Oxidationswirkung von Kaliumhexacyanoferrat im Vergleich zu Bromcyan

Abb.78 a: Schwein 1 h p.m. mit KHexa (n=6) Abb.78 b: Schwein 1 h p.m. mit BrCN (n=6)

In den Abbildungen 78 a und b wurde dieselbe Probe gleichermaßen nach der LFGB § 64 Methode aufbereitet (Kap. 3.6.), anschließend in zwei Aliquots geteilt und der eine Teil mit Bromcyan und der zweite Teil mit alkalischer Kaliumhexacyanoferrat-Lösung nach der

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LFGB § 64-Methode oxidiert. Beide Proben wurden über das neue gekoppelte Festphasen-system (Kap. 3.6.4.) gegeben, um die HPLC-Säule zu schonen, mit ACN/Phosphatpuffer eluiert und in das HPLC-System auf eine LiChrospher C-18-Säule injiziert. Zu berücksich-tigen ist die umgekehrte Retentionsreihenfolge der HPLC-Säule (Abb. 78 a). Die Abbildun-gen 78 a und 78 b zeiAbbildun-gen einen deutlichen Unterschied in der Oxidationswirkung von Kalium-hexacyanoferrat im Vergleich zu Bromcyan. In Abbildung 78 a lässt sich erkennen, dass die Oxidation mit alkalischer Kaliumhexacyanoferrat-Lösung nicht vollständig stattgefunden hat.

Es sind Matrixbestandteile und Anteile von Thiamindiphosphat vorhanden, die sehr wahrscheinlich das Thiamin während der Oxidation maskieren. Quantitativ sind hier nur 58,9

% des Gesamtthiamingehaltes im Gegensatz zur Oxidation mit Bromcyan wiederzufinden. Zu berücksichtigen ist die umgekehrte Retentionsreihenfolge. Bei ca. 3,5 bis 4 Minuten ist noch deutlich nicht umgesetztes Thiamindiphosphat zu erkennen, welches nicht vollständig mit Kaliumhexacyanoferrat umgesetzt und zu Thiochrom oxidiert wird. In Abbildung 78 b dagegen ist nur noch ein geringer Matrixanteil vorhanden. Peaks von TDP sind in dem Matrixhügel nicht mehr zu erkennen. Da es sich um Aliquots derselben Probe handelt, scheint Bromcyan somit nicht nur eine Oxidationswirkung zu besitzen, sondern auch zur weiteren Freisetzung von Thiamin aus der Probenmatrix beizutragen.

4.4.3. Gesamtthiamingehaltsbestimmung nach LFGB § 64 in Schweinefleisch im Vergleich zur Methode mit Trichloressigsäure

Es hat sich gezeigt, dass nach den Angaben der LFGB-Methode und auch nach der Methode von RETTENMAIER et al. (1979) die Spaltung der Thiaminphosphatester im eiweißreichen Produkt wie frisches Schweinefleisch nicht vollständig verläuft. Die Angaben der einzusetzenden Enzyme bzw. deren Menge, wie Takadiastase (100 mg/g Probe) reichen nicht aus, um die gesamten Phosphate abzuspalten und freies Thiamin für die Bestimmung vorliegen zu haben. Desweiteren ist die Oxidation mit Kaliumhexacyanoferrat im Vergleich zu Bromcyan ebenfalls nicht ausreichend. Daher wurde die Methode modifiziert, um bessere Ergebnisse zu erhalten.

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Die Abbildungen 79 und 80 zeigen die gleiche Fleischprobe (Schwein 1 h p.m.) nach unter-schiedlicher Konzentration an verschiedenen Enzymzusätzen. In Abbildung 79 sind mit Zu-satz an Claradiastase noch alle Thiaminphosphate deutlich zu erkennen, trotz eines Auf-schlussverfahrens mit 0,1 molarer Salzsäure, 30 Minuten bei 121 °C und anschließender en-zymatischer Inkubation von 20 Stunden bei 37 - 38 °C abgedunkelt im Wasserbad. Inkuba-tionsversuche mit einer höheren Temperatur von 42 °C mit einer kürzeren Reaktionszeit von 3 h zeigte deutlich schlechtere Ergebnisse. Das nach der LFGB-Methode verwendete Enzym Takadiastase zeigte nicht die erwartete enzymatische Funktion und wurde daher durch Claradiastase ersetzt, womit eine deutlich verbesserte Dephosphorylierung herbei geführt wurde. Die nach LFGB § 64 und RETTENMAIER et al. (1979) angegebenen Konzentra-tionen der Claradiastase reichten nicht aus und wurden daher erhöht. Die Claradiastase zeigte im Blindwert kein Vorhandensein von Thiamin oder Thiaminphosphaten, so dass das Enzym die Bestimmung des Thiamingesamtgehaltes nicht beeinflusst. Auch eine erhöhte Konzentration an Claradiastase ergab keine vollständige Abspaltung der Phosphate, so dass zusätzlich saure Phosphatase in unterschiedlichen Konzentrationen pro 5 g Fleischeinwaage zugesetzt wurde. Um zusätzlich Thiamin aus der Proteinbindung freizusetzen wurde in unterschiedlichen Konzentrationen Pepsin und auch Papain der Probe zugesetzt. Der pH-

Abb. 79: Schwein 1h p.m. nach LFGB-Methode mit nur Claradiastase als Enzym,

noch alle Phosphate vorhanden Inkubationszeit 20 h, 38 °C

Abb. 80: Schwein 1h p.m. nach LFGB-Methode mit Claradiastase /geringer Zusatz an saurer Phosphatase, noch nichtausreichend, noch TMP vorhanden, Inkubationszeit 20 h, 38 °C

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Wert für die optimale Enzymaktivität wurde bei der jeweiligen Untersuchung mit dem ent-sprechenden Enzymgemisch berücksichtigt und entsprechend eingestellt. Die verschiedenen Enzymgemische sind im Anhang 8.4. in Tabelle 64 aufgeführt. Um einen direkten Vergleich der unterschiedlichen Methoden zu erhalten, wurde auch das HPLC-System mit Gradienten-system aus Kapitel 3.8.1. verwendet, in dem auch die frischen Schweinefleischproben gemessen wurden.

Diese Optimierung führte zu einer verbesserten Freisetzung von Thiamin und damit zu verbesserten Ergebnissen (Kap. 4.4.1., Tab. 14). Bei einem Messzeitpunkt von 0 h (30 min p.m.) konnte ein Thiamingesamtgehalt mit der Oxidation von BrCN und optimierten Enzymeinsatz von ca. 70 % des mit dem nach POEL (2008) ermittelten Gehaltes an Gesamtthiamin in Schweinefleisch ermittelt werden. Die Untersuchung mit Kaliumhexacyanoferrat führte nur zu einem ermittelten Gehalt von ca. 25 % des zugrunde liegenden Ausgangswertes. Bei dem Messzeitpunkt nach 6 Stunden konnten bereits über 90

% des Ausgangswertes mit BrCN ermittelt werden. Nach weiteren Messintervallen nach 24, 48 und 72 Stunden konnten sogar leicht höhere Thiamingehalte im Vergleich zur Methode nach Poel in derselben Schweinefleischprobe ermittelt werden. Nach 24 Stunden konnten bereits 7 %, nach einem Messzeitpunkt von 48 und 72 Stunden bis zu 70 % mehr Thiamin im Vergleich zur Ausgangsprobe ermittelt werden.

Tab. 64: Enzymkombinationen in Schweinefleischproben

Enzym

EV= Enzymavariation; (-) schlecht, (-/+) mittelmäßig, (++) gut, (+++) sehr gut

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4.5. Stabilität des derivatisierten Thiamins und Thiaminphosphaten inklusive Thiamintetraphosphat/Adenosinthiamintriphosphat (AThTP)

Durch mehrmaliges Injizieren der ein und derselben derivatisierten Probe über einen Zeitraum von 10 Monaten hat sich gezeigt, dass Thiamintetraphosphat bzw. Adenosinthiamintriphos-phat, welches sonst durch schnellen Abbau gekennzeichnet ist, sich als Thiochromtetraphos-phat/AThTP in der Lösung stabil verhält. Die Probe wurde über diesen Zeitraum bei 4 °C dunkel im Kühlschrank aufbewahrt und zu verschiedenen Zeitpunkten als qualitative Vergleichssubstanz in das HPLC-System injiziert. Selbst nach einem Jahr bei Lagerung im Kühlschrank waren noch alle Thiochromphosphate in der Lösung vorhanden (Abb. 81).

Abb. 81: Tetra-Mix vom 31.3.2008, gemessen 01/2009