Die IVS (Intervening Sequence) des K. lactis DOA10 Locus enthält einen

Der DOA10 Locus in K. lactis wird durch eine 508 bp große IVS in einen Nt-ORF und einen Ct-ORF geteilt (Abb. 3.1.2) (Stefan Kreft; Stürner, Diplomarbeit Universität Konstanz, 2009). Expressionsstudien in K. lactis zeigten wiederholt, dass zwei unterschiedlich große Polypeptide die Genprodukte dieses DOA10 Locus sind: ein 34 kDa großes N-terminales Fragment und ein 105 kDa großes C-terminales Fragment (Abb. 3.1.3 B. und C.) (Abschnitt 3.1.1; Stürner, Diplomarbeit Universität Konstanz, 2009). Die nachgewiesene Expression zweier Polypeptide vom KlDOA10 Locus warf die Frage auf, was für ein Mechanismus der Expression des Ct-Fragments zu Grunde liegt. Die dem Ct-ORF vorgelagerte IVS des KlDOA10 Locus zeigte keine klar ersichtlichen Homologien zu Sequenzen der GenBank Datenbank (Daten: Stefan Kreft;

Stuerner et al. 2012). So konnte zunächst weder über die Funktion der IVS noch über ihre Herkunft eine definitive Aussage getroffen werden. In Anbetracht der Expression von zwei Polypeptiden vom KlDOA10 Locus wurde für die IVS die Funktion einer IRES (Internal Ribosome Entry Site) oder eines Promotors postuliert. Im Fall einer IRES würde der dem Nt-ORF vorgelagerte Promotor die Transkription einer bicistronischen KlDoa10 mRNA veranlassen und die IVS hätte in ihrer Funktion als IRES durch abermalige Rekrutierung der Translationsmaschinerie die Translation des Ct-Fragments vermittelt. In ihrer Funktion als Promotor hätte die IVS die Transkription einer zweiten mRNA bewirkt, die das Ct-Fragment kodiert. In diesem Fall würden zwei unterschiedlich große mRNAs vom KlDOA10 Locus transkribiert werden.

Um zwischen den für die IVS postulierten Funktionen als IRES oder als Promotor zu differenzieren, wurden die endogenen Transkripte des KlDOA10 Locus mittels eines Northern Blots mit Nt- und Ct-ORF spezifischen Sonden analysiert (Abb. 3.1.4 A. und B.). Hierzu wurde die Gesamt-RNA aus K. lactis WT und doa10Δ Zellen isoliert, über ein denaturierendes Gel aufgetrennt und auf eine postiv geladene Nylonmembran transferiert. Die Hybridisierung der Membran erfolgte mit ³²P-endmarkierten Oligonukleotidsonden, die sequenzspezifisch an die mRNA des Nt-ORFs und des Ct-ORFs banden (Nt- und Ct- Sonde). Mittels Auto-Radiographie konnten die gebundenen radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden detektiert werden.

3. Ergebnisse

Abbildung 3.1.4: Die IVS des K. lactis DOA10 Locus enthält einen funktionellen Promotor (und Terminator). A. Northern Blot Analyse der KlDOA10 Transkripte mit einer für den KlDOA10 Nt-ORF spezifischen Sonde (Nt-Sonde). Die Gesamt-RNA von K. lactis WT und doa10Δ Zellen wurde isoliert, über ein Gel aufgetrennt und mittels Northern Blot analysiert. Links: Bild des Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels vor dem Transfer auf die Membran (Gel). Rechts: Phosphorimager-Scan der mit einer Nt-Sonde hybridisierten Northern Blot Membran nach dreitägiger Exposition (Nt-Nt-Sonde). Ein Pfeil markiert die Position des ~ 1200 Nukleotide großen KlDOA10 Nt-ORF spezifischen Transkripts. M: RNA Größenmarker (in Nukleotiden). B. Northern Blot Analyse der KlDOA10 Transkripte mit einer für den KlDOA10 Ct-ORF spezifischen Sonde (Ct-Sonde). Die Durchführung der Northern Blot Analyse erfolgte wie in A.. Anstatt einer für den KlDOA10 Nt-ORF spezifischen Sonde wurde eine ³²P-markierte, für den KlDOA10 Ct-ORF spezifische Sonde (Ct-Sonde) verwendet. Links: Bild des Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels vor dem Transfer auf die Membran (Gel). Rechts: Scan eines Films nach siebentägiger Exposition (Ct-Sonde). Ein Pfeil markiert die Position des ~ 3200 Nukleotide großen KlDOA10 Ct-ORF spezifischen Transkripts. M: RNA Größenmarker (in Nukleotiden). C. Reporterassay zur Überprüfung der IVS Promotoraktivität. Die Sequenzen von URA3-HA, IVS-URA3-HA oder ScGPD-URA3-HA wurden in K. lactis Expressionsplasmide (CEN Plasmid) inseriert und in K. lactis WT Zellen exprimiert.

Nach SDS-PAGE und Western Blot erfolgte die Immundetektion des Ura3-HA Reporters mittels α-HA Antikörper. Eine unspezifische Bande diente als Ladekontrolle (bkg). Das Lysat von mit einem Leervektor transformierten K. lactis WT Zellen (Kontrolle) fungierte als Negativkontrolle. D.

Bestimmung der 5´-Grenze des in der IVS lokalisierten Promotors. Die Sequenz von Ct-13MYC wurde entweder ohne Promotor, mit der IVS Sequenz oder mit 5´trunkierten Versionen der IVS Sequenz in K.

lactis Expressionsplasmide (CEN Plasmid) inseriert und in K. lactis WT Zellen exprimiert. Nach SDS-PAGE und Western Blot erfolgte die Immundetektion von Ct-13MYC mittels α-MYC Antikörper. Eine unspezifische Bande diente als Ladekontrolle (bkg). Das Lysat von mit einem Leervektor transformierten K. lactis WT Zellen (Kontrolle) fungierte als Negativkontrolle. (D.: Abbildung: Stefan Kreft; Abbildung modifiziert aus Stuerner et al. (2012))

In der Gesamt-RNA von K. lactis WT Zellen konnte mit Hilfe der Nt-ORF spezifischen Sonde ein ~ 1200 Nukleotide großes Transkript detektiert werden (Abb. 3.1.4 A., Blot Spur 2, Pfeil). In seiner Größe stimmte dieses Transkript mit einer mRNA des Nt-ORFs überein, die neben dem Nt-ORF auch die 5´und 3´UTRs (Untranslated Regions) Bereiche sowie einen poly(A) Schwanz beinhaltet. Die Abwesenheit dieses detektierten Transkripts in der Gesamt-RNA von K. lactis doa10Δ Zellen bestätigte, dass dieses Transkript KlDOA10 spezifisch war und die mRNA des Nt-ORFs des KlDOA10 Locus darstellte (Abb. 3.1.4 A., Blot Spur 3). Die Hybridisierung des Blots mit der Ct-ORF spezifischen Sonde offenbarte in der Gesamt-RNA von K. lactis WT Zellen ein weiteres

~3200 Nukleotide großes KlDOA10 spezifisches Transkript (Abb. 3.1.4 B., Blot Spur 2, Pfeil). Dieses entsprach größenmäßig einer mRNA des Ct-ORFs, die ihren Transkriptionsstartpunkt in der IVS hat und neben dem Ct-ORF auch einen 3´UTR Bereich und einen poly(A) Schwanz enthält. Wie bereits das kleinere KlDOA10 spezifische Transkript konnte auch das größere nicht in K. lactis doa10Δ Zellen mittels einer KlDOA10 spezifischen Sonde detektiert werden (Abb. 3.1.4 B., Blot Spur 3). Die Northern Blot Analyse mit Nt- und Ct-ORF spezifischen Sonden zeigte damit deutlich, dass der KlDOA10 Locus zwei unterschiedlich große Trankripte bzw. mRNAs exprimiert. Das kleinere Transkript entsprach in seiner Größe der mRNA des Nt-ORFs, das größere Transkript der mRNA des Ct-ORFs. Die IVS besitzt somit Promotoraktivität und bewirkt die Transkription einer zweiten mRNA, die das Ct-Fragment des Split-KlDoa10 codiert. Wichtig ist anzumerken, dass die IVS neben einem Promotor für die Expression des Ct-ORFs auch einen Terminator für den Nt-ORF zu enthalten scheint (vgl. Größe des Nt-Transkripts; Abb. 3.1.4 A.).

Um zu testen, ob die KlDOA10 IVS tatsächlich Promotoraktivität aufweist, wurde ein Reporterassay mit Ura3-HA durchgeführt. Hierzu wurde in einem K. lactis Expressionsplasmid (CEN, ohne Promotor) die 508 bp große IVS Sequenz vor das Reportergen URA3-HA inseriert (Abb. 3.1.4 C., IVS-URA3-HA). Zum Vergleich und zur Kontrolle wurden weitere Plasmidkonstrukte generiert, in denen URA3-HA unter Kontrolle des ScGPD Promotors oder unter Kontrolle keines Promotors stand (Abb.

3.1.4 C., ScGPD-URA3-HA, URA3-HA). Nach Transformation der Plasmide in K.

lactis WT Zellen wurden Zellextrakte hergestellt und die Expression des Reporters Ura3-HA mittels eines α-HA Immunblots untersucht. Die IVS allein war ausreichend, um eine Expression des Reporters Ura3-HA in K. lactis WT Zellen zu bewirken (Abb.

3.1.4 C., Spur 3, IVS-URA3-HA). Dabei hing die Expression von Ura3-HA zweifelsohne allein von der IVS ab (Abb. 3.1.4 C., vgl. Spur 2 und 3, URA3-HA und IVS-URA3-HA). Dies bewies abermals, dass in der IVS Sequenz ein Promotor enthalten sein muss. Der Reporterassay untermauerte damit das Ergebnis der Northern Blot Analyse. Im Vergleich zur IVS führte der ScGPD Promotor zu einer ~ 5fach höheren Expression des Reporters Ura3-HA (Abb. 3.1.4 C., Spur 4, ScGPD-URA3-HA).

Ein weiterer Reporterassay, diesmal mit Ct-13MYC als Reporter, offenbarte die Lage der 5´- Grenze des IVS Promotors (Versuch und Abbildung: Stefan Kreft; Abb. 3.1.4

3. Ergebnisse

D.). Zu seiner Durchführung wurden in K. lactis Expressionsplasmide (CEN, ohne Promotor) die gesamte IVS Sequenz oder 5´trunkierte Versionen der IVS Sequenz (IVSΔ1-150 und IVSΔ1-260) vor den Ct-ORF-13MYC inseriert. Nach Transformation der Plasmide in K. lactis WT Zellen wurde mittels eines α-MYC Immunblots die Expression von Ct-13MYC analysiert. Die ersten 150 bp der 508 bp großen IVS waren für die Promotoraktivität der IVS nicht notwendig (Versuch und Abbildung: Stefan Kreft; Abb. 3.1.4 D. Spur 3). Jedoch hatte die Deletion der ersten 260 bp der IVS den vollständigen Verlust der Promotoraktivität zur Folge (Versuch und Abbildung: Stefan Kreft; Abb. 3.1.4 D. Spur 4). Die 5´-Grenze des IVS Promotors liegt damit zwischen den ersten 150 und 260 bp der IVS.

Die Resultate der Northern Blot Analysen und der Reporterassays ließen den Schluss zu, dass der K. lactis DOA10 Locus zwei mRNAs exprimiert: eine kleineres Transkript, welches das Nt-Fragment codiert, und eine größeres Transkript, welches das Ct-Fragment codiert. Die Transkription des Ct-ORFs wird dabei durch einen Promotor in der IVS ermöglicht.

3.1.3 Das N- und C-terminale Fragment des Split-KlDoa10 sind integrale