Geräte

Tabelle 2.12: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Geräte

Name Hersteller

Axioskop 40 Durchlichtmikroskop Zeiss

Concentrator 5301 (SpeedVac) Eppendorf

Centrifuge 5415D Eppendorf

Durchlichtmikroskop Leitz

FLA-5000 Imaging System Fuji

Function Line Microbiological Incubators Heraeus

G25 Incubator Shaker New Brunswick Scientific

Heraeus Fresco 17 Refrigerated Micro Centrifuge Thermo Scientific

Imagersystem FUJI LAS 3000 Fuji

Innova 4000 Incubator Shaker New Brunswick Scientific Innova^® 44/44R Incubator Shaker New Brunswick Scientific

Mastercycler gradient Eppendorf

NanoPhotometer^TM Implen

Phosphorimager BAS Reader Raytest

PowerPac Basic^TM Bio-Rad

SmartSpec^TM Plus Spectrophotometer Bio-Rad

TPersonal Thermocycler Biometra

Trans-Blot^® Transfer Cell Bio-Rad

Trans-Blot^® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell

Bio-Rad

2. Material und Methoden 2.2 Methoden

Die angewandten molekularbiologischen und biochemischen Methoden richten sich im Wesentlichen nach Standardprotokollen von Ausubel (1996) und Sambrook (2001). In nahezu allen der unten beschriebenen Methoden wurden sterile Lösungen und sterile Gefäße eingesetzt.

2.2.1 Kultivierung und Lagerung von Zellen 2.2.1.1 Escherichia coli Bakterien

Die Anzucht von E. coli Bakterien erfolgte in LB-Medium bei 37°C in einem Schüttler bei 200 rpm über Nacht. Nach Bedarf wurde dem LB-Medium Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml hinzugegeben. Zur Anlage von Dauerkulturen wurde 1 ml einer E. coli Übernachtkultur mit 600 µl sterilem 75% Glycerol versetzt und bei -80°C eingefroren.

2.2.1.2 Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces Hefezellen

Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces Hefezellen wurden in Flüssigkulturen in einem Schüttler bei 200 rpm bzw. in einem Rotator oder auf Agarplatten bei 30°C kultiviert. Zur Selektion von Transformanten wurde SD-Minimalmedium mit den entsprechenden Aminosäuren bzw. Antibiotika verwendet; die Kultivierung ohne erforderliche Selektion erfolgte in YPDA-Vollmedium. Zur langfristigen Aufbewahrung von Hefezellen wurden zu 1 ml Übernachtkultur 600 µl steriles 75%

Glycerol hinzugegeben und bei -80°C eingefroren.

2.2.2 Präparation und Quantifizierung von Plasmid-DNA 2.2.2.1 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen

Die Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen erfolgte bei Übernachtkulturen bis zu 3 ml (Mini-Präparation) nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Stephen et al. 1990).

3 ml Übernachtkultur wurden durch Zentrifugation (6000 x g, 1 min, RT) geerntet. Das Zellpellet wurde in 250 µl S1-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 250 µl S2-Puffer wurde die Probe bei RT für 3 min inkubiert. Die Zelllyse wurde durch Zugabe von 250 µl S3-Puffer gestoppt. Nach 5-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zelltrümmer inklusive denaturierter Proteine und chromosomaler DNA bei 16800 x g und 4°C für 10 min abzentrifugiert. Zur Fällung der Plasmid-DNA wurden 600 µl kaltes 100%

Isopropanol zu dem Überstand hinzugegeben. Die DNA wurde durch Zentrifugation für 30 min bei 16800 x g und 4°C gefällt. Nach Waschen des DNA-Pellets mit 70%

Ethanol wurde es in einer SpeedVac für 5 min bei 45°C getrocknet. Die Plasmid-DNA wurde in 30 µl destilliertem, sterilem H₂O resuspendiert.

Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen bei 100 ml Übernachtkulturen (Midi-Präparation) wurde das Kit PureYield^®Midipreps (Promega) verwendet. Die Präparation erfolgte gemäß den Vorschriften des Herstellers. Die gereinigte DNA wurde mit 400 µl destilliertem, sterilem H2O eluiert.

2.2.2.2 Quantifizierung von Plasmid-DNA

Die Konzentration von Plasmid-DNA aus Mini-Präparationen wurde durch den Vergleich des Signals der Plasmid-DNA mit dem Signal einer Plasmidpräparation mit bekannter Konzentration in einem mit Ethidiumbromid bzw. MidoriGreen gefärbten Agarose-Gel bestimmt.

Die Konzentrationsbestimmung von Plasmid-DNA aus Midi-Präparationen erfolgte durch spektrophotometrische Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260) unter Zuhilfenahme des NanoPhotometers^TM (Implen). Der Quotient aus OD260/OD280 diente als Maß für die Reinheit der DNA.

2.2.3 Präparation und Quantifizierung von RNA aus Kluyveromyces Hefezellen 2.2.3.1 Isolierung der Gesamt-RNA aus Kluyveromyces Hefezellen

Die Isolierung der Gesamt-RNA aus Kluyveromyces Hefezellen erfolgte nach der Hot-Phenol Methode von Schmitt et al. (1990). 10 ml YPDA-Kultur mit einer OD₆₀₀ ~ 2.5-5.0 wurden geerntet (3000 x g, 10 min, RT). Die pelletierten Zellen wurden in 400 µl AE Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 40 µl 10% SDS und 440 µl Phenol (in AE Puffer äquilibriert) wurde die Suspension gevortext und für 4 min bei 65°C inkubiert.

Die Probe wurde solange in Eis abgekühlt, bis sich Phenolkristalle gebildet hatten. Nach Zentrifugation für 2 min bei 16100 x g wurde die obere wässrige Phase mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol für 5 min bei RT extrahiert. Zur Präzipitation der RNA wurden zur extrahierten wässrigen Phase 40 µl 3 M NaAc pH 5.3 und 2.5 Volumen an 100% Ethanol hinzugegeben. Nach Waschen mit 80% Ethanol wurde das Pellet in der SpeedVac für 3 min bei 45°C getrocknet und in 20 µl destilliertem, sterilem H₂O resuspendiert. Die isolierte Gesamt-RNA wurde bei -80°C aufbewahrt.

2.2.3.2 Quantifizierung von RNA

Die Konzentration der Gesamt-RNA wurde durch spektrophotometrische Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD₂₆₀) mit Hilfe eines NanoPhotometers^TM (Implen) bestimmt.

2.2.4 Northern Blot Analyse

25 µg Gesamt-RNA wurden mittels Ethanol gefällt und in RNA-Ladepuffer und Formaldehyd Ladepuffer resuspendiert (Endkonzentration: 2 µg/µl). Nach Denaturierung der RNA für 10 min bei 65°C wurde die Probe auf Eis abgekühlt und auf ein denaturierendes 0.9 % Agarosegel geladen, das 6.6 % Formaldehyd enthielt. Nach Auftrennung der RNA wurde das Gel zunächst in H2O, dann in 50 mM NaOH und zuletzt dreimal in 100 mM Tris-HCl pH 7.0 gewaschen. Nachdem das Agarosegel für 5 min in 20x SSC getränkt wurde, wurde die RNA durch Standardkapillartransfer über Nacht (14-24 h) auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche) übertragen. Als Transferpuffer diente 20x SSC. Die RNA wurde durch Backen der Membran für 2 h bei 80°C auf der Membran fixiert. Um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen (Prähybridisierung), wurde die Membran für 1h bei 45°C in vorgewärmtem

2. Material und Methoden

Hybridisierungspuffer UltraHybOligo (Ambion) inkubiert. Nach erfolgter Prähybridisierung wurde die mit ³²P-endmarkierte Oligonukleotidsonde zu dem Hybridisierungspuffer hinzugegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 42°C.

Zur Herstellung der sequenzspezifischen, ³²P-endmarkierten Oligonukleotidsonden wurden 10 pmol/µl Oligonukleotid (vgl 2.1.5 Synthetische Oligonukleotide, markiert mit^*) mit [gamma-³²P]ATP (10 mCi/ml) am 5´-Ende mit Hilfe der T4 Polynukleotidkinase (10 U/µl; NEB) radioaktiv markiert (30 min, 37°C). Nach Abstoppen der Reaktion mit EDTA wurden die radioaktiv endmarkierten Oligonukleotidsonden über Sephadex-G50 Säulen (GE Healthcare) gereinigt. Vor ihrer Zugabe zum Hybridisierungspuffer wurden die Oligonukleotidsonden bei 98°C für 4 min denaturiert. Um nicht gebundene Oligonukleotidsonden zu entfernen, wurde die Membran nach erfolgter Hybridisierung zweimal für 30 min in Northern Blot Waschpuffer bei 42°C gewaschen. Die Detektion gebundener radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden erfolgte durch Autoradiographie. Hierzu wurde die Membran entweder gegen einen Röntgenfilm (Kodak) bei -80°C in einer Filmkassette exponiert oder auf eine Phosphorimager Platte BASIIIs (Fuji) aufgelegt (Expositionszeit: 2-7 Tage). Das Auslesen der Phosphorimager Platte erfolgte im Phosphorimager BAS Reader (Raytest) oder im FLA-5000 Imaging System (Fuji).

2.2.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Polymerase Chain Reaction)

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde sowohl für Klonierungen als auch zu analytischen Zwecken eingesetzt (Mullis et al. 1986). Als Template-DNA für PCRs dienten die gereinigte Plasmid-DNA aus Mini- oder Midi-Präparationen, gereinigte genomische DNA aus Hefezellen oder direkt Bakterien- bzw. Hefezellen.

2.2.5.1 PCR zur Generierung neuer DNA-Fragmente

Zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten, die als Inserts in Klonierungen verwendet wurden, wurde die Phusion^® High Fidelity DNA-Polymerase von Finnzymes verwendet. Ein 50 µl Standardansatz enthielt ~50 ng Template-DNA, 25 pmol pro Oligonukleotid (forward bzw. reverse Primer), 5 µl eines dNTPs-Mix (2.5 mM je dCTP, dATP, dTTP, dGTP), 10 µl 5x Phusion HF buffer (Finnzymes) sowie 1 µl der Polymerase (2U/µl). Die Durchführung der PCR erfolgte nach Herstellerangaben.

2.2.5.2 Analytische PCR

Analytische PCRs (Colony PCRs) wurden durchgeführt, um die korrekte Ligation eines DNA-Fragments (Insert) in einen Vektor in Bakterien zu überprüfen oder um genetische Modifizierungen des Hefegenoms wie z.B. eine Gendeletion oder die Insertion einer Tag-Sequenz zu verifizieren. Hierzu wurden Bakterien- bzw. Hefezellkolonien in 10 µl sterilem H₂O resuspendiert. 2 µl dieser Suspensionen oder die gereinigte genomische DNA von Hefezellen dienten als Template-DNA. Als DNA-Polymerase wurde für analytische PCRs eine Taq DNA-Polymerase eingesetzt, die von der AG Scheffner (Universität Konstanz) selbst hergestellt wurde. Die Zusammensetzung eines 50 µl Standardansatzes war folgende: 25 pmol pro Oligonukleotid (forward bzw. reverse Primer), 5 µl eines dNTPs-Mix (2.5 mM je dCTP, dATP, dTTP, dGTP), 5 µl 10x

ThermoPol Reaction buffer (NEB) sowie 1 µl der Taq DNA-Polymerase. Die Durchführung der PCR erfolgte nach Standardbedingungen.

2.2.5.3 Mutagenese-PCR (Quik change^® Site-directed Mutagenesis)

Punktmutationen sowie Insertionen und Deletionen wurden mittels Mutagenese-PCRs nach dem Protokoll des QuikChange^®Site-Directed Mutagenesis Kits (Stratagene) durchgeführt. Ein 50 µl Ansatz enthielt ~50 ng Template-DNA, 12 pmol pro Oligonukleotid (forward bzw. reverse Primer), 2.5 µl eines dNTPs-Mix (jedes Nukleotid 2.5 mM), 5 µl 10x cloned Pfu Reaction buffer (Stratagene) sowie 1 µl der Pfu Turbo^® DNA-Polymerase (2.5 U/µl; Stratagene). Nach erfolgter PCR wurde dem PCR-Ansatz 1.5 µl DpnI (20 U/µl; NEB) zum Verdau der parentalen Plasmid-DNA hinzugegeben. Nach Inkubation von 90 min bei 37°C wurde ein Aliquot des Verdauansatzes in chemisch kompetente XL10 Gold E. coli Zellen transformiert.

2.2.5.4 Reinigung von PCR-Produkten

Die Reinigung von PCR-Produkten erfolgte mittels des Kits Nukleospin^®Extract II (Machery-Nagel).

2.2.6 Analyse und Klonierung von DNA 2.2.6.1 Restriktionsverdau

Für den Verdau von DNA wurden Restriktionsendonukleasen von New England Biolabs (NEB) mit den jeweils vom Hersteller vorgegebenen Puffersystemen verwendet. Ansätze für einen analytischen Restriktionsverdau enthielten 0.5-1 µg DNA in 10 µl Reaktionsvolumen; bei präparativem Restriktionsverdau für Klonierungen wurden 3-5 µg DNA in 30-40 µl Reaktionsvolumen eingesetzt. Die Ansätze wurden 1-2 h bei der vom Hersteller angegebenen, für das Enzym optimalen Temperatur inkubiert.

Die eingesetzte Enzymmenge richtete sich nach der Aktivität des verwendeten Enzyms sowie nach der Menge und Größe der zu verdauenden DNA.

2.2.6.2 Dephosphorylierung

Die Dephosphorylierung von restriktionsverdauten Plasmiden erfolgte unter Verwendung der Antarktischen Phosphatase (NEB) nach Herstellerangaben.

2.2.6.3 Oligo-Annealing

Für das Annealing von komplementären Oligonukleotide wurden 50 pmol pro Oligonukleotid in 50 µl Reaktionsvolumen eingesetzt. Das Annealing der Oligonukleotide erfolgte in Annealing-Puffer. Nach einer Inkubation von 3 min bei 98°C auf dem Heizblock wurde der Ansatz in kochendes Wasser gestellt und bis auf Raumtemperatur abgekühlt. Die hybridisierten Oligonukleotide wurden mit der T4 Polynukleotid Kinase (10 U/µl; NEB) phosphoryliert. Der 40 µl Phosphorylierungsansatz enthielt 10 pmol/µl hybridisierte Oligonukleotide, 5 µl 10x T4 DNA-Ligase buffer (Fermentas) und 1 µl der T4 Polynukleotid Kinase. Nach einer

2. Material und Methoden

Inkubation des Ansatzes für 30 min bei 37°C wurde die T4 Polynukleotid Kinase bei 65°C für 20 min inaktiviert. Ein Aliquot des Phosphorylierungsansatzes wurde für die Ligation verwendet.

2.2.6.4 Agarose-Gelelektrophorese

Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte unter Verwendung von TAE-Agarosegelen in TAE-Puffer. Die Gele enthielten 0.9%-2% (w/v) Agarose und 1 µg/ml Ethidiumbromid oder 0.025 µl/ml MidoriGreen bzw. HDgreen^TMPlus.

Bevor die zu analysierenden Proben auf das Gel aufgetragen wurden, wurden sie mit DNA-Ladepuffer versetzt. Die elektrophoretische Auftrennung wurde bei einer konstanten Spannung von 110 V für ca. 45 min durchgeführt. Die Ethidiumbromid gefärbte DNA wurde unter UV-Licht (λ = 254 nm für analysierende Zwecke, λ = 366 nm für präparative Zwecke) detektiert, die MidoriGreen/HDgreen^TMPlus gefärbte DNA unter LED-Licht (λ = 470 nm). Der Vergleich zu einem DNA-Marker ermöglichte eine Größenbestimmung der DNA-Fragmente.

2.2.6.5 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

DNA-Fragmente wurden mit einem Skalpell unter UV-Licht (λ = 366 nm) oder LED-Licht (λ = 470 nm) aus Agarosegelen ausgeschnitten und mit Hilfe des Nukleospin^®Extract II Kits (Machery-Nagel) nach Herstellerangaben aus dem Gel isoliert. Die DNA wurde mit destilliertem, sterilem H2O eluiert.

2.2.6.6 Ligation

Für die Ligation des mit Restriktionsenzymen verdauten Vektors und Inserts wurde die T4 DNA-Ligase von Fermentas mit 10x Ligation buffer (Fermentas) oder 5x Rapid Ligation buffer (Fermentas) als Reaktionspuffer verwendet. Der 15 µl Ligationsansatz wurde über Nacht bei 16°C oder 1-2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Vektor und Insert wurden stets im Verhältnis 1:3 eingesetzt.

2.2.6.7 Transformation von Plasmid-DNA in chemisch kompetente E. coli Zellen Zur Transformation von Plasmid-DNA in chemisch kompetente E. coli Zellen wurden 50 ng Plasmid-DNA (Re-Transformation) oder 7.5 µl Ligationsansatz zu 50 µl kompetenten Zellen hinzugegeben und vorsichtig gemischt (Pope & Kent 1996). Nach einer Inkubation von 30 min auf Eis folgte ein Hitzeschock bei 42°C für 30 sec. Nach weiteren 2 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen auf Selektivagarplatten (meist LB-Amp) ausplattiert. Die Selektion erfolgte über Nacht bei 37°C.

2.2.6.8 Sequenzierung von DNA

Sequenzierungen wurden von der GATC Biotech AG durchgeführt.

2.2.7 Isolation der genomischen DNA aus Hefezellen

Die Isolierung der genomischen DNA aus Hefezellen erfolgte nach dem Protokoll von Hoffman und Winston (1987) (Hoffman & Winston 1987). Zellen einer 3 ml

Übernachtkultur wurden durch Zentrifugation (16100 x g, 30 sec, RT) geerntet und in 200 µl Puffer A resuspendiert. Nach Zugabe von 200 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und 200 µl Glasbeads wurde die Probe für 3 min bei 4°C gevortext. Es folgte die Zugabe von 200 µl TE. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (16100 x g, 7.5 min, RT) entfernt und die obere wässrige Phase wurde mit ~150 µl Chloroform versetzt. Nach kräftigem Vortexen wurden die wässrige und organische Phase erneut durch Zentrifugation (16100 x g, 7.5 min, RT) getrennt. Um die DNA der oberen wässrigen Phase aufzukonzentrieren, schloss sich der DNA-Extraktion eine DNA-Fällung mit Ethanol an. Hierzu wurde der oberen wässrigen Phase 1 ml 100% Ethanol hinzugegeben und die Probe wurde für 2 min bei RT und 16100 x g zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde in 400 µl TE resuspendiert. Der Zugabe von 10 µl 4 M Ammoniumacetat und 1 ml 100% Ethanol folgte ein 2 minütiger Zentrifugationsschritt bei RT und 16100 x g. Das DNA-Pellet wurde für 5 min bei 45°C in der SpeedVac getrocknet und in 50 µl TE resuspendiert.

2.2.8 Hefetransformation

Die Transformation von Plasmid-DNA in Hefe erfolgte in der Regel nach dem Protokoll der One Step Transformation von Chen et al. (1992). Gendeletionen und die Insertion einer Tag-Sequenz ins Genom wurden nach dem Protokoll der High Efficiency Transformation von Gietz und Schiestl (2007) durchgeführt (Gietz & Schiestl 2007).

2.2.8.1 One Step Transformation

Auf einer YPDA-Platte kultivierte Zellen wurden in 50 µl One Step Puffer resuspendiert. 1-2 µg Plasmid-DNA und 10 µg denaturierte Heringssperma-DNA (Sigma-Aldrich) wurden dem Transformationsmix hinzugegeben. Der Transfomationsmix wurde 10 sec gevortext und inkubierte für 30 min bei 43°C. Der Transformationsmix wurde dann direkt auf eine Selektivagarplatte ausplattiert. Es folgte eine 2-3-tägige Inkubation der Platte bei 30°C. Diese Methode wurde auch zur Co-Transformation von zwei Plasmiden verwendet.

2.2.8.2 High Efficiency Transformation

Eine Übernachtkultur des zu transformierenden Hefestamms wurde in 10 ml YPDA-Medium auf eine OD600 von ~ 0.17 verdünnt. Bei einer OD600 von ~ 0.68 wurden die Zellen durch Zentrifugation (3000 x g, 10 min, RT) geerntet. Das Zellpellet wurde mit bidestilliertem H2O und mit 100 mM LiAc gewaschen und anschließend in 160 µl 100 mM LiAc resuspendiert. 50 µl dieser Zellsuspension wurden abermals pelletiert und in 360 µl Transformationsmix (240 µl 50% (w/v) PEG 3500, 18 µl 2M LiAc, 50 µl denaturierte Heringssperma-DNA (Sigma-Aldrich) und 52 µl der entsprechenden DNA (gelöst in H₂O)) resuspendiert. Der Zell-Transformationsmix wurde bei 43 °C für 40 min inkubiert. Nach Zentrifugation (5900 x g, 1 min, RT) und Abnahme des Transformationsmix wurden die transformierten Zellen in 200 µl sterilem H₂O resuspendiert und je nach Bedarf auf eine YPDA-Platte oder direkt auf eine Selektionsplatte ausplattiert. Die Platte wurde über Nacht bei 30°C inkubiert. Am

2. Material und Methoden

Folgetag wurden die erhaltenen Transformanten auf entsprechende Selektionsplatten Replika plattiert und für weitere 2 Tage bei 30°C inkubiert.

2.2.9 Gap repair

Zur Durchführung der Methode des Gap repairs wurde im Wesentlichen dem Protokoll der One Step Transformation gefolgt; jedoch wurde dem Transformationsmix anstelle der Plasmid-DNA ein durch Restriktionsendonukleasen linearisierter Vektor und ein PCR-Produkt mit entsprechend homologen Sequenzen hinzugegeben.

2.2.10 Verpaarung und Sporulation von Hefezellen sowie Tetradenanalyse

Zur Verpaarung haploider MATa und MATα Hefestämme wurden Zellen der entsprechenden Hefestämme auf einer YPDA-Platte übereinander ausgestrichen und für 3-4 h bei 30°C inkubiert. Anschließend wurden diploide Zellen mittels eines Mikromanipulators unter dem Durchlichtmikroskop (Axioskop 40; Zeiss) auf einer YPDA-Platte isoliert und für weitere 2-3 Tage bei 30°C inkubiert. Zur Sporulation wurden diploide Zellen in Sporulationsmedium gegeben und für 2-3 Tage bei 30°C im Roller inkubiert. Die Sporulation der Zellen wurde mittels Durchlichtmikroskop (Leitz) überprüft. Um für die folgende Tetradenanalyse die Wand der Asci zu verdauen, wurden zu 100 µl der sporulierten Zellen 2.5 µl Zymolase (5 mg/ml) hinzugegeben und für 10 min bei RT inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion auf Eis wurden 8 µl der Zellsuspension auf einer YPDA-Platte ausgestrichen. Die vier Sporen einer Tetrade wurden mit Hilfe eines Mikromanipulators unter dem Durchlichtmikroskop (Axioskop 40; Zeiss) auf einer YPDA-Platte separiert. Nach 2 Tagen Inkubation bei 30°C wurden die haploiden Zellen auf Selektionsplatten Replika plattiert, um ihren Genotyp zu ermitteln. Zur Bestimmung ihres Kreuzungtyps wurden die Sporen mit MATa und MATα Teststämmen verpaart und auf SD-Platten ausplattiert, die weder Aminosäuren noch Adenin und Uracil enthielten.

2.2.11 Zellzahlbestimmung (OD600)

Die Bestimmung der Zellzahl in Hefekulturen erfolgte durch Messung der optischen Dichte (OD) dieser Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 nm mit dem SmartSpec^TMPlus Spektrophotometer von Bio-Rad. Als Referenz diente das entsprechende Medium bzw. H2O.

2.2.12 Serielle Verdünnungsreihen

Zur Analyse des Wachstums verschiedener Hefestämme wurden von Zellen der mittleren Log-Phase (OD600~ 1) fünf serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:5 in bidestilliertem, sterilem H2O hergestellt. 2.5 µl jeder Verdünnung wurden nebeneinander auf die entsprechenden Selektionsplatten aufgebracht und für 2-4 Tage bei 30°C inkubiert.

2.2.13 Mikrotiterplatten-basierter Wachstumstest

Mikrotiterplatten-basierte Wachstumstests wurden in einem Microplate Reader (TECAN) durchgeführt. Das Setup und die Durchführung der Mikrotiterplatten-basierten Wachstumstests oblag in Form einer Kollaboration Mitgliedern des Labors von Dr. Joseph Schacherer in Straßburg (Anastasie Sigwalt, Department of Molecular Genetics, Genomics and Microbiology). In Vorbereitung der Mikrotiterplatten-basierten Wachstumstests wurden 150 µl YPDA-Vorkultur der verschiedenen Hefestämme über Nacht bei 30°C in Mikrotiter-Platten inkubiert. Mit diesen Vorkulturen wurde zu Beginn des Wachstumstests in neuen Mikrotiterplatten 150 µl Medium, das die den zu untersuchenden Wachstumsbedingungen entsprechenden Reagenzien enthielt, auf eine OD600 von ~ 0.007 angeimpft. Unter verschiedenen Wachstumsbedingungen wurde daraufhin das Wachstum der verschiedenen Hefestämme über 48 Stunden hinweg verfolgt. Zur Erstellung von Wachstumskurven wurde automatisch über die gesamte Zeitdauer von 48 Stunden alle 10 min die optische Dichte der Kulturen bei 600 nm gemessen. Anhand der erstellten Wachstumskurven wurden automatisch für jeden Stamm unter jeder Wachstumsbedingung die Generationsdauer (g[h]), die spezifische Wachstumsrate (µ[h^-1]) und die Dauer der Lag-Phase (L[h]) seines Wachstums berechnet. Alle Wachstumstests wurden in Duplikaten durchgeführt.

2.2.14 Herstellung von Hefezellextrakten

Zur Herstellung von Hefezellextrakten wurde eine alkalische Lyse der Zellen nach dem Protokoll von Loayza et al. (1998) durchgeführt. 2.5 OD600 Zellen der Log-Phase wurden durch Zentrifugation (16100 x g, RT, 30 sec) geerntet und in 1 ml kaltem H₂O resuspendiert. Durch Zugabe von 150 µl 2 N NaOH/ 1 M β-Mercaptoethanol wurden die Zellen für 15 min auf Eis lysiert. Die Proteine wurden mit 5% (v/v) TCA für 15 min auf Eis gefällt und durch Zentrifugation (16800 x g, 10 min, 4°C) pelletiert. Das Proteinpellet wurde in 35 µl TCA-Probenpuffer und 15 µl 4x SDS-Probenpuffer resuspendiert. Um eine Aggregation von Membranproteinen zu verhindern, wurden die Proteinlysate für 15-20 min bei 37°C inkubiert. Zur Analyse der Hefezellextrakte wurden 0.5-1 OD des Proteinlysats auf ein Gel geladen.

2.2.15 Degradationsassay (Cycloheximid-/Anisomycin-Chase)

10 OD600 exponentiell wachsender Hefezellen wurden durch Zentrifugation geerntet (3000 x g, RT, 10 min) und in 3.9 ml vorgewärmtem Medium resuspendiert. Nach einer Inkubation von 10 min bei 30°C wurde der Translationsinhibitor Cycloheximid in einer Endkonzentration von 0.25 mg/ml hinzugegeben. Ein 950 µl Aliquot (= 2.5 OD Zellen) wurde direkt nach der Zugabe des Cycloheximids (t₀) sowie zu den jeweils angegebenen Zeitpunkten (t1-t3) entnommen. Nach Ernte der Zellen wurde das Zellpellet in 200 µl kaltem STOP Puffer resuspendiert. Der STOP Puffer wurde nach 10 min Inkubation der Probe auf Eis abgenommen und das Zellpellet bei -20°C über Nacht gelagert. Die Zelllyse erfolgte nach dem Protokoll von Loayza et al. (1998).

2. Material und Methoden

Degradationsassays mit K. lactis Hefezellen wurden mit dem Translationsinhibitor Anisomycin (Endkonzentration: 0.25 mg/ml) durchgeführt, da K. lactis Ribosomen resistent gegen die Inhibierung ihrer Proteinsynthese mit Cycloheximid sind (Dehoux et al. 1993). Der Assay erfolgte ansonsten wie bereits beschrieben.

Zur Untersuchung der Proteindegradation in Hefestämmen, die ein temperatursensitives Allel tragen, wurden die Zellen bei der permissiven Temperatur bis zu einer OD600 ~ 0.8 herangezüchtet. Nach Ernte der Zellen wurden sie in frischem Medium resuspendiert und in diesem für 30 min bei der restriktiven Temperatur kultiviert. Der nachfolgende Degradationsassay erfolgte wie bereits beschrieben bei restriktiver Temperatur.

2.2.16 Subzellulärer Fraktionierungs- und Solubilisierungsassay

Für die subzelluläre Fraktionierung und Solubilisierung von Membranproteinen wurde im Wesentlichen dem Protokoll von Swanson et al. (2001) gefolgt. 25 OD₆₀₀ Zellen der Log-Phase wurden durch Zentrifugation (3000 x g, RT, 10 min) geerntet und in 500 µl kaltem Fraktionierungspuffer resuspendiert. Nach Zugabe von 400 µl Glasbeads wurden die Hefezellen durch Vortexen (4 Zyklen: je 30 sec Vortexen mit folgender 30 sec Inkubation auf Eis) aufgeschlossen. Die Glasbeads wurden dreimal mit 200 µl Fraktionierungspuffer gewaschen und die jeweiligen Überstände der Waschschritte wurden zum Zelllysat gegeben. Die Zelltrümmer wurden dann durch wiederholte Zentrifugation bei 600 x g und 4°C für 5 min abgetrennt. Der Überstand wurde in 6 Aliquote aufgeteilt. Ein Aliquot diente als Input. Die anderen fünf Aliquote wurden mit Fraktionierungspuffer oder mit einem der folgenden, in Fraktionierungspuffer gelösten Detergentien behandelt: 2.5 M Harnstoff, 0.5 M NaCl, 0.1 M Na₂CO₃ pH 11.5 oder 1%

Triton X-100 + 0.5 M NaCl. Während der 1-stündigen Inkubation auf Eis wurden die Proben gelegentlich durch Invertieren gemischt. Danach wurden die Lysate durch Zentrifugation bei 4°C und 16800 x g für 30 min in Pellet (P)- und Überstand (Ü)-Fraktionen aufgetrennt. Die Pellet-(Ü)-Fraktionen wurden mit 500 µl kaltem Fraktionierungspuffer gewaschen, der die entsprechenden bereits aufgeführten Detergentien enthielt (16800 x g, 10 min, 4°C). Die Proteinpellets der Pellet-Fraktionen wurden in 35 µl TCA-Probenpuffer und 15 µl 4x SDS-Probenpuffer resuspendiert.

Proteine der Überstand-Fraktionen wurden durch Zugabe von 5% TCA für 20 min auf Eis gefällt. Nach Zentrifugation bei 16800 x g und 4°C für 10 min wurden die Proteinpellets der Überstand-Fraktionen ebenfalls in 35 µl TCA-Probenpuffer und 15 µl 4x SDS-Probenpuffer resuspendiert. Der Fraktionierungs- und Solubilisierungsassay wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.

Proteine der Überstand-Fraktionen wurden durch Zugabe von 5% TCA für 20 min auf Eis gefällt. Nach Zentrifugation bei 16800 x g und 4°C für 10 min wurden die Proteinpellets der Überstand-Fraktionen ebenfalls in 35 µl TCA-Probenpuffer und 15 µl 4x SDS-Probenpuffer resuspendiert. Der Fraktionierungs- und Solubilisierungsassay wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.

Im Dokument Proteinqualitätskontrolle am ER und im Nukleus : Funktionelle Charakterisierung der RING E3-Ligasekomplexe Doa10 und Asi (Seite 63-0)