Grundsätzlich sollte die Diagnose PMWS erst dann gestellt werden, wenn klinische Symptomatik, charakteristische pathomorphologische Veränderungen und der Nachweis von PCV2 miteinander korrelieren.
Zum Nachweis von PCV2 bieten sich verschiedene Verfahren an, die nachfolgend beschrieben werden.
2.7.1. Genomnachweis
2.7.1.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Die PCR, die von MULLIS et al. (1986) entwickelt wurde, stellt eine Methode zur enzymatischen Vervielfältigung eines definierten DNA-Bereichs in vitro dar. Ausgegangen wird in der PCR in der Regel von einem Gemisch an doppelsträngiger DNA oder RNA, die die zu vermehrende Sequenz enthält, wobei RNA in einem ersten Schritt erst mittels des Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden muß.
Beim Vorliegen doppelsträngiger DNA wird diese zunächst bei 94°C in ihre Einzelstränge aufgetrennt. Zwei Oligonukleotide (Primer) (20-30 bp), die komplementär zu den Randsequenzen des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes sind, hybridisieren bei der für sie charakteristischen Temperatur (37-65°C) spezifisch mit den Zielsequenzen und dienen der DNA-Polymerase als Startpunkte. Dabei ist jeweils ein Primer zu einem der beiden Einzelstränge der Matrizen-DNA komplementär. Die DNA-Polymerase verlängert nun durch Einbau von Desoxyribonukleotidphosphaten (dNTPs) die Oligonukleotide in 5´-3´Richtung und synthetisiert die komplementären Stränge. Dies läuft bei der für die spezielle DNA-Polymerase optimalen Temperatur von 72°C ab. Im ersten Zyklus entstehen einseitig durch das 5´-Ende des entsprechenden Primers terminierte DNA-Stränge, die im nächsten Reaktionszyklus als Matrize für den anderen Primer dienen und zur Synthese von beidseitig terminierten Produkten führen. Durch mehrfache Wiederholung des Zyklus aus Denaturierung, Hybridisierung (Annealing) und Strangsynthese (Extension) kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung der spezifischen, beidseitig von den Oligonukleotiden flankierten DNA-Abschnitte, während die einseitig terminierten DNA-Stränge bei nur linearen Vermehrung im nicht detektierbaren Bereich bleiben (MULLIS et al. 1986;
HAGEN-MANN u. HAGEN-MANN 1990; LINZ u. DEGENHARDT 1990; EHRLICH et al. 1991; RAPLEY et al. 1992).
Der Nachweis der spezifischen Amplifikationsprodukte kann durch Größenvergleich mit einem Standart in der Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung oder durch Hybridisierung mit DNA-Sonden erfolgen (SYVÄNEN et al. 1988; LINZ u. DEGENHARDT 1990; MAHBUBANI u. BEJ 1994).
Der Vorteil der PCR liegt in der Schnelligkeit, der hohen Sensitivität und Spezifität des Nachweises von Krankheitserregern, deren in-vitro-Kultivierung schwierig, zeitaufwendig oder unverhältnismäßig teuer ist (HAGEN-MANN u. MANN 1990; PERSING 1993).
Minimale Mengen an Matrizen-DNA/RNA können noch in komplexen DNA-RNA-Gemischen nachgewiesen werden (PERSING 1993; MAHBUBANI u. BEJ 1994).
Die Anwendung der PCR in der medizinischen Diagnostik ist aber auch mit einer Reihe von Problemen verbunden. Da die PCR den Nachweis von einer sehr geringen Anzahl an Genomen pathogener Organismen sowie auch von nicht vermehrungsfähigen Organismen, die möglicherweise nicht zu einer Infektion des Tieres führen, ermöglicht, stellt sich die Frage nach der klinischen Relevanz der Ergebnisse. Ein weiteres Problem stellt die Inhibition der DNA-Polymerase durch Bestandteile in den klinischen Proben dar, die durch die Aufbereitung der Probe nicht entfernt worden sind. Hauptgrund für falsche Resultate ist aber sicher die Kontamination der Probe mit externer Matrizen-DNA. Diese kann durch Übertragung von Probe zu Probe, vor allem aber auch durch aerogene Übertragung von Amplifikationsprodukten erfolgen (PERSING u. CIMINO 1993). Zur Vermeidung und Erkennung von Kontaminationen sind eine Reihe von Vorsichtsmaßnahmen und Methoden zur Amplifikationsproduktinaktivierung beschrieben worden (KWOK u. HIGUCHI 1989;
ORREGO 1990; SARKER u. SOMMER 1990; NIENHAUS u. GEHRMANN 1991;
DRAGON et al. 1993; PERSING u. CIMINO 1993):
Die PCR findet heute in der PCV2-Diagnostik breite Anwendung. ALLAN et al. (1999b) beschrieben den Nachweis von PCV2 über die PCR bei Fällen von PMWS aus Dänemark, Spanien und Nordirland. Sie untersuchten diese Fälle mit einem PCV2-spezifischen Primerpaar (Amplifikat: 481bp), einem PCV1-spezifischen Primerpaar (Amplifikat: 347 bp) und einem Primerpaar, das sowohl bei PCV1 als auch bei PCV2 ein Amplifikat von 570 bp produziert. Hierbei wurde in allen Fällen PCV2 nachgewiesen, nicht jedoch PCV1.
In einer Feldstudie von LAROCHELLE et al. (1999) wurden 42 Fälle von PMWS mit PCV1- (Amplifikat: 349 bp) und PCV2 - (Amplifikat: 263 bp) spezifischen Primern über die PCR
untersucht. In 40 Fällen konnte PCV2 nachgewiesen werden, in einem Fall PCV1 und in einem Fall eine Doppelinfektion.
Übereinstimmend berichten die Autoren über den Nachweis von PCV2 über die PCR in einem weitem Spektrum von Organen, die alle lympatischen Gewebe, Lunge, Leber, Milz, Nieren und Pankreas beinhalten.
2.7.1.2. In-Situ-Hybridisierung
Die in-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Technik, mit der man DNA und/oder RNA mittels einer Sonde nachweisen kann, die ebenfalls aus Nukleinsäure besteht und komplementär zu der nachzuweisenden Genomsequenz ist. Durch eine radioaktive oder enzymatische Markierung der Sonde wird die Hybridisierung mittels einer Farbreaktion unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht. Gewöhnlich setzt man diese Technik an formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben ein.
MOROZOV et al. (1998) führte die ISH an verschiedenen Geweben von an PMWS erkrankten Tieren sowohl mit einer ´sense´ als auch mit einer ´antisense´ DNA-Sonde durch.
Hierbei zeigte die ´antisense´ DNA-Sonde eine vierfach höhere Sensitivität, da hiermit neben der doppelsträngigen replikativen Form von PCV2 auch die einzelsträngige native Form erkannt werden konnte.
Übereinstimmend wird von verschiedenen Autoren über den Nachweis von PCV bei Fällen von PMWS in einem weiten Spektrum von Organen, wie Lymphknoten, Tonsille, Milz, Leber, Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Herz und großem und kleinem Intestinum mittels ISH berichtet (ELLIS et al. 1998, MOROZOV et al. 1998, CHOI u. CHAE 1999, MC NEILLY et al. 1999 und ROSELL et al. 1999).
In lymphatischen Organen waren hauptsächlich Makrophagen und mononukleäre Zellen betroffen, aber auch in Enterozyten, Hepatozyten, Alveolarmakrophagen, renalen Tubulusepithelien und in kapillaren Endothelien des Herzens war PCV hauptsächlich im Zytoplasma der Zellen, seltener auch im Nukleus, nachweisbar.
Berücksichtigt werden muß bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Untersuchungen jedoch, daß in allen Studien DNA-Sonden auf der Basis von PCV1 verwendet wurden.
2.7.1. Immunhistochemie
Die Immunhistochemie stellt gegenüber der ISH eine sogar sensitivere Nachweismethode für PCV2 dar (MC NEILLY et al . 1999). Laut SORDEN et al. (1999) ist sie weiterhin schneller und billiger als die ISH und somit für die Routinediagnostik gebräuchlicher.
ELLIS et al. (1998, 2000), MC NEILLY et al. (1999), ROSELL et al. (1999) und SORDEN et al.(1999) wiesen PCV2 in Gewebeschnitten über einen indirekten Immunoperoxidase-Test (IIPT) nach, indem sie diese mit einem primären polyklonalen Kaninchen-PCV2-Antiserum inkubierten, welche in einem zweiten Schritt wiederum an biotinilysierte Anti-Kaninchen-Antikörper gebunden und mittels eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats sichtbar gemacht wurden.
2.7.2. Immunzytochemie
Da PCV2 auf der Mehrzahl der Schweine-Zelllinien nach Inokulation mit Serum- oder homogenisierten Gewebeproben betroffener Tiere isoliert werden kann, bieten sich für die Diagnostik weiterhin verschiedene Methoden der Immunzytochemie an. ALLAN et al. (1998) beschrieb einen Nachweis über den indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT). Er inkubierte inokulierte Zellkulturen mit einem Schweineserum, das Antikörper gegen PCV enthielt.
Daran wurden in einem zweiten Schritt Fluorescein-Isothiozyanat-konjugierte und gegen den ersten Antikörper gerichtete Kaninchenantikörper gekoppelt und diese Reaktion unter UV-Licht sichtbar gemacht. Einen ähnlichen IIFT beschreiben SORDEN et al. (1999). ELLIS et al. (1998) wiesen PCV2 immunzytochemisch über die bereits im Abschnitt Immunhistochemie beschriebene Methode nach.
2.7.3. Nachweis von Antikörpern
Bis vor kurzen standen für den Nachweis von PCV2-Antikörpern lediglich die bereits beschriebenen Methoden des IIFTs und IIPTs zur Verfügung (ALLAN et al. 1998; ELLIS et al. 1998, 2000; MC NEILLY et al. 1999; ROSELL et al. 1999 und SORDEN et al. 1999), wobei hier eine definierte, mit PCV2 infizierte Zellkultur mit dem zu untersuchenden Serum inkubiert wurde. Vorhandene PCV2-Antikörper wurden in einem zweiten Schritt an markierte, gegen sie gerichtete Antikörper gebunden und über die beschriebenen Farbreaktionen sichtbar gemacht.
Für umfangreichere serologische Untersuchungen sind diese Methoden jedoch nicht geeignet.
Ein jüngst entwickelter PCV2-spezifischer Antigen-capture-ELISA soll hierfür jedoch in nächster Zeit verfügbar sein (zitiert nach ALLAN u. ELLIS 2000).