEGALES et al. 1998a; THIBAULT et al. 1998).
Akut erkrankte Tiere können weiterhin Anorexie, Bewegungsunlust und manchmal Fieber zeigen ( SMITH et al. 1993; DURAN et al. 1997; SEGALES et al. 1998a).
Die Erkrankung betrifft hauptsächlich Tiere in der Gewichtsklasse von 20 bis 65 kg (SEGALES et al. 1998a), wobei die Morbidität mit 1 - 2% sehr gering ist (SMITH et al. 1993;
THIBAULT et al. 1998; SEGALES et al. 1998a), die Letalität jedoch in Extremfällen bis zu 100% betragen soll ( SEGALES et al. 1998a). Auch hier sprechen erkrankte Tiere gewöhnlich nicht auf eine antibiotische Behandlung an. ( SMITH et al. 1993; SEGALES et al. 1998a).
Pathomorphologie:
Makroskopische Befunde:
Die Hautläsionen entsprechen der Beschreibung des klinischen Bildes. Die Nieren sind vergrößert, ödematös und zeigen Petechien an der Oberfläche (WHITE u. HIGGINS 1993;
SEGALES et al. 1998a, THOMSON et al. 1998). Weiterhin findet man hier ebenfalls eine generalisierte Vergrößerung der Lymphknoten, fehlenden Lungenkollaps (SEGALES et al.
1998a; THOMSON et al. 1998) und gelegentlich Magenulzera (WHITE u. HIGGINS 1993;
THOMSON et al. 1998).
Mikroskopische Befunde: In veränderten Hautbezirken findet man eine systemische nekrotisierende Vaskulitis, die oft mit fokalen dermalen Blutungen und Nekrosen der Epidermis verbunden ist (THOMSON et al. 1998; SEGALES et al.1998a; SEGALES 1999a).
Die Nieren zeigen eine diffuse fibrinöse oder exsudative Glomerulonephritis, die in chronischen Fällen in glomeruläre Sklerose, interstitielle Entzündung und tubuläre Atrophie übergehen kann (THOMSON et al. 1998; SEGALES et al. 1998a).
Die Veränderungen an Lymphknoten und Lunge sind identisch mit denen bei PMWS (SEGALES 1999a).
2.6.2.2. Proliferativ nekrotisierende Pneumonie (PNP)
Klinik: Die Diagnose kann nur postmortal gestellt werden, deshalb liegen spezielle klinische Beschreibungen von Fällen mit PNP nicht vor. Da diese spezielle Pneumonieform von vielen Autoren jedoch mit unter das Krankheitsbild PMWS eingeordnet wird (CLARK u.
HARDING 1998; KIUPEL et al. 1999), sind die dort bereits beschriebenen Symptome einer Atemwegserkrankung zu erwarten.
Pathomorphologie: Makroskopisch zeigen sich betroffene Lungen entweder diffus oder sublobulär in den kranialen und kaudalen Spitzenlappen grau-rot verfärbt. Gewöhnlich ist eine katarrhalische Bronchopneumonie in den kranioventralen Spitzenlappen zu beobachten (HINRICHS et al. 1999b).
Mikroskopische Veränderungen sind gekennzeichnet durch Nekrose von Alveolarepithelien und lymphohistiozytärer Infiltration in die Alveolarsepten (HINRICHS et al.1999b). Diese Veränderungen beobachteten auch CLARK u. HARDING (1998) und KIUPEL et al. (1999), ordneten sie aber unter die Veränderungen bei PMWS ein. Die Alveolarlumina der Lungen sind bei Tieren mit PNP mit einem proteinreichen Exsudat, Alveolarmakrophagen, nekrotischen Zellen und großen, multifokalen, irregulären basophilen Strukturen, die wie Überreste epithelialer Zellen aussehen, gefüllt. Chronische Fälle zeigen Bereiche mit fibroblastischen Proliferationen und Reepithelisierung der Alveolarwände (HINRICHS et al.
1999b).
2.6.1.3. Infektiöser kongenitaler Tremor
Klinik: Das Krankheitsbild des kongenitalen Tremors ist in seiner Ausprägung sehr variabel. Innerhalb eines Wurfes kann die Anzahl der betroffenen Ferkel sehr unterschiedlich sein (HINES u. LUKERT 1994). Bei Ferkeln mit starkem Tremor kann die Unfähigkeit zu saugen zum Tode führen, während Ferkel, die die erste Lebenswoche überleben, den Tremor meist bis zur 3. Lebenswoche verlieren. In Einzelfällen bleibt er jedoch über die ganze Mastperiode erhalten (HINES u. LUKERT 1994).
Der Tremor ist bilateral und betrifft die Skelettmuskel. Er läßt in Ruhephasen oder im Schlaf nach, kann aber durch externe Stimuli wie Lärm ausgelöst werden. Meist sind Würfe von neu eingegliederten Sauen in Herden betroffen (HINES u. LUKERT 1994).
Pathomorphologie: Makroskopisch sind bei Tieren mit kongenitalem Tremor keinerlei Veränderungen festzustellen. Mikroskopisch beobachtet man eine unvollständige Myelinisierung des Rückenmarks (HINES u. LUKERT 1994).
2.7. Diagnostische Verfahren
Grundsätzlich sollte die Diagnose PMWS erst dann gestellt werden, wenn klinische Symptomatik, charakteristische pathomorphologische Veränderungen und der Nachweis von PCV2 miteinander korrelieren.
Zum Nachweis von PCV2 bieten sich verschiedene Verfahren an, die nachfolgend beschrieben werden.
2.7.1. Genomnachweis
2.7.1.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Die PCR, die von MULLIS et al. (1986) entwickelt wurde, stellt eine Methode zur enzymatischen Vervielfältigung eines definierten DNA-Bereichs in vitro dar. Ausgegangen wird in der PCR in der Regel von einem Gemisch an doppelsträngiger DNA oder RNA, die die zu vermehrende Sequenz enthält, wobei RNA in einem ersten Schritt erst mittels des Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden muß.
Beim Vorliegen doppelsträngiger DNA wird diese zunächst bei 94°C in ihre Einzelstränge aufgetrennt. Zwei Oligonukleotide (Primer) (20-30 bp), die komplementär zu den Randsequenzen des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes sind, hybridisieren bei der für sie charakteristischen Temperatur (37-65°C) spezifisch mit den Zielsequenzen und dienen der DNA-Polymerase als Startpunkte. Dabei ist jeweils ein Primer zu einem der beiden Einzelstränge der Matrizen-DNA komplementär. Die DNA-Polymerase verlängert nun durch Einbau von Desoxyribonukleotidphosphaten (dNTPs) die Oligonukleotide in 5´-3´Richtung und synthetisiert die komplementären DNA-Stränge. Dies läuft bei der für die spezielle DNA- Polymerase optimalen Temperatur von 72°C ab. Im ersten Zyklus entstehen einseitig durch das 5´-Ende des entsprechenden Primers terminierte DNA-Stränge, die im nächsten Reaktionszyklus als Matrize für den anderen Primer dienen und zur Synthese von beidseitig terminierten Produkten führen. Durch mehrfache Wiederholung des Zyklus aus Denaturierung, Hybridisierung (Annealing) und Strangsynthese (Extension) kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung der spezifischen, beidseitig von den Oligonukleotiden flankierten DNA-Abschnitte, während die einseitig terminierten DNA-Stränge bei nur linearen Vermehrung im nicht detektierbaren Bereich bleiben (MULLIS et al. 1986; HAGEN-
MANN u. MANN 1990; LINZ u. DEGENHARDT 1990; EHRLICH et al. 1991; RAPLEY et al. 1992).
Der Nachweis der spezifischen Amplifikationsprodukte kann durch Größenvergleich mit einem Standart in der Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung oder durch Hybridisierung mit DNA-Sonden erfolgen (SYVÄNEN et al. 1988; LINZ u. DEGENHARDT 1990; MAHBUBANI u. BEJ 1994).
Der Vorteil der PCR liegt in der Schnelligkeit, der hohen Sensitivität und Spezifität des Nachweises von Krankheitserregern, deren in-vitro-Kultivierung schwierig, zeitaufwendig oder unverhältnismäßig teuer ist (HAGEN-MANN u. MANN 1990; PERSING 1993).
Minimale Mengen an Matrizen-DNA/RNA können noch in komplexen DNA-RNA- Gemischen nachgewiesen werden (PERSING 1993; MAHBUBANI u. BEJ 1994).
Die Anwendung der PCR in der medizinischen Diagnostik ist aber auch mit einer Reihe von Problemen verbunden. Da die PCR den Nachweis von einer sehr geringen Anzahl an Genomen pathogener Organismen sowie auch von nicht vermehrungsfähigen Organismen, die möglicherweise nicht zu einer Infektion des Tieres führen, ermöglicht, stellt sich die Frage nach der klinischen Relevanz der Ergebnisse. Ein weiteres Problem stellt die Inhibition der DNA-Polymerase durch Bestandteile in den klinischen Proben dar, die durch die Aufbereitung der Probe nicht entfernt worden sind. Hauptgrund für falsche Resultate ist aber sicher die Kontamination der Probe mit externer Matrizen-DNA. Diese kann durch Übertragung von Probe zu Probe, vor allem aber auch durch aerogene Übertragung von Amplifikationsprodukten erfolgen (PERSING u. CIMINO 1993). Zur Vermeidung und Erkennung von Kontaminationen sind eine Reihe von Vorsichtsmaßnahmen und Methoden zur Amplifikationsproduktinaktivierung beschrieben worden (KWOK u. HIGUCHI 1989;
ORREGO 1990; SARKER u. SOMMER 1990; NIENHAUS u. GEHRMANN 1991;
DRAGON et al. 1993; PERSING u. CIMINO 1993):
Die PCR findet heute in der PCV2-Diagnostik breite Anwendung. ALLAN et al. (1999b) beschrieben den Nachweis von PCV2 über die PCR bei Fällen von PMWS aus Dänemark, Spanien und Nordirland. Sie untersuchten diese Fälle mit einem PCV2-spezifischen Primerpaar (Amplifikat: 481bp), einem PCV1-spezifischen Primerpaar (Amplifikat: 347 bp) und einem Primerpaar, das sowohl bei PCV1 als auch bei PCV2 ein Amplifikat von 570 bp produziert. Hierbei wurde in allen Fällen PCV2 nachgewiesen, nicht jedoch PCV1.
In einer Feldstudie von LAROCHELLE et al. (1999) wurden 42 Fälle von PMWS mit PCV1- (Amplifikat: 349 bp) und PCV2 - (Amplifikat: 263 bp) spezifischen Primern über die PCR
untersucht. In 40 Fällen konnte PCV2 nachgewiesen werden, in einem Fall PCV1 und in einem Fall eine Doppelinfektion.
Übereinstimmend berichten die Autoren über den Nachweis von PCV2 über die PCR in einem weitem Spektrum von Organen, die alle lympatischen Gewebe, Lunge, Leber, Milz, Nieren und Pankreas beinhalten.
2.7.1.2. In-Situ-Hybridisierung
Die in-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Technik, mit der man DNA und/oder RNA mittels einer Sonde nachweisen kann, die ebenfalls aus Nukleinsäure besteht und komplementär zu der nachzuweisenden Genomsequenz ist. Durch eine radioaktive oder enzymatische Markierung der Sonde wird die Hybridisierung mittels einer Farbreaktion unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht. Gewöhnlich setzt man diese Technik an formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben ein.
MOROZOV et al. (1998) führte die ISH an verschiedenen Geweben von an PMWS erkrankten Tieren sowohl mit einer ´sense´ als auch mit einer ´antisense´ DNA-Sonde durch.
Hierbei zeigte die ´antisense´ DNA-Sonde eine vierfach höhere Sensitivität, da hiermit neben der doppelsträngigen replikativen Form von PCV2 auch die einzelsträngige native Form erkannt werden konnte.
Übereinstimmend wird von verschiedenen Autoren über den Nachweis von PCV bei Fällen von PMWS in einem weiten Spektrum von Organen, wie Lymphknoten, Tonsille, Milz, Leber, Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Herz und großem und kleinem Intestinum mittels ISH berichtet (ELLIS et al. 1998, MOROZOV et al. 1998, CHOI u. CHAE 1999, MC NEILLY et al. 1999 und ROSELL et al. 1999).
In lymphatischen Organen waren hauptsächlich Makrophagen und mononukleäre Zellen betroffen, aber auch in Enterozyten, Hepatozyten, Alveolarmakrophagen, renalen Tubulusepithelien und in kapillaren Endothelien des Herzens war PCV hauptsächlich im Zytoplasma der Zellen, seltener auch im Nukleus, nachweisbar.
Berücksichtigt werden muß bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Untersuchungen jedoch, daß in allen Studien DNA-Sonden auf der Basis von PCV1 verwendet wurden.
2.7.1. Immunhistochemie
Die Immunhistochemie stellt gegenüber der ISH eine sogar sensitivere Nachweismethode für PCV2 dar (MC NEILLY et al . 1999). Laut SORDEN et al. (1999) ist sie weiterhin schneller und billiger als die ISH und somit für die Routinediagnostik gebräuchlicher.
ELLIS et al. (1998, 2000), MC NEILLY et al. (1999), ROSELL et al. (1999) und SORDEN et al.(1999) wiesen PCV2 in Gewebeschnitten über einen indirekten Immunoperoxidase-Test (IIPT) nach, indem sie diese mit einem primären polyklonalen Kaninchen-PCV2-Antiserum inkubierten, welche in einem zweiten Schritt wiederum an biotinilysierte Anti-Kaninchen- Antikörper gebunden und mittels eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats sichtbar gemacht wurden.
2.7.2. Immunzytochemie
Da PCV2 auf der Mehrzahl der Schweine-Zelllinien nach Inokulation mit Serum- oder homogenisierten Gewebeproben betroffener Tiere isoliert werden kann, bieten sich für die Diagnostik weiterhin verschiedene Methoden der Immunzytochemie an. ALLAN et al. (1998) beschrieb einen Nachweis über den indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT). Er inkubierte inokulierte Zellkulturen mit einem Schweineserum, das Antikörper gegen PCV enthielt.
Daran wurden in einem zweiten Schritt Fluorescein-Isothiozyanat-konjugierte und gegen den ersten Antikörper gerichtete Kaninchenantikörper gekoppelt und diese Reaktion unter UV- Licht sichtbar gemacht. Einen ähnlichen IIFT beschreiben SORDEN et al. (1999). ELLIS et al. (1998) wiesen PCV2 immunzytochemisch über die bereits im Abschnitt Immunhistochemie beschriebene Methode nach.
2.7.3. Nachweis von Antikörpern
Bis vor kurzen standen für den Nachweis von PCV2-Antikörpern lediglich die bereits beschriebenen Methoden des IIFTs und IIPTs zur Verfügung (ALLAN et al. 1998; ELLIS et al. 1998, 2000; MC NEILLY et al. 1999; ROSELL et al. 1999 und SORDEN et al. 1999), wobei hier eine definierte, mit PCV2 infizierte Zellkultur mit dem zu untersuchenden Serum inkubiert wurde. Vorhandene PCV2-Antikörper wurden in einem zweiten Schritt an markierte, gegen sie gerichtete Antikörper gebunden und über die beschriebenen Farbreaktionen sichtbar gemacht.
Für umfangreichere serologische Untersuchungen sind diese Methoden jedoch nicht geeignet.
Ein jüngst entwickelter PCV2-spezifischer Antigen-capture-ELISA soll hierfür jedoch in nächster Zeit verfügbar sein (zitiert nach ALLAN u. ELLIS 2000).
