Der nukleäre Proteinkomplex Asi vermittelt den Abbau von Nt 1-390

Keine der Ubiquitinligasen, die bislang in der Literatur als bedeutsam für die Qualitätskontrolle bzw. physiologisch regulierte Degradation von Proteinen im ER, im Cytosol oder im Nukleus erachtet wurden, war an der Degradation von HA-Nt1-390

beteiligt (Abb. 3.3.2, Abb. 3.3.5, Abb. 3.3.6 und Abb. 3.3.9). Die Suche nach dem für den Abbau von HA-Nt1-390 verantwortlichen E3-Ligasekomplex weckte das Interesse an einem Proteinkomplex der Inneren Nukleus-Membran: dem Asi Komplex. Der Asi Komplex besteht aus den integralen Membranproteinen Asi1, Asi2 und Asi3 (Forsberg

3. Ergebnisse

et al. 2001b; Boban et al. 2006; Zargari et al. 2007). Die Asi Proteine (Amino acid sensor independent) wurden als negative Regulatoren des SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5)-Signalwegs entdeckt (Forsberg et al. 2001a; Forsberg & Ljungdahl 2001; Andreasson &

Ljungdahl 2002; Andreasson & Ljungdahl 2004; Andreasson et al. 2004). Innerhalb dieses Signalwegs ist der Asi Proteinkomplex Teil eines backup Systems, das in Abwesenheit von extrazellulären Aminosäuren die Bindung der Transkriptionsfaktoren Stp1/2 an die Promotoren von SPS-Sensor regulierten Genen verhindert und damit deren Repression garantiert. Die exakte Funktion des Asi Komplexes innerhalb dieses Prozesses war zu diesem Zeitpunkt jedoch noch unklar (vgl. Abschnitt 4.3.1.2). Die polytopischen Membranproteine Asi1 und Asi3 besitzen beide in ihrer hydrophilen, nukleoplasmatisch exponierten C-terminalen Domäne eine Zn²⁺-koordinierende RING Domäne (Boban et al. 2006; Zargari et al. 2007). Diese C-terminalen RING Domänen von Asi1 und Asi3 ließen eine Funktion des Asi Proteinkomplexes als E3-Ligasekomplex der Inneren Nukleus-Membran vermuten, jedoch konnte dem Asi Komplex bislang keine E3-Ligaseaktivität nachgewiesen werden (Boban et al. 2006;

Zargari et al. 2007). Da auch eine Lokalisation von HA-Nt_1-390 in der Inneren Nukleus-Membran gut möglich ist, wurde der Asi Proteinkomplex als potentieller E3-Ligasekomplex untersucht, der die Degradation von HA-Nt_1-390 vermitteln könnte.

3.3.9.1 Die Proteine Asi1, Asi2 sowie Asi3 des Asi Komplexes sind für die Degradation von Nt_1-390 erforderlich

Um festzustellen, ob eine oder mehrere Komponenten des nukleären Asi Proteinkomplexes bei der Degradation von HA-Nt1-390 mitwirken, wurde die Stabilität von HA-Nt_1-390 in doa10Δ, asi1Δ, asi2Δ und asi3Δ Zellen überprüft (Abb. 3.3.10).

Abbildung 3.3.10: Die Proteine Asi1, Asi2 und Asi3 des Asi Komplexes sind für die Degradation von HA-Nt_1-390 erforderlich. Degradationsassays von HA-Nt_1-390 in doa10Δ, asi1Δ, asi2Δ und asi3Δ Zellen. HA-Nt_1-390 wurde ektopisch (CEN Plasmid) unter der Kontrolle des endogenen DOA10 Promotors exprimiert. Nach Zugabe von Cycloheximid wurden zu den angegebenen Zeitpunkten Aliquote entnommen und der Zelllyse unterzogen. Nach SDS-PAGE und Western Blot erfolgte die Immundetektion von HA-Nt1-390 mittels α-HA Antikörper. Pgk1 (α-PGK) diente als Ladekontrolle. Ein Lysat von asi1Δ Zellen (Kontrolle) fungierte als Negativkontrolle.

Wie bereits gezeigt, wurde HA-Nt_1-390 in doa10Δ Zellen mit einer Halbwertszeit von ~ 20 min abgebaut (Abb. 3.3.10). In asi1Δ, asi2Δ und asi3Δ Zellen jedoch konnte jeweils eine komplette Stabilisierung von HA-Nt1-390 über den gesamten untersuchten Zeitraum hinweg beobachtet werden (Abb. 3.3.10). Bereits zu den to-Zeitpunkten des Assays wies HA-Nt1-390 in asi1Δ, asi2Δ und asi3Δ Zellen ein höheres Proteinlevel als in doa10Δ Zellen auf (Abb. 3.3.10, vgl. 0 min). Der für die Degradation von HA-Nt_1-390 verantwortliche E3-Ligasekomplex war damit gefunden: Der nukleäre Proteinkomplex Asi, bestehend aus den Proteinen Asi1, Asi2 sowie Asi3, vermittelt zusammen mit Ubc7 und in geringerem Maß auch mit Ubc4 den proteasomalen Abbau von HA-Nt1-390. Alle drei Asi Proteine waren dabei für die proteasomale Degradation von HA-Nt1-390

essentiell (Abb. 3.3.10). Aufgrund ihrer C-terminalen RING Domänen wird dabei für Asi1 und/oder Asi3 die für die Ubiquitinierung von HA-Nt_1-390 erforderliche E3-Ligasefunktion postuliert. Zur Klärung der genauen Funktion der einzelnen Asi Proteine innerhalb des Abbaus von HA-Nt1-390 bedarf es weiterer Untersuchungen (vgl. Abschnitt 4.3.1.2).

3.3.9.2 Nt1-390 wird in Asi1-abhängiger Weise poly-ubiquitiniert

Um zu überprüfen, ob die in asi1Δ Zellen beobachtete Stabilisierung von HA-Nt1-390 die direkte Konsequenz einer fehlenden bzw. verminderten Ubiquitinierung von HA-Nt1-390

durch Asi1 ist, wurde der Ubiquitinierungsgrad von HA-Nt_1-390 in An- und Abwesenheit von Asi1 mit Hilfe eines in vivo Ubiquitinierungsassays verglichen. Zur Anreicherung und besseren Detektion von ubiquitiniertem HA-Nt_1-390 wurde der proteasomale Abbau von HA-Nt1-390 mit MG132 inhibiert. HA-Nt1-390 wurde zur Durchführung des Ubiquitinierungsassays unter der Kontrolle des GPD Promotors zusammen mit MYC getaggtem Ubiquitin in pdr5Δ und pdr5Δ asi1Δ Zellen überexprimiert. Auch Ubiquitin wurde unter der Kontrolle des induzierbaren CUP1 Promotors überexprimiert. Nach der Immunpräzipitation von HA-Nt_1-390 via anti-HA Agarosebeads wurde der Ubiquitinierungsgrad von HA-Nt1-390 in pdr5Δ und pdr5Δ asi1Δ Zellen mittels eines Immunblots mit α-MYC oder α-HA Antikörper analysiert (Abb. 3.3.11).

Die wesentlich höheren Proteinlevels von HA-Nt1-390 in den Präzipitaten im Vergleich zu den Proteinlevels in den 5% Inputproben ließen auf eine erfolgreich durchgeführte Immunpräzipitation schließen (Abb. 3.3.11 B.). Sowohl in pdr5Δ als auch in pdr5Δ asi1Δ Zellen konnten hochmolekulare HA-Nt1-390-MYC-Ubiquitin-Konjugate detektiert werden (Abb. 3.3.11 A. und B., α-HA IP). HA-Nt1-390 war jedoch in pdr5Δ asi1Δ Zellen sichtbar geringer ubiquitiniert als in pdr5Δ Zellen (Abb. 3.3.11 A. und B., α-HA IP).

Die Anwesenheit von Asi1 hatte folglich einen Einfluss auf den Ubiquitinierungsgrad von HA-Nt_1-390. Asi1 könnte daher eine für die Ubiquitinierung und Degradation von HA-Nt1-390 essentielle E3-Ligase darstellen. Ein HA-Blot zeigte, dass die dektektierten HA-Nt1-390-MYC-Ubiquitin-Konjugate HA-Nt1-390 spezifisch waren (Abb. 3.3.11 B.).

Die beobachtete verminderte Ubiquitinierung von HA-Nt1-390 in Abwesenheit von Asi1 korreliert mit der in asi1Δ Zellen entdeckten Stabilisierung von HA-Nt1-390 (vgl. Abb.

3.3.10).

3. Ergebnisse

Abbildung 3.3.11: HA-Nt_1-390 wird in Asi1-abhängiger Weise poly-ubiquitiniert. In vivo Ubiquitinierungsassay von HA-Nt_1-390 in pdr5Δ und pdr5Δ asi1Δ Zellen. HA-Nt_1-390 wurde ektopisch (CEN Plasmid) unter der Kontrolle des GPD Promotors zusammen mit MYC getaggtem Ubiquitin in pdr5Δ und pdr5Δ asi1Δ Zellen überexprimiert. MYC-Ubiquitin wurde dabei unter der Kontrolle des induzierbaren CUP1 Promotors ebenfalls überexprimiert. Nt_1-390 und MYC-Ubiquitin co-exprimierende pdr5Δ asi1Δ Zellen dienten als Negativkontrolle. Nach Erreichen der Log-Phase wurden die Kulturen mit 50 µM MG132 versetzt, um das Proteasom zu inhibieren. HA-Nt_1-390 wurde mittels α-HA Beads aus den Zelllysaten immunpräzipitiert. Die 5% Inputproben und Präzipitate wurden via SDS-PAGE und Western-Blot analysiert. Zur Immundetektion der HA-Nt_1-390-MYC-Ubiquitin-Konjugate wurde der Blot zunächst in α-MYC Antikörper (A.), danach in α-HA Antikörper inkubiert (B.). Der Stern (*) markiert die Bande der schweren Kette des IgG Antikörpers.

Die trotz Abwesenheit von Asi1 beobachtete geringe Ubiquitinierung von HA-Nt_1-390 in pdr5Δ asi1Δ Zellen könnte auf eine E3-Ligaseaktivität von Asi3 zurückgeführt werden, die wie Asi1 Teil des Asi-Komplexes ist und in deren Abwesenheit HA-Nt1-390 ebenfalls stabilisiert wurde (vgl. Abb. 3.3.10). Nt1-390 und MYC-Ubiquitin co-exprimierende pdr5Δ asi1Δ Zellen dienten als Negativkontrolle der anti-HA Immunpräzipitation. In diesen Zellen konnten wie erwartet keine HA-Nt_1-390-MYC-Ubiquitin-Konjugate detektiert werden (Abb. 3.3.11 A. und B., α-HA IP). Bei genauer Betrachtung des Ubiquitinierungsassays fiel auf, dass bereits in den 5% Inputproben das Proteinlevel von HA-Nt1-390 in pdr5Δ asi1Δ Zellen deutlich höher war als in pdr5Δ Zellen (Abb.

3.3.11 B.). Entsprechend mehr HA-Nt1-390 wurde aus pdr5Δ asi1Δ Zellen immunpräzipitiert. Trotz eines höheren HA-Nt_1-390-Präzipitats in pdr5Δ asi1Δ Zellen ließen sich jedoch deutlich weniger HA-Nt_1-390-MYC-Ubiquitin-Konjugate detektieren.

Dieses Ergebnis unterstützt einmal mehr die Hypothese, dass Asi1 eine für die Ubiquitinierung von HA-Nt1-390 essentielle E3-Ligase darstellen könnte. Aufgrund der detektierten hochmolekularen HA-Nt1-390-MYC-Ubiquitin-Konjugate erscheint es als sehr wahrscheinlich, dass Asi1 zusammen mit dem E2-Enzym Ubc7 (und in geringem Maße auch mit Ubc4) die Bildung von Poly-Ubiquitinketten an HA-Nt_1-390 katalysiert.

Vorherige Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass diese Ubiquitinketten über Lysin 48 (K48) verknüpft sind (vgl. Abb. 3.3.3 C.).