Die Nachweisgrenze ist die kleinste Konzentration des Analyten in der Probe oder in der Standardlösung, die qualitativ noch erfasst werden kann. Sie markiert die Möglichkeit ge-ringste Stoffmengenanteile eines Stoffes zu erkennen, wobei für eine eindeutige Bestimmung diese Menge noch nicht ausreicht. Dies hängt von der Empfindlichkeit des Messverfahrens ab. In der chromatographischen Praxis gilt zumeist das zwei- bis dreifache Rauschen des De-tektors als Nachweisgrenze. Die Ermittlung der Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungs-grenze wurde nach der Blindwertmethode nach GOTTWALD (2004) durchgeführt. Durch die hohe Empfindlichkeit des Fluoreszenzdetektors waren die Blindwerte nicht vom Rauschen zu
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unterscheiden, so dass die Erfassungsgrenze von der mittleren Peakhöhe des Rauschens und der zugehörigen Regressionsgeraden abgeleitet wurde. Die Standardlösungen wurden soweit verdünnt, bis das Messsignal die Höhe des dreifachen Rauschsignals überschritt und damit die Nachweisgrenze ermittelt. Der Messwert an der Nachweisgrenze gibt die obere Grenze des Rauschens an. Die Erfassungsgrenze wird als zweifache und die Bestimmungsgrenze als die dreifache Nachweisgrenze angegeben. Die Nachweisgrenze wurde aus der Kalibrierlösung mit der geringsten Konzentration über verschiedene Verdünnungsstufen ermittelt. Für jede Verdünnungsstufe wurden sechs Wiederholungsbestimmungen durchgeführt.
Tab. 15: Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze
Verbindung Nachweisgrenze
Die Ermittlung der Wiederfindungsraten wurde durch das Standardadditionsverfahren (Kap.
3.7.2., Abb. 48) bestimmt. Die Kalibrierlösungen selbst wiesen im Vergleich mit oder ohne SPE-Aufbereitung eine durchschnittliche Wiederfindung von 97,8 % ± 2,4 % auf. Sowohl im Waschwasser als auch bei wiederholter Elution der Festphasen waren weder Thiamin noch Thiaminphosphate in den Lösungen nachzuweisen.
Tab.16: Durchschnittliche Wiederfindungsraten in % von Thiamin und Thiaminphosphaten (n=6)
Probenmaterial T % TMP % TDP %
Die Wiederfindungsraten der Getreideproben wurden aufgrund der komplexeren Matrix nur bei reifem Getreide ermittelt.
123 5. Diskussion
Da Schweinefleisch, neben Getreide, ein wichtiges Grundnahrungsmittel und ein guter Vita-min B1-Lieferant ist, wurde in einer zuvor durchgeführten Studie auf den Thiamingehalt und deren Veränderungen im frisch geschlachtetem Schweinefleisch, zu verschiedenen zeitlichen Intervallen auf den Thiamingehalt untersucht (POEL, 2008). Diese Untersuchung erbrachte neue Erkenntnisse, die aufzeigten, dass deutliche Änderungen in der Zusammensetzung der Thiaminphosphate und der Thiamingehalte während der Fleischreifung besonders während der ersten 24 Stunden post mortem stattfinden.
Ziel dieser Dissertationsarbeit war, erstmalig eine vergleichende Untersuchung verschiedener Getreidearten wie Triticale, Hafer, Weizen, Gerste, Roggen auf den Thiamin- und Thiaminphosphatgehalt durchzuführen, ob derartige Transformationsvorgänge von Thiamin und seinen Thiaminphosphaten in vergleichbarem Maße zu Schweinefleisch auch in den ver-schiedenen Getreiden, während der Kornbildungsphase zu unterschiedlichen Zeitpunkten und in diversen Hefen stattfinden. Es ist daher interessant, da es sich um Untersuchungsmaterial unterschiedlicher Herkunft handelt, aber alle eine wichtige Rolle in der Ernährung für Mensch und Tier haben. Ergänzend zum Schweinefleisch sollte Getreide als pflanzliche Quelle und Hefen aus dem Reich der Mikroorganismen aufgrund dieser Fragestellung untersucht werden.
In dieser Dissertationsarbeit wurden daher die einzelnen Thiaminderivate, die sich aus Thiamin und Thiaminphosphatestern zusammensetzen, in verschiedenen Getreidearten wie Triticale, Hafer, Weizen, Gerste und Roggen, während des Wachstumsverlaufes von der Anbildung der Ähre bis hin zum reifen Getreidekorn zu verschiedenen Entwicklungszeitpunk-ten ermittelt und quantitativ bestimmt. In der veröffentlichEntwicklungszeitpunk-ten Literatur wurde vor allem bis-her der Thiamingesamtgehalt in den Getreiden bestimmt in Abhängigkeit von der Düngung, Belichtung, Witterungseinflüssen oder Standort. Dazu erfolgt im Allgemeinen zuerst der zeit-aufwendige saure hydrolytische Aufschluss unter Hochdruck und Temperatureinwirkung bei der die Proteindenaturierung stattfindet und Thiamin freigesetzt wird und anschließend die enzymatische Behandlung stattfindet, die eine Dephosphorylierung der Probenmatrix bewirkt, um weiteres phosphatgebundenes Thiamin freizusetzen und der Bestimmung zugänglich zu machen. Es sind Publikationen veröffentlicht, die die Untersuchung der Thiaminbindungspro-teine und die Thiaminbindungsaktivität in Getreide und Getreidekeimlingen beschreiben.
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Untersuchungen, die die Bestimmung von Thiamin und der einzelnen Thiaminphosphatester, Thiaminmonophosphat (TMP) und Thiamindiphosphat (TDP) im Getreidekorn von Triticale, Hafer, Gerste und Roggen während des Wachstumsverlaufes bzw. in der Kornbildungsphase beschreiben, sind bislang nicht veröffentlicht und werden in dieser Arbeit erstmalig beschrieben.
Da Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisiae einen sehr hohen Vitamin-B1-Gehalt aufweisen und eine komplexe Matrix besitzen, wurden ergänzend zu den bisher erwähnten Untersuchungen in dieser Arbeit diverse Hefen, wie frische Bäckerhefe, Trockenbackhefe, frische Bierhefe und Bierhefeflocken mit der von BÄCKERMANN (2007) und POEL (2008) neu entwickelten HPLC-Methode zur Thiaminanalytik auf die Anwesenheit von Thiamin, Thiaminmonophosphat, Thiamindiphosphat und Thiamintriphosphat untersucht und der Gehalt bestimmt. Wichtig war es aufzuzeigen, dass es auch bei Hefen, die eine komplexe Matrix aufweisen, eine gute gleichzeitige Aufreinigung und Trennung der Proben und anschließende simultane Bestimmung der Thiaminderivate durch Einsatz der neu entwickelten Thiaminanalytik mittels HPLC-FD ohne Störsubstanzen in kurzer Zeit möglich ist. Für den Probendurchsatz wurde kein Autosampler eingesetzt, da eine permanente Kühlung unter Lichtausschluss nicht gewährleistet werden konnte.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war, proteingebundenes Thiamin und Thiaminphosphatester als Thiamingesamtgehalt in frisch geschlachtetem Schweinefleisch durch optimierte enzymatische Behandlung in Anlehnung an die LFGB § 64 Methode vermehrt freizusetzen und zu bestimmen und mit den Gehalten der einzeln bestimmbaren Thiaminderivaten nach unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten zu vergleichen. Der Grund liegt darin, dass durch die vorhergehende Arbeit von POEL (2008) Transformationsvorgänge in frischem Schweinefleisch aufgezeigt und beschrieben wurden die darstellen, dass zum einen der Thiamingesamtgehalt in den ersten 24 Stunden sinkt und danach wieder deutlich ansteigt (Kap. 4.4.) und zum anderen, dass zu Beginn der Analyse (0,5 h p.m.) hauptsächlich TTP und Thiamintetraphosphat/Adenosinthiamintriphosphat vorliegen und bereits nach 6 h p.m. nur noch ein Bruchteil an TTP und ein Hauptanteil an TDP nachzuweisen ist. Vermutet wird daher, dass eine weitere Bindungsform des Thiamins vorliegen muss, die mit 4 %iger Trichloressigsäure nicht extrahierbar ist.
125 5.1. Chromatographie
In der Literatur werden zahlreiche Methoden zur Thiaminbestimmung beschrieben. Die HPLC-Methode, als ein sehr sensibles Verfahren, gekoppelt mit einer Fluoreszensdetektion ist heutzutage die Methode der Wahl. Alle Methoden liefern aber kein optimales Ergebnis, was die Aufreinigung (Kap. 2.11.2.) von komplexem Probenmaterial, als auch die Auftrennung (Kap. 2.11.3.) der verschiedenen Thiaminderivate gleichzeitig betrifft. Die Analysen werden häufig durch Störsubstanzen negativ beeinflusst oder die Trenneigenschaften sind nicht optimal. Dazu kommen das gewählte Extraktions- und Aufschlussverfahren und die Wahl der Oxidationsmethode für die jeweils zu untersuchende Matrix. Es wurde eine Methode in diesem Institut entwickelt, die es ermöglicht verschiedene Thiaminderivate in einer komplexen Matrix ohne Störsubstanzen gleichzeitig zu bestimmen.
Bei den verschiedenen Getreiden, als auch bei den Hefen, die in der vorliegenden Arbeit zu untersuchen waren, handelt es sich um komplizierte Matrices, die sich sehr gut mit dieser Methode bestimmen lassen. Dazu kommt der Einsatz eines gekoppelten Säulensystems, der es ermöglicht alle Thiaminderivate mit guter Trennung voneinander in einem Lauf gleichzeitig zu bestimmen, ohne dass Probenmaterial nach dem Injizieren in das System im Totraumvolumen verloren geht.
Desweiteren findet durch das gekoppelte Säulensystem, im Vergleich zu den beschriebenen Methoden, ein umgekehrter Retentionsverlauf (Abb. 82) statt, bei dem Thiamin als erstes retardiert wird und danach die höheren Thiaminphosphate in aufsteigender Reihenfolge (Kap.
4.1.). Weiterhin weisen die aufbereiteten Proben, bzw. Thiochromphosphate über Monate eine sehr gute Lagerstabilität auf und die Methode ist sehr gut reproduzierbar. Mit dieser Methode ist es erstmalig möglich Thiamin und seine Thiaminphosphate aus einer komplexen Matrix, wie es auch in diversen Hefen der Fall ist, in einem Analysengang zu bestimmen.
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Abb. 82: Veränderung der Thiaminderivatanteile in Schweinefleisch nach 3 h p. m.
Für die Untersuchung der Thiamin und Thiaminphosphatester wurde die neu entwickelte ana-lytische Methode von BÄCKERMANN und POEL weitgehend übernommen und angewen-det. Die Chromatogramme stellen die einzelnen Thiaminderivate sehr gut und deutlich von-einander getrennt dar (Abb. 82). Der Grund dafür liegt in der Entwicklung sowohl einer neuen Festphasenkombination beim Aufreinigungsschritt der Probe als auch in der Kombination der HPLC-Säulen, die sich aus einer NH2- und einer C-8- RP-Säule mit einer C-8- Vorsäule zu-sammensetzt. Das zu Beginn eingesetzte isokratische System erbrachte kein zufriedenstellen-des Ergebnis, da die Peaks zu dicht beieinanderlagen und bei einer Aufkonzentration der Pro-be die Thiochromphosphate sehr dicht zusammenlagen oder sogar zum Teil koeluierten, so-dass eine exakte Bestimmung nicht mehr möglich war. Daher wurde auf ein Gradientensystem umgestellt. Die Laufmittel der mobilen Phase des Gradientensystem beste-hen zum einen aus einem Acetonitril/Phosphatpuffergemisch 40:60 (v/v), 110 mM, pH 7,25 und zum anderen aus einem Acetonitril/Phosphatpuffergemisch 36:64 (v/v), 65mM, pH 7,15.
Die Eluenten waren jeweils über eine Pumpe mit einer Mischkammer und nachfolgend mit den HPLC-Säulen verbunden (Abb. 49). Bei der Festphasenkombination handelt es sich um eine unpolare C-18-Säule, die Thiamin auf der Phase retardiert und um eine polare Anionenaustauschersäule, SAX-Säule, auf der die Thiaminphosphate zurückgehalten werden.
Das Probenmaterial wird nach der Oxidation auf pH 7 eingestellt, um die Silicapartikel der Festphasen zu schonen. Andernfalls würden die Silicapartikel durch den alkalischen pH-Wert
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der Natronlaugesich auflösen und die Festphasensäulen werden unbrauchbar. Die Elution der Thiochromderivate von der Festphasenkombination erfolgte mit einem Acetonitril / Phosphat-puffergemisch 20:80 (v/v), 250 mM, pH 6,4. Durch die neu entwickelte Festphasenextraktion konnten die Substanzen wie Bromcyan oder Trichloressigsäure, die die HPLC-Säule schädigen entfernt werden. Daraus resultierte ein Chromatogramm ohne wesentliche Störsubstanzen, die zu Interferenzen führen könnten (Kap. 4.1., Abb. 51 u. 52). Die in der Literatur beschriebenen Methoden haben dahingehend den Nachteil, dass überwiegend RP C-18- Phasen oder auch Amidphasen Anwendung finden, deren Elutionsreihenfolge umgekehrt verläuft (Kap. 2.11.3., Abb. 43). Zuerst werden die höheren Thiaminphosphate eluiert und nachfolgend die weiteren Thiaminphosphate bis hin zum freien Thiamin. Dabei kann es passieren, dass die höheren Thiaminphosphate wie Thiamintriphosphat und Thiamintetraphosphat / Adenosinthiamintriphosphat bei umgekehrter Elutionsreihenfolge mit dem Totraumvolumen verloren gehen und somit nicht mehr von dem System erfasst werden können. Desweiteren lagen die Peaks zu eng beieinander (Abb. 83 u. 84) und Thiochrom eluierte bereits im Totvolumen (Abb. 83). Obwohl der pH-Wert der Eluenten für die optimale Fluoreszenz der Thiochromderivate nicht bei pH 8 liegt (ISHII et al., 1979) liegen die Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze in dem von verschiedenen Autoren angegebenen Bereich.
Abb. 83: Chromatogramm von Thiochrom und Thiochromphosphatester, Tren-nung von Standardsubstanzen auf einer Normalphase. Die mobile Phase bestand aus einem ACN/Phosphatpuffergemisch 60:40 (v/v), pH 8,4; 1. Thiochrom bereits im Totvolumen, 2. Thiochrommonophosphat, 3. Thiochromdiphosphat, 4. Thiochromtriphosphat (KAWASAKI u. EGI, 2000)
Totraumvolumen
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Aus der Abbildung 83 wird sehr deutlich sichtbar, dass die Thiochromderivate der Standardsubstanz sehr dicht zusammen liegen, aber noch gut voneinander abgrenzbar sind.
Die Abbildung 84 lässt ebenfalls sehr gut erkennen, dass sich in einer Matrix wie Blut oder Plasma die Thiochromphosphate nicht mehr gut voneinander abgrenzen lassen und dass die Probe Störsubstanzen aufweist, die eine Bestimmung erschweren.
Obwohl in der Literatur viele Methoden beschrieben sind, die eine Analyse der Thiamine und Thiaminphosphatester darstellen, wurde bisher bei keiner eine zufrieden stellende Probenauf-reinigung und Trennung aus einer komplizierten Matrix gefunden. Die in dem hiesigen Insti-tut neu entwickelte Methode ermöglicht somit erstmals eine komplette Trennung der Thio-chromderivate ohne Beeinträchtigung von Störpeaks in einer komplexen Matrix. Obgleich alle möglichen Einflüsse, wie Licht, Wärme, pH-Wert, die ursächlich für einen Thiaminabbau sein können, berücksichtigt wurden, lag die Wiederfindungsrate von 64,2 % für Thiamin, 90,4 % für Thiaminmonophosphat und 74 % Thiamindiphosphat im Schweinefleisch. Bei den Getreiden liegen die Wiederfindungsraten durchschnittlich bei 70 % für Thiamin, bei 82 % für Thiaminmonophosphat und bei 72 % für Thiamindiphosphat. Literaturdaten zum Ver-gleich der Wiederfindungsraten der einzelnen Thiaminphosphatester und freiem Thiamin in
Abb. 84: Chromatogramm einer Standardlösung, Vollblutprobe und Plasma mit koeluierenden Peaks (KAWASAKI u. EGI, 2000)
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den Getreiden Triticale, Hafer, Gerste und Roggen sind in der Literatur nicht explizit beschrieben, sodass ein Vergleich nicht sicher möglich ist (Kap. 3.7.2, Abb. 48; Kap.4.6., Tab. 16). VANDERSLICE und HUANG (1986) geben Wiederfindungsraten in mit Thiamin angereicherten Getreideprodukten an. Die Wiederfindungsraten werden mit 103 % für Thiamin, 96 % für Thiaminmonophosphat und mit 96 % für Thiamindiphosphat angegeben.
Die Wiederfindungsraten für Schweinefleisch werden mit 90 % für Thiamin, 81 % für Thiaminmonophosphat und 94 % für Thiamin-diphosphat angegeben. Die Festphasenextraktion unserer Analytikmethode kann als Ursache für verminderte Wiederfindungsraten weitestgehend ausgeschlossen werden, da die Wiederfindungsrate der Thiaminstandards bei 99 % lag und auch keine Thiaminderivate im Waschwasser oder nach erneuter Elution der Festphasensäulen nachzuweisen waren.
5.2. Methodenentwicklung
Für die Untersuchung der Getreideproben und für die verschiedenen Hefen wurde die Methode nach Bäckermann und Poel nicht wesentlich verändert. Bis auf den Einsatz von Mikroglasfaserfiltern bei der Probenaufbereitung von Haferproben und ein geringer Zusatz von α-Amylase, die Verwendung einer C-18- Säule mit Vorsäule gekoppelt mit der NH2 -Säule anstelle einer C-8- -Säule, die nur eine geringe Veränderung in den Retentionszeiten ergab und eine Verlängerung der Reaktionszeit der Oxidation auf 25 Minuten mit Bromcyan zum Thiochrom, blieb die Methode weitestgehend unverändert. Sämtliche Proben wurden mit Alufolie ummantelt, abgedunkelt und auf Eis gelagert. Proben, die zu späteren Zeitpunkten vermessen wurden, befanden sich entweder bei 4 °C im Kühlschrank oder wurden bei – 60
°C im Gefrierschrank gelagert. Auch beim HPLC-System mit Gradientenverlauf wurden bei den Eluenten und bei den Chromatographiesäulen keine Veränderungen vorgenommen.
Anders stellt es sich bei den Vergleichsuntersuchungen zum frischen Schweinefleisch dar.
Die frischen Schweinefleischproben wurden homogenisiert und dann in jeweils sechs Proben aufgeteilt. Die ersten beiden Proben wurden nach der Methode von Poel aufgearbeitet und vermessen und dienen als Grundlage für die Ausgangsgehalte an Thiamin. Die anderen zwei Doppelproben wurden nach der LFGB-Methode aufgearbeitet und die eine
Schweinefleisch-130
probe mit Bromcyan zu Thiochrom oxidiert und die andere Probe wie in der LFGB § 64-Methode beschrieben mit Kaliumhexacyanoferrat zu Thiochrom oxidiert. Daraus ergaben sich signifikante Unterschiede in der Oxidationsleistung. Auch die HPLC-Methode wurde im Lau-fe der Untersuchungen verändert und letztendlich auf die Methode von POEL angeglichen.