Analytische Methoden mittels HPLC

Die HPLC ist zweifellos die am häufigsten verwendete analytische Trenntechnik. Kombina-tionen verschiedenartiger stationärer und mobiler Phasen werden angewendet. Die HPLC hat sich in den späten 60er Jahren aus der Säulenchromatographie entwickelt, als man erkannte, dass die Trennleistung einer Säule mit abnehmender Korngröße der stationären Phase zu-nimmt (FALBE u. REGITZ, 1992). Daher wird bei der HPLC mit erheblich feinerem

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al mit einer Korngröße von 3 - 10 µm gearbeitet und erreicht damit eine deutlich höhere Trennleistung. Die geringe Korngröße der Trennmaterialien erfordert allerdings die Anwen-dung hoher Drücke, was unter Umständen einen negativen Einfluss auf die verwendeten Säulen hat und deren Haltbarkeit deutlich verkürzt (SKOOG u. LEARY, 1996; SCHWEDT, 2004).

Als stationäre Phase kommen häufig C-18 Säulen zur Anwendung (KIMURA et al., 1982;

BONTEMPS et al., 1984; VANDERSLICE u. HUANG, 1986). Das charakteristische Packungsmaterial für die Flüssigkeitschromatographie besteht aus porösen Mikroteilchen mit Durchmessern von 3 - 10 µm.

Abb. 39: Kieselgelteilchen Abb. 40: Lichrospher (Knauer)

Die Teilchen bestehen am häufigsten aus Kieselgel (Abb. 39 und 40). Größere Teilchen mit einheitlichen Durchmessern von weniger als 1 µm werden durch Agglomeration von feinen Teilchen hergestellt. Die Kieselgelteilchen werden anschließend meist mit dünnen organi-schen Filmen beschichtet, die chemisch oder physikalisch an der Oberfläche gebunden wer-den (SKOOG u. LEARY, 1996). Mit Hilfe der Reversed-phase-HPLC lassen sich heute etwa zwei Drittel aller flüssigkeitschromatographisch relevanten Trennaufgaben lösen, so dass der RP-HPLC die größte Bedeutung in der Praxis zukommt. Die Bedeutung der RP-HPLC ist auch auf die Tatsache zurückzuführen, dass sich Optimierungen der mobilen Phase in den meisten Fällen über die Variation des Wassergehaltes in einem polaren organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril durchführen lassen (SKOOG u. LEARY, 1996;

SCHWEDT, 2004).

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Eine Reversed-phase-(RP- oder Umkehrphasen)-Chromatographie liegt immer dann vor, wenn die stationäre Phase weniger polar ist als die mobile Phase. Die chemisch an eine Kie-selgeloberfläche gebundenen Gruppen (Abb. 41) werden auch als Kohlenwasserstoffbürsten bezeichnet. Die Bürstenphase bildet eine modifizierte Oberfläche, an der eine physikalische Adsorption erfolgt. Die Moleküle der mobilen Phase treten dann, um die Zentren an der orga-nischen Oberfläche, in Konkurrenz mit den Molekülen des Analyten. Die Kettenlänge der Alkylgruppen hat ebenfalls einen Einfluss auf die Trennleistung einer Säule. Säulen mit längerkettigen Phasen retardieren länger und stärker. Längerkettige Phasen erlauben außer-dem größere Probenmengen (SKOOG u. LEARY, 1996). Je unpolarer die Stoffe sind, desto länger werden sie in RP-Systemen an der unpolaren (hydrophoben) stationären Phase zurück-gehalten. Bei der Normalphasen-HPLC lassen sich die Kieselgel-OH-Gruppen auch mit ande-ren funktionellen organischen Gruppen verbinden (Abb. 42), wobei organische Molekülgrup-pen gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt werden sollen. Auf diese Weise können auch Amino-Gruppen an Kieselgel gebunden werden. Solche Phasen haben den Vorteil, dass Was-serspuren in den organischen Lösungsmitteln, im Unterschied zur Adsorptions-Chromatographie an nichtmodifiziertem Kieselgel, keine Aktivitätsänderung zeigen (SCHWEDT, 2004).

Die am häufigsten verwendeten Trennsäulen sind 25 cm lang, mit einem Innendurchmesser von 4,6 mm und sind mit 5 µm-Teilchen gefüllt. Um die Leistungsdauer der Trennsäule zu steigern bzw. zu erhalten, wird eine Vorsäule, mit gleichem Packmaterial der Trennsäule, zur Entfernung fester Teilchen und Verunreinigungen in Lösungsmitteln vor die Trennsäule geschaltet. Weiterhin dient die Vorsäule in der Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie dazu, die mobile Phase mit der stationären Phase zu sättigen, um Verluste des Lösungsmittels aus der Trennsäule zu verringern (SKOOG u. LEARY, 1992).

Si-O-CH2-CH2-NH2

Si-O-CH2-CH2-NH2

Si-O-CH2-CH2-NH2

Kieselgelteilchen

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Die Wahl der mobilen Phase hängt von der Wasserlöslichkeit der zu analysierenden Substanz ab. Erfolgt die Elution mit nur einem Lösungsmittel gleichbleibender Zusammensetzung, so spricht man von einer isokratischen Elution. Durch eine Gradientenelution wird häufig die Trennleistung deutlich verbessert (LEE et al., 1991; SKOOG u. LEARY, 1996). Hierbei werden zwei oder mehr Lösungsmittel unterschiedlichster Polarität verwendet. Nach Beginn der Elution, wird das Volumenverhältnis der Lösungsmittel im Eluenten entweder sukzessiv oder kontinuierlich geändert (GOTTWALD u. PUFF, 1987, SKOOG u. LEARY, 1996).

Moderne HPLC-Geräte sind inzwischen meist mit Gradientenmischern ausgestattet, die aus zwei oder mehr Lösungsmittelgefäßen, die Eluenten durch regulierbarer Pumpen mit stetig ändernder Zusammensetzung und Geschwindigkeit (Kap. 3.8.1.), in eine Mischkammer (Abb.

49) einleiten. Die Zusammensetzung der Lösungsmittel (Kap. 3.8.1.) kann dann linear oder exponentiell entsprechend mit der Zeit verändert werden (Abb. 50) (SKOOG u. LEARY, 1996; SCHWEDT, 2004).

Bei der RP-HPLC wird die Elution mit Hilfe einer stark polaren mobilen Phase wie z. B. einer wässrigen Lösung herbeigeführt, die verschiedene Konzentrationen an Lösungsmitteln wie Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran enthalten kann. Die stationäre Phase ist unpolar (hydrophob). Hierbei muss darauf geachtet werden, dass pH-Werte nicht höher als 7,5 eingestellt werden, da sonst das Siloxan hydrolysiert wird und zu einer Zerstörung des Säulenmaterials führen kann (SKOOG u. LEARY, 1996; SCHWEDT, 2004).

Bei der Normalphasen-HPLC (Abb. 42) wird die am geringsten polare Komponente zuerst eluiert, da sie sich in der hydrophoben mobilen Phase am leichtesten löst. Die Elutionszeit wird geringer, sobald die Polarität der mobilen Phase erhöht wird. Im Gegensatz dazu erscheint bei der RP-HPLC die polarste Komponente zuerst, und die Erhöhung der Polarität der mobilen Phase hat eine Erhöhung der Elutionszeit zur Folge (SCHWEDT, 2004).

Die RP-Phasen werden in der Thiaminanalytik häufig zur gleichzeitigen Bestimmung weiterer wasserlöslicher Vitamine, wie Riboflavin, Pyridoxal oder Niacin eingesetzt (ANG u. MOSE-LEY, 1980; BARNA u. DWORSCHAK, 1994; NDAW et al., 2000; VIDAL-VALVERDE u.

RECHE, 1990). Die Elution der Thiaminderivate erfolgt aufgrund der Polarität in der Reihen-folge Thiamintriphosphat, Thiamindiphosphat, Thiaminmonophosphat und Thiamin

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(SANEMORI et al., 1980), was zur Folge haben kann, dass bereits Thiamintriphosphat im Totvolumen (Abb. 78) eluiert und daher nicht erfasst werden kann.

Alternativ kann nach BATIFOULIER et al. (2005a) anstelle einer C-18-Phase eine Amid-C-16-Phase eingesetzt werden (Abb. 43). Der Vorteil besteht in der Vermeidung der Interaktio-nen der Vitamine mit den Silanolgruppen der Silikasäulen im Vergleich zu IoInteraktio-nenpaarvertei- Ionenpaarvertei-lungschromatographie. Auch die Lebensdauer der Säulen ist verbessert, durch Auftrag gerin-gerer Analysemengen (VINAS et al., 2001, 2003a, 2003b). Zu berücksichtigen ist die umge-kehrte Retentionsreihenfolge, die möglicherweise dazu führt, dass eventuell vorhandenes Thiamintriphosphat im Totraumvolumen verloren geht und nicht mehr erfasst wird.

Abb. 43: Chromatogramm einer Thiamin-Standardlösung. Auftrennung auf einer RP-Amid-C16 Säule, mobile Phase 50 mM Phosphatpuffer/Methanol (80:20, v/v) isokratisch, pH 6 (BATIFOULIER et al., 2005a)

Obwohl viele Ansätze für eine Trennung des Thiamins und seiner Phosphorsäureester existieren, konnte bislang durch keine Methode eine gute Trennung aus komplizierter Probenmatrix erreicht werden. Bettendorf et al. (1991) verwenden für ihre Analysen eine Polystyrene-Divinylbenzen (PS-DVB) Reversed-Phase- Säule (Hamilton PRP^®-1). Der Vorteil dieser Säule besteht in der pH-Stabilität in einem Bereich von pH 1 bis pH 13.

TDP TMP T

Totraum- volumen

71 3. Material und Methoden

3.1. Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien sind im Anhang im Kapitel 8.2. tabellarisch mit Angabe der Bezugsquelle und des Reinheitsgrades aufgeführt.

3.2. Untersuchungsmaterial 3.2.1. Getreide

Bei den zu untersuchenden Getreideproben handelte es sich ausschließlich um Getreide der Saison 2007/2008 von Feldern aus der Region Hannover. Bei den Getreideproben handelte es sich um die Arten Hafer (Avena sativa, Dominik), Roggen (Secale cereale, Agronom), Weizen (Triticum aestivum, Dekan), Gerste (Hordeum vulgare, Merlot) und Triticale (Triticosecale, SW Talentro), die zu unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten, immer morgens früh an derselben Stelle des entsprechenden Feldes, genommen wurden. Nach den Probenahmen wurde das Getreide dunkel und in eine mit Kühlakkus versehene isolierte Kühltasche verbracht und zum Institut transportiert. Unmittelbar nach dem Eintreffen im Institut wurde die Probe bearbeitet oder für weitere Untersuchungen bei minus 60 °C zwischengelagert. Für die Bestimmung des Thiamins und der Thiaminphosphate wurde beim Getreide nur das sich entwickelnde Getreidekorn zu unterschiedlichen Zeitpunkten und damit zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien (von Beginn des Ährenschiebens EC 51 bis zur Vollreife EC 89; Kap. 2.8.2., Tab. 7) untersucht. Die klimatischen Bedingungen blieben bei der Untersuchung unberücksichtigt.

3.2.2. Hefen

Die Hefeproben stammen, bis auf die frische Bierhefe, aus dem ortsansässigen Supermarkt bzw. der Drogerie und wurden dort käuflich erworben. Als Untersuchungsmaterial für Back-hefe wurde die frische Hefe in gepresster Form als Würfel, mit einem durchschnittlichen

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Trockensubstanzgehalt von 32 %, (Kap. 8.6., Tab. 67) der Firma Deutsche Hefewerke mit einem Mindesthaltbarkeitsdatum (MHD) von 3 Wochen verwendet.

Bei den Trockenbackhefen, mit einem durchschnittlichen Trockensubstanzgehalt von 95 % (Kap. 8.6., Tab. 68 u. 69), handelte es sich um Proben der Firmen RUF und Dr. Oetker mit einem MHD von einem Jahr. Die Bierhefeflocken (TS ca. 93 %) waren von der Firma Biolabor (Kap. 8.6, Tab. 70 u. 71) mit ebenfalls einem MHD von einem Jahr und die frischen Bierhefen wurden von den hannoverschen Brauereien „Gilde Brauerei AG“ und „Brauerei Herrenhausen KG“ zur Verfügung gestellt und direkt aus der Brauerei abgeholt. Die frischen Bierhefen (TS ca. 15 %), als auch die frische Backhefe, wurden ebenfalls eisgekühlt und dunkel bis zur Untersuchung im Institut gelagert. Danach wurden die Proben bis zur weiteren Analyse bei 5 °C im Kühlschrank und die trockenen Hefen bei Raumtemperatur gelagert.