Proteinqualitätskontrolle am ER und im Nukleus:
Funktionelle Charakterisierung der RING E3-Ligasekomplexe Doa10 und Asi
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Elisabeth Stürner
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juli 2015
1. Referent: Professor Dr. Martin Scheffner
2. Referent: Professor Dr. Thomas U. Mayer
Meinen Eltern
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in:
Split-Doa10: a naturally split polytopic eukaryotic membrane protein generated by fission of a nuclear gene.
Stuerner E, Kuraku S, Hochstrasser M, Kreft SG (2012) PLoS One 7(10):e45194. doi: 10.1371/journal.pone.0045194.
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ... i
Abstract ... iii
1. Einleitung ... 1
1.1 Das Ubiquitin-Proteasom-System... 2
1.1.1 Ubiquitin und Arten der Ubiquitinierung ... 2
1.1.2 Die Ubiquitin-Konjugationskaskade ... 4
1.1.2.1 Die drei Subklassen der E3-Ligasen ... 5
1.1.2.1.1 HECT Ligasen ... 5
1.1.2.1.2 RING/U-Box Ligasen ... 6
1.1.2.1.3 RBR Ligasen ... 7
1.1.2.2 De-Ubiquitinierung ... 7
1.1.3 Das 26S Proteasom ... 8
1.2 Qualitätskontrolle im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und ER-assoziierte Degradation (ERAD) ... 9
1.2.1 Die Unfolded Protein Response (UPR) im ER ... 11
1.2.2 ERAD E3-Ligasekomplexe in S. cerevisiae ... 11
1.2.2.1 Der Hrd1 Komplex ... 11
1.2.2.2 Der Doa10 Komplex ... 13
1.2.3 Substraterkennung und ERAD Degradationswege ... 14
1.2.4 Retrotranslokation von ERAD Substraten ... 16
1.2.5 Extraktion von ERAD Substraten und ihr Transfer zum Proteasom ... 19
1.3 Die Qualitätskontrolle der Hefe S. cerevisiae im Cytosol und im Nukleus ... 21
1.4 Die E3-Ligase Doa10 und ihre Rolle in der zellulären Qualitätskontrolle ... 23
1.4.1 Lokalisation und Topologie von Doa10 ... 23
1.4.2 Doa10 Orthologe ... 24
Inhaltsverzeichnis
1.4.3 Komponenten des Doa10 Komplexes ... 25
1.4.3.1 Das E2-Enzym Ubc6 ... 26
1.4.3.2 Das E2-Enzym Ubc7 ... 26
1.4.4 Doa10 Substrate ... 27
1.4.5Offene Forschungsfragen des E3-Ligasekomplexes Doa10 ... 32
1.5 Zielsetzung ... 34
2. Material und Methoden ... 35
2.1 Material ... 35
2.1.1 Puffer und Lösungen ... 35
2.1.2 Chemikalien und Reagenzien ... 36
2.1.3 Medien ... 38
2.1.3.1 Medien zur Kultivierung von E. coli Zellen ... 38
2.1.3.2 Medien zur Kultivierung von S. cerevisiae und Kluyveromyces Zellen . 38 2.1.4 Zellen ... 39
2.1.4.1 E. coli Bakterienstämme ... 39
2.1.4.2 Hefestämme ... 39
2.1.4.2.1 S. cerevisiae ... 39
2.1.4.2.2 Genus Kluyveromyces ... 40
2.1.5 Synthetische Oligonukleotide ... 41
2.1.6 Plasmide ... 42
2.1.7 Enzyme ... 45
2.1.8 Antikörper ... 46
2.1.9 Längenstandards ... 46
2.1.9.1 DNA-Marker ... 46
2.1.9.2 Proteinmarker ... 46
2.1.10 Kits ... 47
2.1.11 Geräte ... 47
2.2 Methoden ... 48
2.2.1 Kultivierung und Lagerung von Zellen ... 48
2.2.1.1 Escherichia coli Bakterien ... 48
2.2.1.2 Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces Hefezellen ... 48
2.2.2 Präparation und Quantifizierung von Plasmid-DNA ... 48
2.2.2.1 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen ... 48
2.2.2.2 Quantifizierung von Plasmid-DNA ... 49
2.2.3 Präparation und Quantifizierung von RNA aus Kluyveromyces Hefezellen . 49 2.2.3.1 Isolierung der Gesamt-RNA aus Kluyveromyces Hefezellen ... 49
2.2.3.2 Quantifizierung von RNA ... 49
2.2.4 Northern Blot Analyse ... 49
2.2.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Polymerase Chain Reaction) ... 50
2.2.5.1 PCR zur Generierung neuer DNA-Fragmente ... 50
2.2.5.2 Analytische PCR ... 50
2.2.5.3 Mutagenese-PCR (Quik change® Site-directed Mutagenesis)... 51
2.2.5.4 Reinigung von PCR-Produkten ... 51
2.2.6 Analyse und Klonierung von DNA ... 51
2.2.6.1 Restriktionsverdau ... 51
2.2.6.2 Dephosphorylierung ... 51
2.2.6.3 Oligo-Annealing ... 51
2.2.6.4 Agarose-Gelelektrophorese ... 52
2.2.6.5 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ... 52
2.2.6.6 Ligation ... 52
2.2.6.7 Transformation von Plasmid-DNA in chemisch kompetente E. coli Zellen ... 52
2.2.6.8 Sequenzierung von DNA ... 52
2.2.7 Isolation der genomischen DNA aus Hefezellen ... 52
2.2.8 Hefetransformation ... 53
Inhaltsverzeichnis
2.2.8.1 One Step Transformation ... 53
2.2.8.2 High Efficiency Transformation ... 53
2.2.9 Gap repair ... 54
2.2.10 Verpaarung und Sporulation von Hefezellen sowie Tetradenanalyse ... 54
2.2.11 Zellzahlbestimmung (OD600) ... 54
2.2.12 Serielle Verdünnungsreihen ... 54
2.2.13 Mikrotiterplatten-basierter Wachstumstest ... 55
2.2.14 Herstellung von Hefezellextrakten ... 55
2.2.15 Degradationsassay (Cycloheximid-/Anisomycin-Chase) ... 55
2.2.16 Subzellulärer Fraktionierungs- und Solubilisierungsassay ... 56
2.2.17 Co-Immunpräzipitation (Co-IP) ... 56
2.2.18 In vivo Ubiquitinierungsassay ... 57
2.2.19 Inhibition des Proteasoms ... 58
2.2.20 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 58
2.2.21 Western Blot und Immundetektion ... 58
3. Ergebnisse ... 60
3.1 Charakterisierung des Split-Doa10 in Kluyveromyces lactis ... 60
3.1.1 Der DOA10 Locus in K. lactis exprimiert zwei Doa10 Fragmente. ... 62
3.1.2 Die IVS (Intervening Sequence) des K. lactis DOA10 Locus enthält einen funktionellen Promotor ... 65
3.1.3Das N- und C-terminale Fragment des Split-KlDoa10 sind integrale Membranproteine ... 68
3.1.4 Das N- und C-terminale Fragment des Split-Doa10 interagieren in K. lactis miteinander ... 69
3.1.5 Die beiden Fragmente des Split-Doa10 bilden zusammen eine funktionelle Doa10 E3-Ligase ... 72
3.1.5.1Die co-exprimierten KlDoa10 Fragmente rekonstituieren in S. cerevisiae eine funktionelle Doa10 E3-Ligase ... 72 3.1.5.2Endogenes Split-KlDoa10 zeigt in K. lactis Doa10 E3-Ligaseaktivität . 75
3.1.5.3Weder das Nt- noch das Ct- Fragment verfügt für sich allein über eine Doa10 E3-Ligaseaktivität ... 77 3.1.6Alle Spezies des Genus Kluyveromyces enthalten eine IVS in ihrem DOA10
Locus ... 79 3.1.7Untersuchung einer physiologischen Funktion des Splits im K. lactis DOA10
Locus ... 83 3.1.7.1Untersuchung eines möglichen Vorteils der Expression in Form von zwei
Untereinheiten für die Regulation der Doa10 E3-Ligaseaktivität ... 83 3.1.7.2Untersuchung einer zusätzlichen Funktion der beiden Fragmente des
Split-KlDoa10 unabhängig von ihrer gemeinsamen Doa10 E3- Ligasefunktion ... 85 3.1.7.2.1Die Split-KlDoa10 Fragmente werden in Abwesenheit des jeweils
anderen Fragments in K. lactis korrekt in die Membran inseriert.... 86 3.1.7.2.2Die Split-KlDoa10 Fragmente sind in Abwesenheit des jeweilig
anderen Fragments in K. lactis stabil ... 87 3.1.7.3WT, doa10Δ, doa10NtΔ und doa10CtΔ K. lactis Zellen zeigen unter
verschiedenen Wachstums- und Stressbedingungen keine stark veränderten Wachstumskinetiken ... 89 3.2 Funktionelle Charakterisierung des cytosolischen Loops 2 der S. cerevisiae E3- Ligase Doa10 mit Hilfe eines artifiziell gesplitteten ScDoa10 ... 94 3.2.1 Generierung eines artifiziell gesplitteten Doa10 Proteins in S. cerevisiae .... 95 3.2.2Der N- und C-terminale Teil eines artifiziell gesplitteten Doa10 ist in Co- Expression mit dem jeweilig anderen Teil stabil ... 97 3.2.3Untersuchung der Aktivität der artifiziell gesplitteten Doa10 Versionen
gegenüber Doa10 Substraten ... 99 3.2.3.1Artifiziell gesplittetes Doa10 vermittelt die Degradation des E2-Enzyms
Ubc6 gleich wie endogenes Doa10 ... 99 3.2.3.2Die durch artifiziell gesplittetes Doa10 vermittelte Degradation der
Doa10 Substrate Pca1 und Ura3-HA-CL1 scheint annähernd unverändert zu sein ... 102 3.2.3.3Die durch artifiziell gesplittetes Doa10 vermittelte Degradation von
Deg1-Fusionsproteinen scheint stark verlangsamt zu sein ... 104 3.3 Charakterisierung der Degradation des artifiziell generierten Doa10 Fragments Nt1-
390 durch den nukleären E3-Ligasekomplex Asi ... 107
Inhaltsverzeichnis
3.3.1 Der N-terminale Teil Nt1-390 des artifiziell gesplitteten Doa10 Proteins ist in
Abwesenheit des C-terminalen Teils Ct394-1319 instabil ... 109
3.3.2 Nt1-390 wird proteasomal abgebaut ... 111
3.3.3 Der Abbau von Nt1-390 ist hauptsächlich von dem E2-Enzym Ubc7 abhängig ... 113
3.3.4 Die ERAD E3-Ligase Hrd1 ist für den Abbau von Nt1-390 nicht essentiell . 116 3.3.5 Nt1-390 wird nicht durch Auto-Ubiquitinierung abgebaut ... 117
3.3.6 Nt1-390 wird korrekt in die Membran inseriert ... 118
3.3.7 Die AAA-ATPase Cdc48 ist für die Degradation von Nt1-390 erforderlich .. 119
3.3.8 Die E3-Ligasen Ubr1, San1, Hul5 und Rsp5 sind nicht an der Degradation von Nt1-390 beteiligt ... 121
3.3.9 Der nukleäre Proteinkomplex Asi vermittelt den Abbau von Nt1-390 ... 123
3.3.9.1Die Proteine Asi1, Asi2 sowie Asi3 des Asi Komplexes sind für die Degradation von Nt1-390 erforderlich ... 124
3.3.9.2 Nt1-390 wird in Asi1-abhängiger Weise poly-ubiquitiniert ... 125
4. Diskussion ... 128
4.1 Das Split-Doa10: ein natürlich gesplittetes Doa10 Ortholog in der Milchhefe Kluyveromyces lactis ... 128
4.1.1 Die Milchhefe Kluyveromyces lactis – eine nicht-konventionelle Hefe ... 129
4.1.2 Der Expressionsmechanismus des Split-Doa10 in K. lactis ... 130
4.1.2.1 Das Split-KlDoa10 besteht aus zwei Untereinheiten ... 130
4.1.2.2 Die IVS Sequenz des KlDOA10 Locus enthält einen funktionellen Promotor ... 131
4.1.2.3 Das relative Expressionsverhältnis der beiden Split-KlDoa10 Fragmente… ... 133
4.1.3 Das Split-Doa10 stellt in K. lactis eine funktionelle Doa10 E3-Ligase dar 134 4.1.3.1 Die Interaktion der beiden Split-KlDoa10 Fragmente ... 134
4.1.3.2 Endogenes Split-KlDoa10 besitzt Doa10 E3-Ligaseaktivität ... 135
4.1.3.3 Das potentielle Substratspektrum des Split-KlDoa10 ... 135
4.1.3.4 Die subzelluläre Lokalisation des Split-KlDoa10 ... 137
4.1.3.5 Der Doa10 E3-Ligasekomplex in K. lactis ... 138 4.1.4 Das Split-Doa10 ist ein charakteristisches Merkmal des Genus
Kluyveromyces ... 139
4.1.5 Potentielle Vorteile eines gesplitteten Doa10 Orthologs in K. lactis ... 140 4.1.5.1Eine differenziertere Regulation der Doa10 E3-Ligaseaktivität als Vorteil
des Splits? ... 141 4.1.5.2Zusätzliche individuelle Funktionen der beiden Split-KlDoa10 Fragmente
als Vorteil des Splits? ... 142 4.1.6Split-Doa10: das erste Beispiel eines natürlich gesplitteten Membranproteins
entstanden durch die Teilung eines nukleären Gens ... 144 4.2 Das artifiziell gesplittete S. cerevisiae Doa10 Protein und seine Anwendung bei der
funktionellen Charakterisierung des cytosolischen Loops 2 der Doa10 E3- Ligase….. ... 149 4.2.1 Das artifiziell gesplittete Doa10 in S. cerevisiae ... 149 4.2.2Der intrinsisch ungeordnete Loop 2 der Doa10 E3-Ligase scheint für eine
effiziente Degradation von Deg1-Fusionsproteinen von Bedeutung zu sein151 4.3 Der E3-Ligasekomplex Asi und seine Rolle in der nukleären
Proteinqualitätskontrolle ... 157 4.3.1Die proteasomale Degradation des artifiziell generierten Doa10 Fragments
Nt1-390 wird durch den nukleären E3-Ligasekomplex Asi vermittelt ... 158 4.3.1.1Nicht-assembliertes Nt1-390 wird durch das 26S Proteasom effizient
abgebaut ... 158 4.3.1.2Der nukleäre E3-Ligasekomplex Asi vermittelt die proteasomale
Degradation von Doa10 Nt1-390 ... 160 4.3.1.3Die Asi vermittelte Degradation von Nt1-390 ist hauptsächlich von dem
E2-Enzym Ubc7, in geringem Maß von Ubc4 abhängig ... 166 4.3.1.4 Nicht-assembliertes Nt1-390 scheint effizient in die Innere Nukleus- Membran (INM) zu translozieren ... 169 4.3.1.5 Die Cdc48 ATPase ist für die Asi vermittelte Degradation von Nt1-390
unabdingbar ... 172 4.3.1.6Modell der INM-assoziierten Degradation von Doa10 Nt1-390 durch den
nukleären E3-Ligasekomplex Asi ... 173 4.3.2Der nukleäre E3-Ligasekomplex Asi als Hüter der nukleären
Proteinhomöostase im Fokus jüngster Forschung ... 175
Inhaltsverzeichnis
5. Anhang ... 179
6. Literaturverzeichnis ... 192
7. Abkürzungsverzeichnis ... 218
Danksagung ... 220
Zusammenfassung
Zur Wahrung der zellulären Proteinhomöostase verfügt die eukaryotische Zelle über fein regulierte Proteinqualitätskontrollsysteme. Ein komplexes Netzwerk aus molekularen Chaperonen und E3-Ligasen vermittelt die partielle Entfaltung und erneute Faltung sowie den Abbau von anomalen Proteinen. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae spielt die polytopische membranständige E3-Ligase Doa10 eine zentrale Rolle in der Proteinqualitätskontrolle am Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Cytoplasma und im Nukleus. Trotz intensiver Forschungsarbeiten sind die durch Doa10 und andere E3-Ligasen vermittelten Degradationsprozesse im Rahmen der zellulären Proteinqualitätskontrolle bislang nicht vollständig erforscht.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein vor kurzem in der Milchhefe Kluyveromyces lactis entdecktes, natürlich gesplittetes Ortholog der membranständigen E3-Ligase Doa10 funktionell charakterisiert. Das Doa10 Protein in K. lactis wird im Gegensatz zum S. cerevisiae Doa10 Protein und seinen Orthologen in Form von zwei Untereinheiten exprimiert (Split-KlDoa10): einem N-terminalen Fragment mit einer RING-CH Domäne sowie zwei Transmembrandomänen (TMs) und einem größeren C- terminalen Fragment mit mindestens 12 TMs. Die Expression eines Doa10 Proteins in Form von zwei Untereinheiten ist die direkte Folge der Existenz einer Intervening Sequence (IVS) im K. lactis DOA10 Locus, die das offene Leseraster des DOA10 Gens in zwei separate Leseraster teilt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde innerhalb dieser IVS ein funktioneller Promotor entdeckt, der die Expression des C-terminalen KlDoa10 Fragments vermittelt. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die beiden Fragmente des Split-KlDoa10 miteinander interagieren und zusammen eine funktionelle Doa10 E3- Ligase in K. lactis rekonstituieren. Interessanterweise inseriert jedes der beiden Split- KlDoa10 Fragmente auch in Abwesenheit seines Partnerfragments korrekt in die Membran und ist metabolisch stabil. Die Teilung des DOA10 Gens konnte zudem als ein charakteristisches Merkmal des gesamten Genus Kluyveromyces identifiziert werden. Die Expression eines Split-Doa10 in K. lactis könnte sich unter zwei Aspekten als vorteilhaft erweisen: Ein Fragment oder beide Fragmente könnten eine zusätzliche, individuelle Funktion wahrnehmen und/oder der Split könnte eine differenziertere Regulierung der Doa10 E3-Ligaseaktivität erlauben. Die im ersten Teil dieser Arbeit erzielten Ergebnisse sind vor allem in zweifacher Hinsicht von Interesse: Zum einen stellt das Split-Doa10 zweifelsfrei das erste Beispiel eines natürlich gesplitteten Membranproteins dar, das durch Teilung eines nukleären Gens entstanden ist. Zum anderen können die Ergebnisse der funktionellen Charakterisierung des Split-KlDoa10 nicht nur zu einem besseren Verständnis der Doa10 E3-Ligase in S. cerevisiae beitragen (siehe unten), sondern sie erlauben auch weiterführende Schlüsse in Bezug auf die Evolution des Doa10 Proteins und möglicherweise auf die Diversifikation von RING- CH Membranproteinen in höheren Eukaryoten.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde zur Erleichterung der detaillierteren funktionellen Charakterisierung der E3-Ligase Doa10 in S. cerevisiae nach dem Vorbild des Split- Doa10 in K. lactis ein artifiziell gesplittetes ScDoa10 Protein generiert, das gegenüber
einigen Doa10 (Modell-) Substraten aktiv ist. Interessanterweise zeigten verschiedene Versionen dieses artifiziell gesplitteten Doa10, die sich in der Länge der Doa10 Loop 2 Sequenz unterscheiden, gegenüber Doa10 Modellsubstraten, welche über das Doa10 spezifische Degron Deg1 verfügen, eine reduzierte E3-Ligaseaktivität. Dies könnte darauf hindeuten, dass dem intrinsisch ungeordneten cytosolischen Loop 2 der Doa10 E3-Ligase eine Funktion bei der Degradation von Deg1-Fusionsproteinen zukommt.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der in der Inneren Nukleus-Membran (INM) lokalisierte Asi Komplex, der aus den RING-C2 Domänen Proteinen Asi1 und Asi3 sowie aus Asi2 besteht, als neuer E3-Ligasekomplex identifiziert. Bei der Untersuchung des artifiziell gesplitteten ScDoa10 konnte beobachtet werden, dass das N-terminale ScDoa10 Fragment Nt1-390 in Abwesenheit seines C-terminalen Partnerfragments effizient abgebaut wird. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Charakterisierung der Degradation von Nt1-390 zeigte nicht nur, dass der Abbau von Nt1-390 stark von dem E2-Enzym Ubc7 und in geringerem Maße von Ubc4 abhängt, sondern auch, dass für eine effiziente Degradation von Nt1-390 die AAA-ATPase Cdc48 erforderlich ist.
Überraschenderweise war keine der bislang bekannten E3-Ligasen der zellulären Proteinqualitätskontrolle in den Abbau von Nt1-390 involviert; eine durch Auto- Ubiquitinierung vermittelte Degradation von Nt1-390 konnte ebenfalls ausgeschlossen werden. Degradationsassays in Asi1-, Asi2- und Asi3-defizienten Zellen offenbarten, dass alle drei Proteine des Asi Komplexes für den proteasomalen Abbau von N1-390 essentiell sind. Obwohl bereits zuvor die Hypothese aufgestellt wurde, dass der Asi Komplex über eine intrinsische E3-Ligaseaktivität verfügen könnte, konnte diese bislang nicht experimentell nachgewiesen werden. Während der Charakterisierung der Asi vermittelten Degradation von Nt1-390 wurden drei Studien veröffentlicht, die den Asi Komplex ebenfalls als einen Wächter über die Integrität der nukleären Proteinhomöostase identifizierten, der die INM-assoziierte Degradation von anomalen und/oder fehllokalisierten Proteinen vermittelt. Das im Rahmen dieser Arbeit generierte artifizielle Asi Substrat ScDoa10 Nt1-390 stellt jedoch zur Zeit nicht nur eines der am besten charakterisierten Substrate des Asi Komplexes (hinsichtlich seiner Abbaukinetiken) dar, sondern es ist auch als Modellsubstrat für die weitere detailliertere Charakterisierung der durch den Asi Komplex vermittelten Proteinqualitätskontrolle im Nukleus ganz hervorragend geeignet.
Abstract
Sophisticated protein quality control systems ensure maintenance of a functional proteome in eukaryotic cells. An elaborate network of molecular chaperones and ubiquitin ligases mediates (re)folding and degradation of aberrant proteins. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the polytopic membrane ubiquitin ligase Doa10 plays a major role in protein quality control at the endoplasmic reticulum (ER), in the cytoplasm and in the nucleus. Despite intensive research efforts, degradation processes mediated by Doa10 as well as by other ubiquitin ligases implicated in cellular protein quality control are far from being fully understood.
In the first part of this study, a recently identified naturally occurring split version of the polytopic membrane E3 ligase Doa10 in the milk yeast Kluyveromyces lactis was functionally characterized. Whereas Doa10 is generally expressed as a single polypeptide, it is expressed as two subunits in K. lactis (split-KlDoa10): an N-terminal fragment consisting of the RING-CH domain as well as two transmembrane domains (TMs) and a larger C-terminal fragment encompassing at least 12 TMs. Expression as two subunits is a direct consequence of the presence of an intervening sequence (IVS) within the KlDOA10 locus which splits the Doa10 open reading frame (ORF) into two.
In this study, a functional promoter was found to be present within the IVS. This promoter drives the expression of the C-terminal KlDoa10 fragment. It was further shown that the two split-KlDoa10 fragments interact physically and reconstitute a functional Doa10 E3 ligase in K. lactis. Interestingly, each of the split-KlDoa10 fragments can insert properly into the membrane independently of the other and is metabolically stable. Moreover, fission of the DOA10 gene was found to be a characteristic feature of the entire Kluyveromyces genus. Expression of Doa10 as two fragments might be beneficial in two ways: Each fragment might perform additional individual functions and/or the split might allow for subtle changes in the regulation of Doa10 activity. The results obtained in the first part of this study are of interest in two respects: First, split-Doa10 represents the first example of a split membrane protein whose generation can be unequivocally traced back to the fission of a nuclear gene.
Second, in addition to contributing to a better understanding of the ubiquitin ligase Doa10 in S. cerevisiae (see below), the results of the functional characterization of split- KlDoa10 also provide new insights into the evolution of Doa10 and potentially into the diversification of RING-CH membrane proteins in higher eukaryotes.
In the second part of this study, an artificially split version of the ScDoa10 protein was generated based on the naturally occurring split-Doa10 in K. lactis. The split ScDoa10 variant was found to be active towards a number of Doa10 (model) substrates and represents a new tool for the functional characterization of the Doa10 E3 ligase in S.
cerevisiae. Interestingly, different versions of artificially split ScDoa10 (differing in length of the Doa10 loop 2 sequence) were specifically impaired towards Deg1- containing Doa10 model substrates suggesting a role of the intrinsically disordered cytosolic loop 2 of Doa10 in the degradation of Deg1 fusion proteins.
In the third part of this study, the inner nuclear membrane (INM)-localized Asi complex consisting of Asi2 and the RING-C2 domain proteins Asi1 and Asi3 was identified as a novel E3 ligase complex. While investigating the artificially split ScDoa10, it was observed that the N-terminal ScDoa10 fragment Nt1-390 is rapidly degraded in the absence of the C-terminal fragment. The proteasomal degradation of Nt1-390 was found to be highly dependent on the E2 enzyme Ubc7 and to a lesser extent on Ubc4.
Unexpectedly, Nt1-390 turnover was independent of any of the known quality control E3 ligases (and was also not due to auto-ubiquitination). Furthermore, the AAA-ATPase Cdc48 was found to be essential for efficient turnover of Nt1-390. Degradation assays in yeast strains lacking either Asi1, Asi2 or Asi3 revealed that all three Asi complex proteins are required for Nt1-390 turnover. Noteworthy, it was previously hypothesized that the Asi complex might have intrinsic E3 ligase activity, however this had not been experimentally shown. While this study was in progress, three studies were published that also identify the Asi complex as a safeguard for nuclear protein homeostasis mediating the INM-associated degradation of aberrant and/or mislocalized proteins.
Notwithstanding, the artificial Asi substrate created in this study, Doa10 Nt1-390, currently represents both one of the best characterized Asi complex substrate (with respect to its degradation kinetics) and the most suitable “model” substrate for a more detailed characterization of the Asi complex mediated quality control in the nucleus.
1. Einleitung
Die eukaryotische Zelle ist in ihrer Überlebensfähigkeit auf ein intaktes und spezifisch arbeitendes Proteom angewiesen. Proteine bestimmen nicht nur die zelluläre Struktur, sondern sind auch wichtige Komponenten des zellulären Transports sowie der zellulären Signaltransduktionswege. Als Enzyme regulieren sie den Stoff- und Energiehaushalt sowie den Zellzyklus. Wesentlich für die biologische Funktion eines Proteins ist seine korrekte Faltung in eine dreidimensionale Struktur (native Konformation); mitunter können post-translationale Modifikationen oder die Assemblierung in einen Proteinkomplex für eine korrekte Funktionsausübung notwendig sein. Die Fehlfaltung oder Nicht-Assemblierung eines Proteins führen zur Exposition von hydrophoben Proteinregionen, die eine Aggregation des Proteins begünstigen (Dobson 2003). Proteinaggregate haben oftmals die Bildung von toxischen Inklusionen innerhalb der Zelle zur Folge (Kopito 2000; Bagola & Sommer 2008).
Unter physiologischen Bedingungen sind Fehlfaltungen häufig das Resultat einer ineffizienten Protein-Biogenese, einer fehlerhaften Transkription bzw. Translation oder sie werden durch destabilisierende Mutationen hervorgerufen. Bei umweltbedingtem oder metabolischem Stress (Hitze, Schwermetalle, ROS (Reaktive Oxygen Species), etc.) sowie im Alter nimmt die Zahl an Fehlfaltungen von Proteinen rapide zu.
Anomale, nicht funktionale Proteine und ihre Folgen, wie z.B. die Bildung von Aggregaten, haben tiefgreifende negative Auswirkungen auf zelluläre Prozesse sowie die Zellhomöostase und stellen damit für die gesamte Zelle eine Gefahr dar. Die eukaryotische Zelle entwickelte daher zur Überwachung und zur Wahrung der zellulären Proteinhomöostase (Proteostase) komplexe, fein regulierte Proteinqualitätskontrollsysteme, die in jedem subzellulären Kompartiment (Cytoplasma, Endoplasmatisches Retikulum (ER), Nukleus und Mitochondrien) zu finden sind (Balch et al. 2008; Chen et al. 2011; Fredrickson & Gardner 2012; Sontag et al. 2014). Die Komponenten der Proteinqualitätskontrollsysteme helfen einem fehlgefalteten Protein entweder durch partielle Entfaltung und erneute Faltung (Refolding) seine native Konformation anzunehmen oder sie eliminieren es, indem sie es der Degradation zuführen oder seine Sequestrierung veranlassen (Esser et al. 2004; Hartl & Hayer-Hartl 2009; Kettern et al. 2010). Die Degradation von anomalen Proteinen wird entweder durch das Ubiquitin-Proteasom-System oder durch das Autophagie-System vermittelt (Amm et al. 2014). Eine zentrale Bedeutung innerhalb der Proteinqualitätskontrollsysteme kommt den molekularen Chaperonen zu (Frydman 2001; McClellan et al. 2005; Hartl & Hayer-Hartl 2009; Hartl 2011; Kriegenburg 2012). Sie sind sowohl in das Refolding als auch in die Degradation von anomalen Proteinen involviert. Unter Stressbedingungen vermögen die Komponenten der Proteinqualitätskontrollsysteme nicht mehr das stark erhöhte Aufkommen an fehlgefalteten Proteinen zu bewältigen. Unter diesen Umständen wird eine zelluläre Stressantwort induziert, welche eine vermehrte Expression der Komponenten der Qualitätskontrollsysteme in den entsprechenden subzellulären Kompartimenten zur Folge hat. Zu diesen zellulären Stressantworten gehören die cytosolische Environmental Stress Response (ESR), die Unfolded Protein Response (UPR) des sekretorischen Wegs
1. Einleitung
und die oxidative Stressantwort (Ron & Walter 2007; Akerfelt et al. 2010; de la Torre- Ruiz et al. 2010). Die zentrale Bedeutung der zellulären Proteinqualitätskontrollsysteme wird bei Betrachtung der negativen Auswirkungen einer Regulationsstörung oder einer Fehlfunktion der Systeme sichtbar: Krankheiten wie die Creutzfeld-Jakob-Krankheit oder neurodegenerative Krankheiten wie Parkinson, Huntington oder Alzheimer sind die Ergebnisse von nicht abgebauten Proteinaggregationen, die ein Defekt verschiedener Komponenten der Proteinqualitätskontrollsysteme verursacht (Ross &
Poirier 2004; Rubinsztein 2006; Morimoto 2008). Krankheiten wie Mukoviszidose oder Lungenemphyseme werden durch den frühzeitigen Abbau mutierter, aber eigentlich funktionstüchtiger Proteine hervorgerufen (Meacham et al. 2001; Koulov et al. 2010).
1.1 Das Ubiquitin-Proteasom-System
Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) stellt in eukaryotischen Zellen ein evolutionär hoch konserviertes System dar, das die Ubiquitinierung und proteasomale Degradation von intrazellulären Proteinen vermittelt (Hershko & Ciechanover 1998; Pickart 2001;
Kerscher et al. 2006; Finley et al. 2012). Die Ubiquitinierung wird dabei durch die Enzyme der Ubiquitin-Konjugationskaskade (siehe Abschnitt 1.1.2) vollzogen, ihre Degradation obliegt dem 26S Proteasom (siehe Abschnitt 1.1.3).
1.1.1 Ubiquitin und Arten der Ubiquitinierung
Wie andere post-translationale Modifikationen (z.B. Phosphorylierung, Acetylierung oder Glykosylierung) vermag die Ubiquitinierung die Funktion, die Lokalisation und die Aktivität von intrazellulären Proteinen zu regulieren. Im Rahmen der Ubiquitinierung wird das in allen Eukaryonten vorkommende, hoch konservierte Protein Ubiquitin über die Carboxylgruppe seines C-terminalen Glycins kovalent an die ε-Aminogruppe eines Lysinrests des entsprechenden Proteins konjugiert. Das 8.5 kDa große Ubiquitin besteht aus 76 Aminosäuren und besitzt eine charakteristische globuläre Struktur, die durch fünf β-Faltblätter und eine α-Helix sowie einen exponierten flexiblen C-Terminus gekennzeichnet ist (Vijay-Kumar et al. 1987). Die Konjugation eines einzelnen Ubiquitin-Moleküls an ein Protein wird als Mono- Ubiquitinierung bezeichnet und spielt in Prozessen wie z.B. der Endozytose oder der DNA-Reparatur eine bedeutende Rolle (Abb. 1.1 A.) (Hicke 2001). Bei der Multi- Ubiquitinierung eines Proteins werden mehrere einzelne Ubiquitin-Moleküle an verschiedene Lysinreste des Proteins konjugiert (Abb. 1.1 A.). Ihr kommt eine Funktion in der Endozytose und damit in der lysosomalen Degradation von Plasmamembranrezeptoren zu (Haglund et al. 2003). Ubiquitin selbst besitzt sieben interne Lysinreste (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63), an die ein weiteres Ubiquitin- Molekül kovalent über eine Isopeptidbindung gebunden werden kann. Durch die wiederholte Konjugation eines Ubiquitin-Moleküls an ein anderes Ubiquitin-Molekül wird an einem Lysinrest des Proteins eine Poly-Ubiquitinkette gebildet. Dieser Prozess wird als Poly-Ubiquitinierung bezeichnet (Abb. 1.1 A.). Je nachdem, welcher der Lysinreste des Ubiquitins als Anknüpfungspunkt verwendet wird, entstehen Poly-
Ubiquitinketten mit unterschiedlichen Verknüpfungen und Topologien, die als Signal für verschiedene Prozesse fungieren (Abb. 1.1 B.) (Peng et al. 2003; Tagwerker et al.
2006; Meierhofer et al. 2008; Komander 2009; Xu et al. 2009; Ye & Rape 2009;
Komander & Rape 2012).
Abbildung 1.1: Arten der Ubiquitinierung. Ubiquitin (Ub) wird vorwiegend an die ε-Aminogruppe eines Lysinrests im Substrat (S) gebunden, jedoch kann auch die N-terminale Aminogruppe eines Substrates sowie ein Serin-, Cystein- oder Threoninrest als Akzeptor dienen. A. Bei der Mono- oder Multiubiquitinierung eines Substrates wird Ubiquitin an einen oder mehrere Lysinreste des Substrates konjugiert. Die Bildung einer Ubiquitinkette an einem Lysinrest wird als Poly-Ubiquitinierung bezeichnet. B. Ubiquitin besitzt selbst sieben Lysinreste (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63), über die durch Konjugation weiterer Ubiquitin-Moleküle homotypische Ubiquitinketten gebildet werden können.
C. Neben homotypischen Poly-Ubiquitinketten ist auch die Formation von gemischten oder verzweigten Ketten möglich. (Abbildung entnommen aus Komander (2009))
K48-, K11- und K63-verknüpfte Poly-Ubiquitinketten sind die in der Zelle am häufigsten vorkommenden Poly-Ubiquitinketten (in Hefe: K48: 29%; K11: 28%; K63:
17%) (Xu et al. 2009). Ihre Funktion ist bislang am besten untersucht (Peng et al. 2003;
Meierhofer et al. 2008; Komander 2009; Xu et al. 2009; Ye & Rape 2009). Sowohl K48-verknüpfte als auch K11-verknüpfte Poly-Ubiquitinketten markieren Proteine für die proteasomale Degradation (Chau et al. 1989; Chen & Pickart 1990; Hershko &
Ciechanover 1998; Thrower et al. 2000; Petroski & Deshaies 2005b; Jin et al. 2008; Xu et al. 2009). Mit Ausnahme der K63-verknüpften Poly-Ubiquitinketten können jedoch wahrscheinlich auch alle anderen Verknüpfungen (K6, K27, K29 und K33) ein Signal für den proteasomalen Abbau darstellen (Peng et al. 2003; Meierhofer et al. 2008;
1. Einleitung
Komander 2009; Xu et al. 2009; Ye & Rape 2009). K63-verknüpfte Poly- Ubiquitinketten sind dagegen vornehmlich in nicht-proteolytische Prozesse wie z. B. in die DNA-Reparatur oder in die zelluläre Signaltransduktion involviert (Hofmann &
Pickart 1999; Deng et al. 2000; Chen & Sun 2009). Ubiquitin kann nicht nur an die ε- Aminogruppe eines Lysinrests innerhalb eines Proteins kovalent gebunden werden, sondern in wenigen Fällen dienen auch Serin-, Threonin- oder Cysteinreste sowie die N- terminale Aminogruppe eines Proteins (oder eines anderen Ubiquitins) als Akzeptorstellen für das Ubiquitin-Molekül (Abb. 1.1 B.) (Ciechanover & Ben-Saadon 2004; Cadwell & Coscoy 2005; Kirisako et al. 2006; Ravid & Hochstrasser 2007; Wang et al. 2007; Rahighi et al. 2009; Tokunaga et al. 2009; Shimizu et al. 2010). Neben der Bildung von homotypischen Poly-Ubiquitinketten konnte auch die Formation von gemischten oder verzweigten Poly-Ubiquitinketten beobachtet werden (Abb. 1.1 C.) (Peng et al. 2003; Kim et al. 2007; Boname et al. 2010; Emmerich et al. 2013; Lopez- Mosqueda & Dikic 2014; Meyer & Rape 2014).
1.1.2 Die Ubiquitin-Konjugationskaskade
Die Ubiquitinierung von Proteinen ist ein ATP-abhängiger, mehrstufiger enzymatischer Prozess, der durch die Enzyme E1, E2 und E3 der Ubiquitin-Konjugationskaskade katalysiert wird (Abb. 1.2) (Hershko & Ciechanover 1998; Pickart 2001; Kerscher et al.
2006).
Abbildung 1.2: Die Ubiquitin-Konjugationskaskade. Nach seiner ATP-abhängigen Aktivierung durch das E1-Enzym wird Ubiquitin unter Ausbildung einer Thioesterbindung auf ein E2-Enzym übertragen.
Zusammen mit einer E3-Ligase vermittelt das E2 die Ubiquitinkonjugation an einen Lysinrest des Substrates (Target). Im Gegensatz zu HECT Ligasen bilden RING Ligasen vor dem Transfer von Ubiquitin auf das Substrat keine Thioesterbindung mit dem aktivierten Ubiquitin aus, sondern fungieren lediglich als Adapter zwischen E2-Enzym und Substrat. RBR Ligasen stellen funktionell RING/HECT Hybride dar. DUBs katalysieren die De-Ubiquitinierung eines Substrates. (Abbildung entnommen aus Smit & Sixma (2014))
Das Ubiquitin-aktivierende Enzym E1 aktiviert zunächst unter ATP-Verbrauch das Ubiquitin-Molekül: Ubiquitin wird dabei an der Carboxylgruppe seines C-terminalen Glycinrests (G76) adenyliert und unmittelbar unter Freisetzung von AMP und Pyrophosphat über eine energiereiche Thioesterbindung an das katalytisch aktive Cystein des E1s gebunden. Anschließend interagiert das mit Ubiquitin beladene E1 mit einem Ubiquitin-konjugierenden Enzym E2 und überträgt dabei das aktivierte Ubiquitin-Molekül unter Ausbildung einer Thioesterbindung auf den katalytischen Cysteinrest des E2-Enzyms (van Wijk & Timmers 2010). Zuletzt katalysieren Ubiquitinligasen (E3-Enzyme/E3-Ligasen) den Transfer des Ubiquitins vom E2 auf das Substrat; durch die Ausbildung einer Isopeptidbindung zwischen der ε-Aminogruppe eines Lysinrests des Substrates und der aktivierten Carboxylgruppe seines C-terminalen Glycinrests wird Ubiquitin kovalent an das Substrat gebunden (Abb. 1.2). Die E3- Ligasen sind zusammen mit den E2-Enzymen für die spezifische Erkennung und Ubiquitinierung des Substrates verantwortlich. Die enzymatische Ubiquitin- Konjugationskaskade ist daher hierarchisch aufgebaut: Die Bäckerhefe S. cerevisiae exprimiert lediglich ein einziges E1-Enzym, nämlich Uba1, jedoch 11 E2-Enzyme und
~ 60-100 E3-Ligasen (Finley et al. 2012). Die hohe Anzahl von E3-Ligasen gewährleistet die hohe Substratspezifität des UPSs. Eine effiziente Poly-Ubiquitinierung mancher Proteine erfordert die zusätzliche Aktivität von E4-Enzymen, die meist über eine der RING Domäne ähnliche U-Box Domäne verfügen (Koegl et al. 1999; Hoppe 2005; Tu et al. 2007). E4s wie z. B. Ufd2 (Ubiquitin fusion degradation 2) binden an mono- oder oligo-ubiquitinierte Substrate und verlängern deren Ubiquitinkette.
1.1.2.1 Die drei Subklassen der E3-Ligasen
Die Enzymklasse der E3-Ligasen wird in drei Subklassen unterteilt: HECT, RING/U- Box und RBR E3-Ligasen (Abb. 1.2) (Metzger et al. 2012; Smit & Sixma 2014). In S.
cerevisiae sind derzeit 44 RING E3-Ligasen bekannt und zwei U-Box Proteine (Ufd2 und Prp19); das Hefegenom codiert lediglich fünf HECT E3-Ligasen (Rsp5, Ufd4, Hul4, Hul5 und Tom1) und zwei RBR E3-Ligasen (Hel1 und Itt1) (Finley et al. 2012).
HECT und RING E3-Ligasen unterscheiden sich nicht nur maßgeblich in ihren Proteindomänen, sondern sie besitzen auch unterschiedliche Mechanismen, um die Ubiquitinierung eines Substrates zu katalysieren (Abb. 1.2).
1.1.2.1.1 HECT Ligasen
HECT (Homologous to E6AP Carboxyl Terminus) E3-Ligasen sind nach der zuerst entdeckten HECT E3-Ligase E6AP benannt und besitzen C-terminal eine ~ 350 Aminosäuren große, hoch konservierte HECT Domäne (Huibregtse et al. 1995;
Scheffner et al. 1995; Scheffner & Staub 2007; Rotin & Kumar 2009; Scheffner &
Kumar 2014). Der N- und C-terminale Bereich der HECT Domäne (N-Lobe und C- Lobe) sind über einen flexiblen Linker miteinander verbunden (Huang et al. 1999).
Nach Bindung des mit Ubiquitin beladenen E2-Enzyms an den N-Lobe der HECT Domäne wird das aktivierte Ubiquitin-Molekül vor dem Transfer auf das Substrat über eine Thioesterbindung an den katalytisch aktiven Cysteinrest im C-Lobe der HECT
1. Einleitung
Domäne gebunden. Der N-Terminus von HECT E3-Ligasen ist von variabler Länge und Struktur und spielt eine Rolle in der spezifischen Substraterkennung (Huibregtse et al.
1995; Scheffner et al. 1995).
1.1.2.1.2 RING/U-Box Ligasen
Im Gegensatz zu HECT E3-Ligasen binden RING (Really Interesting New Gene) E3- Ligasen das aktivierte Ubiquitin vor seinem Transfer auf das Substrat nicht, sondern fungieren lediglich als Adapter zwischen E2-Enzym und Substrat (Abb. 1.2). Sie erleichtern die Konjugation des Ubiquitins an das Substrat, indem sie das mit Ubiquitin beladene E2-Enzym in die räumliche Nähe des zu modifizierenden Lysinrests des Substrates bringen (Deshaies & Joazeiro 2009). Zusätzlich wird davon ausgegangen, dass die Bindung des E2s durch die RING E3-Ligase eine strukturelle Konformationsänderung im E2 bewirkt, welche den Transfer von Ubiquitin auf das Substrat stimuliert (Zheng et al. 2000; Ozkan et al. 2005; Das et al. 2009). Die Bindung des E2-Enzyms erfolgt bei RING E3-Ligasen über ihre globuläre, hoch konservierte RING Domäne. RING Domänen besitzen das Konsensus-Motiv C-X2-C-X9-39-C-X1-3- C/H-X2-3-C/H-X2-C-X4-48-C-X2-C (X steht für eine beliebige Aminosäure) und werden durch die Koordination zweier Zn2+-Ionen stabilisiert (Freemont et al. 1991; Lovering et al. 1993; Deshaies & Joazeiro 2009). Die Zn2+-Ionen koordinierenden Histidin- und Cysteinreste an Position 4 und 5 des Konsensus-Motivs sind in manchen RING Domänen vertauscht oder gedoppelt. Es gibt daher vier verschiedene Varianten der RING Domäne: RING-H2, RING-HC, RING-CH und RING-C2 (Deshaies & Joazeiro 2009). Die Klasse der RING E3-Ligasen beinhaltet monomere, dimere sowie multimere E3-Ligasen. Bei monomeren RING E3-Ligasen liegen die E2 bindende RING Domäne und die Substratbindedomäne auf demselben Polypeptid. Multimere RING E3-Ligasen wie der APC/C Komplex (Anaphase-promoting complex/cyclosome) und Cullin-RING Ligasen hingegen stellen große Multiproteinkomplexe dar, bei denen die Bindung des E2s und des Substrats durch verschiedene Untereinheiten erfolgt (Petroski & Deshaies 2005a; Peters 2006; Pesin & Orr-Weaver 2008; Zimmerman et al. 2010; Duda et al.
2011). Cullin-RING Ligasen wie z.B. der SCF (Skp1-Cul1-FBox) Komplex bilden die größte Familie der bislang bekannten Ubiquitinligasen und besitzen generell vier Untereinheiten: Culline dienen als Gerüst des Komplexes und interagieren C-terminal mit einem RING Domänen Protein und N-terminal mit einem Adapterprotein, das einen Substratrezeptor an den Komplex rekrutiert (Petroski & Deshaies 2005a; Lee & Diehl 2014). Die Dimerisierung von RING E3-Ligasen erfolgt generell über ihre RING Domänen und hat sowohl die Ausbildung von Homo- als auch Heterodimeren zur Folge. RING E3-Ligasen wie z.B. RNF4, TRAF2 oder TRAF6 formieren Homodimere (Park et al. 1999; Yin et al. 2009; Liew et al. 2010). Bei RNF4 destabilisiert die Dimerisierung die Thioesterbindung des gebundenen E2-Ubiquitinkonjugats und erleichtert dadurch den Ubiquitintransfer vom E2 auf das Substrat (Plechanovova et al.
2011; Plechanovova et al. 2012). Die Heterodimerisierung von RING E3-Ligasen mit RING Domänen Proteinen ohne E3-Ligaseaktivität bewirkt eine Stabilisierung der E2 bindenden RING Domäne, die wiederum zu einer Stimulierung der E3-Ligaseaktivität der aktiven RING E3-Ligasen führt. Beispiele für solche heterodimeren Komplexe sind
Mdm2/MdmX, Brca1/Bard und Ring1B/Bmi1 (Brzovic et al. 2001; Hashizume et al.
2001; Linares et al. 2003; Buchwald et al. 2006; Linke et al. 2008). U-Box (UFD2- homology domain) Proteine vermögen ebenfalls wie RING E3-Ligasen die Ubiquitin- Ligation zu vermitteln. Die U-Box Domäne ist der RING Domäne strukturell ähnlich, jedoch sind die Zn2+-bindenden Cystein- und Histidinreste durch konservierte geladene und polare Aminosäurereste ersetzt. Elektrostatische Wechselwirkungen stabilisieren die U-Box Struktur (Aravind & Koonin 2000; Hatakeyama et al. 2001; Ohi et al. 2003;
Vander Kooi et al. 2006).
1.1.2.1.3 RBR Ligasen
Neben HECT und RING/U-Box E3-Ligasen repräsentieren die RBR (RING-in- between-RING) E3-Ligasen in Eukaryoten eine weitere Klasse von E3-Ligasen (Wenzel
& Klevit 2012; Riley et al. 2013; Smit & Sixma 2014). RBR E3-Ligasen wie Parkin oder HOIP (HOIL-1-interacting protein) übertragen das aktivierte Ubiquitin in einem zweistufigen Mechanismus auf das Substrat, der eine Kombination der HECT und RING Transfermechanismen darstellt (Abb. 1.2) (Marin et al. 2004; Smit et al. 2012;
Stieglitz et al. 2012). Funktionell können RBR Ligasen somit als RING/HECT Hybride angesehen werden. RBR Ligasen enthalten eine RING1 Domäne, eine IBR (in-between- RING) Domäne und eine RING2 Domäne (Eisenhaber et al. 2007; Wenzel et al. 2011;
Wenzel & Klevit 2012). Die RING1 Domäne besitzt die typische Topologie von klassischen RING Domänen und vermag das mit Ubiquitin beladene E2 zu binden; die RING2 Domäne verfügt über ein katalytisch aktives Cystein, das aktiviertes Ubiquitin über eine Thioesterbindung binden kann. Die Interaktion des mit Ubiquitin beladenen E2s mit der RING1 Domäne begünstigt den Transfer von Ubiquitin auf das katalytische Cystein der RING2 Domäne (Riley et al. 2013; Smit & Sixma 2014).
1.1.2.2 De-Ubiquitinierung
Die Ubiquitinierung von Proteinen ist ein reversibler Prozess und kann durch de- ubiquitinierende Enzyme (DUBs; de-ubiquitinating enzymes) rückgängig gemacht werden (Abb. 1.2). DUBs katalysieren dabei die Hydrolyse der Isopeptidbindung, die Ubiquitin kovalent an ein Protein bindet (Komander et al. 2009; Reyes-Turcu et al.
2009). Mit Ausnahme der Metalloprotease Rpn11 stellen DUBs Cysteinproteasen dar und sind in ihrer Funktion sehr verschieden (Verma et al. 2002; Yao & Cohen 2002;
Komander et al. 2009). Die Enzymklasse der DUBs kann in vier Familien eingeteilt werden: die USP (ubiquitin-specific protease) Familie, die OTU (otubain proteases) Familie, MJD (Machado-Joseph-Disease-Protease) Familie und UCH (ubiquitin COOH-terminal hydrolases) Familie. Neben regulatorischen Funktionen zählen zu den wichtigsten Aufgaben von DUBs das Recycling von Ubiquitin-Molekülen vor der proteasomalen Degradation von Substraten (DUBs: Ubp6 und Rpn11) und die Prozessierung von Ubiquitin-Fusionsproteinen, den Genprodukten von UBI1-UBI4 (Ozkaynak et al. 1984; Finley et al. 1987; Ozkaynak et al. 1987; Finley et al. 1989).
Ubiquitin wird als inaktives Proprotein synthetisiert und durch Prozessierung aktiviert.
1. Einleitung
Die Prozessierung durch DUBs legt dabei das C-terminale Gly-Gly Motiv von Ubiquitin frei, das für die Ubiquitinkonjugation essentiell ist.
1.1.3 Das 26S Proteasom
Das 26S Proteasom vollzieht innerhalb des UPSs die Degradation von poly- ubiquitinierten Substraten (Voges et al. 1999; Finley 2009; Finley et al. 2012; Saeki &
Tanaka 2012). Es ist ein in Eukaryoten hoch konservierter Multiproteinkomplex, der aus dem 20S Kernkomplex (CP; core particle) und zwei 19S regulatorischen Partikeln (RP; regulatory particle) besteht (Abb. 1.3). Die 19S regulatorischen Partikel sitzen dem 20S Kernkomplex als Kappen auf und haben die Erkennung, die Entfaltung und die Prozessierung der poly-ubiquitinierten Proteine zur Aufgabe. Die eigentliche Proteolyse der Substrate wird von dem 20S Kernkomplex ausgeführt. Der 20S Kernkomplex stellt eine Threoninprotease dar und ist aus vier aufeinandergestapelten heptameren Ringen aufgebaut, die einen Hohlzylinder bilden (Abb. 1.3). Die beiden äußeren α-Ringe dienen den 19S Partikeln und regulatorischen Proteinen als Andockstelle. Die beiden inneren β-Ringe verfügen jeweils über drei proteolytisch aktive Untereinheiten (β1, β2 und β5), deren aktive Zentren in das Innere des Zylinders zeigen (Groll et al. 2005). Durch ihre Caspase-, Trypsin- und Chymotrypsin-ähnlichen Aktivitäten hydrolysieren die Untereinheiten β1, β2 und β5 bevorzugt Peptidbindungen nach sauren, basischen und hydrophoben Aminosäureresten. Die 19S regulatorischen Partikel sind in einen Basis (base)- und Deckel (lid)-Komplex unterteilt (Abb. 1.3) (Glickman et al. 1998). Die sechs AAA-ATPasen Untereinheiten Rpt1-6 des Basis- Komplexes formen einen Ring (RPT-Ring), der unter ATP Verbrauch die Substrate entfaltet und durch Öffnung des α-Rings ihre Translokation in den 20S Kernkomplex ermöglicht (Liu et al. 2006). Die 13 anderen Untereinheiten des 19S Partikels dienen der Erkennung und Prozessierung der Poly-Ubiquitinketten der Substrate. Eine wichtige Rolle innerhalb der Substraterkennung kommt dabei den Untereinheiten Rpn10 und Rpn13 zu. Sie binden über ihr UIM (Ubiquitin-Interacting Motif) Motiv oder ihre PRU (Pleckstrin-like Receptor for Ubiquitin) Domäne die Poly-Ubiquitinkette des Substrates (Elsasser et al. 2004; Verma et al. 2004; Mayor et al. 2007; Husnjak et al. 2008; Sakata et al. 2012). Oftmals werden Substrate von Ubiquitin-Rezeptorproteinen wie Rad23 (Radiation sensitive 23), Dsk2 (Dominant suppressor of Kar1) oder Ddi1 (DNA damage-inducible protein 1) zum Proteasom geleitet. Diese binden über ihre C- terminale UBA (UBiquitin-Associated) Domäne die substratkonjugierten Poly- Ubiquitinketten und schützen diese mitunter vor einer De-Ubiquitinierung durch DUBs (Wilkinson et al. 2001; Rao & Sastry 2002). Über ihre N-terminale UBL (UBiquitin- Like) Domäne interagieren sie mit Untereinheiten des 19S regulatorischen Partikels wie z.B. Rpn1 oder Rpn2 (Schauber et al. 1998; Hiyama et al. 1999; Chen & Madura 2002;
Elsasser et al. 2002; Funakoshi et al. 2002; Saeki et al. 2002; Elsasser et al. 2004;
Elsasser & Finley 2005; Rosenzweig et al. 2012). Die Untereinheit Rpn11 und das Proteasom-assoziierte Protein Ubp6 sind DUBs und katalysieren die De- Ubiquitinierung der Substrate (Leggett et al. 2002; Verma et al. 2002; Yao & Cohen 2002).
Abbildung 1.3: Die Struktur des 26S Proteasoms in S. cerevisiae. Das 26S Proteasom ist aus zwei Subkomplexen aufgebaut: dem 20S Kernkomplex (20S CP) und dem 19S regulatorischen Partikel (19S RP). Der 19S Partikel wird in einen Basis (base)- und Deckel (lid)-Komplex unterteilt und dient der Erkennung, der Entfaltung, der Prozessierung sowie der Translokation der Substrate in den 20S Kernkomplex. Der 20S Kernkomplex besteht aus 4 heptameren Ringen (α- und β- Ringe), die einen Hohlzylinder formen. In seinem Inneren erfolgt die eigentliche Proteolyse der Substrate. (Abbildung entnommen aus Weissman et al. (2011))
1.2 Qualitätskontrolle im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und ER- assoziierte Degradation (ERAD)
In eukaryotischen Zellen spielt das rauhe Endoplasmatische Retikulum (ER) in der Biosynthese von sekretorischen Proteinen und von Membranproteinen eine zentrale Rolle. Nach ihrer co- oder post-translationalen Translokation erfahren sie im ER ihre Reifung und gelangen dann über den Golgi-Apparat zu ihrem Bestimmungsort (Rapoport 2007; Braakman & Hebert 2013). Ein fein abgestimmtes Netzwerk aus Chaperonen und Enzymen unterstützt und überwacht im ER die Faltung, die Integration in die Membran, die Modifizierung und die Assemblierung der neu synthetisierten Proteine (van Anken & Braakman 2005; Hartl & Hayer-Hartl 2009). Die Proteinqualitätskontrolle des ERs stellt sicher, dass nur Proteine in ihrer nativen, funktionalen Konformation das ER verlassen. Zur Wahrung der Homöostase des ERs sowie zellulärer Prozesse werden anomale, nicht funktionale Proteine durch die ER- Qualitätskontrolle erkannt und notfalls der ER-assoziierten Degradation (ERAD) zur Elimination zugeführt.
Die ER-assoziierte Degradation (ERAD) stellt einen in allen eukaryontischen Zellen hoch konservierten Mechanismus dar (Abb. 1.4) (Vembar & Brodsky 2008;
Christianson & Ye 2014; Lemus & Goder 2014; Ruggiano et al. 2014; Zattas &
Hochstrasser 2015).
1. Einleitung
Abbildung 1.4: Die ER-assozierte Degradation (ERAD). Der Erkennung von löslichen und membranständigen ERAD Substraten durch die ER-Qualitätskontrolle und ERAD Komponenten folgt ihr Transport über die ER-Membran ins Cytosol. Dieser Prozess wird als Retrotranslokation oder Dislokation bezeichnet. Gleichzeitig mit ihrer Retrotranslokation werden ERAD Substrate auf der cytosolischen Seite der ER-Membran durch ER-membranständige E3-Ligasekomplexe ubiquitiniert. Mit Hilfe des Cdc48- Ufd1-Npl4-Komplexes werden die ubiquitinierten Substrate aus der ER-Membran extrahiert und durch die Adapterproteine Rad23 und Dsk2 zum 26S Proteasom geleitet, das die Substrate endgültig abbaut.
(Abbildung entnommen aus Meusser et al. (2005))
Nach ihrer Erkennung durch die ER-Qualitätskontrolle und Komponenten der ERAD werden ERAD Substrate über die ER-Membran in das Cytosol transportiert. Dieser Prozess wird als Retrotranslokation oder Dislokation bezeichnet. Noch während ihrer Retrotranslokation werden die Substrate auf der cytosolischen Seite des ERs durch in der ER-Membran lokalisierte E3-Ligasekomplexe ubiquitiniert. Im Cytosol erkennt der Cdc48-Ufd1-Npl4 Komplex die ubiquitinierten Substrate und extrahiert sie unter ATP- Verbrauch aus der ER-Membran. Zusammen mit den Adapterproteinen Rad23 und Dsk2 geleitet er daraufhin die ubiquitinierten Substrate zum 26S Proteasom, dem Ort der Degradation der Substrate (Abb. 1.4). Die Koordination sämtlicher Einzelschritte der ERAD unterliegt membranständigen Multiproteinkomplexen, deren Herzstück E3- Ligasen darstellen. Nicht nur in der Qualitätskontrolle, sondern auch bei der physiologisch regulierten Degradation von Enzymen und Signalmolekülen erlangt die ERAD zentrale Bedeutung (Hampton 2002).
1.2.1 Die Unfolded Protein Response (UPR) im ER
Umweltbedingte Veränderungen oder Entwicklungsprozesse können zur vermehrten Biosynthese von Proteinen und damit auch zu einem erhöhten Aufkommen an anomalen Proteinen im ER führen. Unter diesen Umständen sind die Aggregation, die Fehlfaltung oder die falsche Assemblierung von Proteinen im ER umso wahrscheinlicher. Kann die Homöostase im ER durch die ER-Qualitätskontrolle und die ERAD nicht mehr garantiert werden, wird zu ihrer Wiederherstellung die Unfolded Protein Response (UPR) induziert (Friedlander et al. 2000; Travers et al. 2000; Walter & Ron 2011;
Korennykh & Walter 2012; Gardner et al. 2013). In S. cerevisiae hat die Akkumulation von anomalen Proteinen im ER die Aktivierung des transmembranen Sensors Ire1 (Inositol requiring protein 1) zur Folge. Dieser löst eine Signalkaskade aus, die eine erhöhte Expression von ER-Chaperonen, von Proteinen der Proteinfaltung und Proteinen der ERAD bewirkt. Die UPR zielt zunächst auf eine Wiederherstellung der Zellhomöostase ab, kann jedoch auch unter widrigen Umständen die Apoptose der Zelle veranlassen.
1.2.2 ERAD E3-Ligasekomplexe in S. cerevisiae
Die Ubiquitinierung der meisten ERAD Substrate wird in S. cerevisiae durch die beiden E3-Ligasekomplexe Hrd1/Der3 und Doa10 vermittelt (Abschnitt 1.2.2.1 und Abschnitt 1.2.2.2 und 1.4) (Bays et al. 2001; Deak & Wolf 2001; Swanson et al. 2001). Beide E3- Ligasekomplexe stellen membranständige Multiproteinkomplexe dar, deren Herzstücke RING E3-Ligasen sind. Für die Erkennung, die Ubiquitinierung, den Transport und die Extraktion ihrer Substrate sowie zur eigenen Regulation benötigen Hrd1 und Doa10 ein Repertoire an Co-Faktoren (Abb. 1.5 und Abb. 1.7). Die E3-Ligasen Hrd1 und Doa10 sowie ihre Co-Faktoren sind evolutionär konserviert. Metazoen besitzen Orthologe dieser E3-Ligasekomplexe (Hassink et al. 2005; Schulze et al. 2005; Mueller et al.
2008; Bernasconi et al. 2010; Christianson et al. 2012) und entwickelten zusätzliche ERAD E3-Ligasekomplexe wie z.B. Rma1/Rnf5, Trc8, Rfp2, Rnf170 oder Rnf185 (Claessen et al. 2012; Mayor 2012; Olzmann et al. 2013). Auch in Hefe wird die Existenz von weiteren, noch nicht identifizierten ERAD E3-Ligasekomplexen vermutet (Theesfeld & Hampton 2013). Zudem scheinen in Metazoen und in S. cerevisiae auch E3-Ligasen eine Rolle in der ERAD zu spielen, die primär an anderen Prozessen beteiligt sind (Haynes et al. 2002; Kohlmann et al. 2008; Stolz et al. 2013).
1.2.2.1 Der Hrd1 Komplex
Die E3-Ligase Hrd1 (HMG-CoA reductase degradation 1) oder auch Der3 (Degradation in the ER 3) wurde in den 1990er Jahren in Screens für Mutanten identifiziert, die die HMG-CoA Reduktase nicht mehr abzubauen vermochten (Hampton et al. 1996) bzw. in denen die mutierten Proteine CPY* und PrA* aufgrund einer fehlerhaften Degradation im ER akkumulierten (Hiller et al. 1996; Knop et al.
1996; Bordallo et al. 1998). Zusammen mit einer Anzahl von luminalen und membranständigen Co-Faktoren vermittelt die E3-Ligase Hrd1 die Ubiquitinierung und damit Degradation von löslichen, ER-luminalen fehlgefalteten Proteinen sowie von
1. Einleitung
integralen Membranproteinen mit Läsionen im Transmembranbereich oder im luminalen Bereich (ERAD-L und ERAD-M Substrate) (Hampton 2002; Vashist & Ng 2004; Carvalho et al. 2006; Nakatsukasa et al. 2008).
Das integrale ER-Protein Hrd1 hat sechs Transmembrandomänen und besitzt in seiner C-terminalen cytosolischen Domäne eine hoch konservierte RING-H2 Domäne. Sowohl der N-Terminus als auch der C-Terminus von Hrd1 sind cytosolisch exponiert (Abb.
1.5) (Gardner et al. 2000; Deak & Wolf 2001). In den meisten Fällen vollführt die E3- Ligase Hrd1 die Ubiquitinierung ihrer Substrate zusammen mit dem cytosolischen E2- Enzym Ubc7, für dessen Rekrutierung an die ER-Membran und Aktivierung das membranständige Cue1 (Coupling of ubiquitin conjugation to ER degradation 1) verantwortlich ist (vgl. Abschnitt 1.4.3.2) (Biederer et al. 1997; Bays et al. 2001;
Bazirgan & Hampton 2008; Kostova et al. 2009). Seltener ist anstatt Ubc7 das lösliche E2-Enzym Ubc1 in die Ubiquitinierung von Hrd1 Substraten involviert (Friedlander et al. 2000; Bays et al. 2001).
Abbildung 1.5: Der Hrd1 ERAD E3-Ligasekomplex in S. cerevisiae. Der Hrd1 E3-Ligasekomplex besteht aus der RING E3-Ligase Hrd1 und ihren Co-Faktoren Ubc7, Cue1, Hrd3, Yos9, Kar2, Usa1, Der1 und Ubx2. Eine detaillierte Beschreibung der Komponenten des Hrd1 Komplexes ist im Haupttext zu finden. (Abbildung entnommen aus Zattas & Hochstrasser (2015))
Für die Funktionalität und Stabilität von Hrd1 ist eine stöchiometrische Komplexbildung mit dem transmembranen Glykoprotein Hrd3 (HMG-CoA reductase degradation 3) notwendig (Abb. 1.5) (Plemper et al. 1999; Gardner et al. 2000). In Abwesenheit von Hrd3 ubiquitiniert sich Hrd1 selbst und veranlasst auf diese Weise seinen eigenen Abbau (Plemper et al. 1999; Gardner et al. 2000). Als primärer Substratrezeptor kommt Hrd3 bei der Erkennung von löslichen Substraten eine besondere Bedeutung innerhalb des Hrd1 Komplexes zu (Gauss et al. 2006a; Gauss et al. 2006b; Stanley et al. 2011; Mehnert et al. 2015). Hrd3 interagiert über seine große
N-terminale luminale Domäne mit dem ER-Lektin Yos9 (Yeast OS-9 homolog), das bevorzugt die modifizierte N-Glykan-Struktur von fehlgefalteten luminalen Glykoproteinen erkennt (Buschhorn et al. 2004; Bhamidipati et al. 2005; Szathmary et al. 2005; Carvalho et al. 2006; Denic et al. 2006; Gauss et al. 2006a; Clerc et al. 2009).
Unabhängig von einem Glykan-Degron scheint Yos9 fehlgefaltete luminale Proteine zu erkennen und deren Retention im ER zu bewirken (Izawa et al. 2012). Der Hrd3/Yos9 Heterodimer bildet zusammen mit dem Hsp70 Chaperon Kar2 und seinem Hsp40 Co- Chaperon Sjc1 einen luminalen Subkomplex, der nach Erkennen des Substrates sein Ablösen vom Rezeptor Hrd3 und damit die Übergabe des Substrates an Komponenten des Komplexes vermittelt, welche die Retrotranslokation des Substrates initiieren (Abb.
1.5) (Denic et al. 2006; Mehnert et al. 2015). Eine korrekte Assemblierung des Hrd1 Komplexes gewährleistet mitunter das membranständige Protein Usa1 (U1-Snp1- associating-1) (Carvalho et al. 2006; Horn et al. 2009; Carroll & Hampton 2010). Usa1 interagiert über seine N-terminale cytosolische Domäne mit der RING Domäne von Hrd1 und vermittelt dessen Oligomerisierung, die insbesonders für die Ubiquitinierung und Degradation von membranständigen Substraten essentiell zu sein scheint (Horn et al. 2009; Carroll & Hampton 2010). Über seine C-terminale cytosolische Domäne bindet Usa1 an das Membranprotein Der1 und rekrutiert dieses zum Abbau von löslichen Substraten zu der E3-Ligase Hrd1 (Abb. 1.5) (Carvalho et al. 2006; Horn et al. 2009; Kim et al. 2009). Neben seiner Bedeutung in der Substratdegradation wird Usa1 eine wesentliche Rolle bei der Regulation der E3-Ligase Hrd1 zugeschrieben:
Usa1 und seine N-terminal lokalisierte UBL Domäne ist für die in Abwesenheit von Hrd3 vollzogene Auto-Ubiquitinierung von Hrd1 unverzichtbar (Carroll & Hampton 2010). Der1 (Degradation in the ER 1) ist ein polytopisches ER-Membranprotein mit vier Transmembrandomänen (Knop et al. 1996; Hitt & Wolf 2004). Seine Anwesenheit im Hrd1 Komplex ist für die Degradation von löslichen Substraten essentiell, für den Abbau von membrangebundenen Substraten ist Der1 aber entbehrlich (Knop et al.
1996; Taxis et al. 2003; Hitt & Wolf 2004; Vashist & Ng 2004; Mehnert et al. 2014).
Seine exakte Funktion innerhalb dieses Prozesses ist bislang nicht geklärt, jedoch wird eine Beteiligung von Der1 bei der Retrotranslokation löslicher ER-luminaler Substrate vermutet (Lilley & Ploegh 2004; Ye et al. 2004; Carvalho et al. 2010; Mehnert et al.
2014). Die Stabilität und damit auch die Bindung von Der1 an den Hrd1 Komplex wird über seine N-terminale Acetylierung reguliert (Zattas et al. 2013; Mehnert et al. 2014).
ER-luminale sowie membranständige Hrd1 Substrate werden von der AAA-ATPase Cdc48 zusammen mit ihren Co-Faktoren Npl4 und Ufd1 vom ER extrahiert und zum Proteasom geleitet (Neuber et al. 2005; Schuberth & Buchberger 2005). Das Transmembranprotein Ubx2 (UBX domain-containing protein 2) rekrutiert dabei den Cdc48-Npl4-Ufd1-Komplex zur ER-Membran und somit zum Hrd1 Komplex (Abb.
1.5) (Neuber et al. 2005; Schuberth & Buchberger 2005; Carvalho et al. 2006).
1.2.2.2 Der Doa10 Komplex
Neben Hrd1 kommt der E3-Ligase Doa10 (Degradation of MATalpha2 10) eine zentrale Bedeutung in der ERAD zu (Swanson et al. 2001). Zusammen mit den beiden E2-Enzymen Ubc6 und Ubc7 sowie dem für Ubc7 essentiellen Co-Faktor Cue1
1. Einleitung
vermittelt Doa10 nicht nur die Ubiquitinierung und Degradation von löslichen anomalen Proteinen des Cytosols und des Nukleus, sondern auch den Abbau von Membranproteinen mit Läsionen bzw. Degrons im cytosolischen Bereich (ERAD-C Substrate) (Swanson et al. 2001; Huyer et al. 2004; Carvalho et al. 2006; Ravid et al.
2006). Die E3-Ligase Doa10 wird in Abschnitt 1.4 im Detail beschrieben.
1.2.3 Substraterkennung und ERAD Degradationswege
Die Erkennung von ERAD Substraten erfolgt durch ER-membranständige E3- Ligasekomplexe. Dabei interagieren die E3-Ligasen selbst und/oder die mit ihnen in einem Komplex assoziierten Co-Faktoren und Chaperone mit dem jeweiligen Substrat.
Chaperone erhöhen dabei die Löslichkeit der fehlgefalteten Proteine und/oder vermitteln die Interaktion des Substrates mit der entsprechenden E3-Ligase. Mitunter ist für die ERAD eine vorherige Entfaltung der Proteine mit Hilfe von Isomerasen und Oxidoreduktasen wie z.B. Pdi1 erforderlich (Ushioda et al. 2008; Clerc et al. 2009).
Basierend auf genetischen und biochemischen Studien zur Untersuchung der Degradation von ERAD Modellsubstraten wurden in S. cerevisiae verschiedene ERAD Degradationswege definiert (Huyer et al. 2004; Vashist & Ng 2004; Carvalho et al.
2006). Abhängig von der Lage ihrer Schädigung oder ihres Degrons werden ERAD Substrate von unterschiedlichen ERAD E3-Ligasekomplexen erkannt und abgebaut.
Proteine mit Läsionen oder Degrons in ihrer ER-luminalen (ERAD-L Substrate) oder intramembranen Domäne (ERAD-M Substrate) werden durch den Hrd1 E3- Ligasekomplex abgebaut; die Degradation von Proteinen, die eine Schädigung oder ein Degron in ihrer cytoplasmatischen Domäne aufweisen (ERAD-C Substrate), wird durch den Doa10 E3-Ligasekomplex vermittelt. Wichtig ist anzumerken, dass diese Einteilung auf einer einstigen Untersuchung einer limitierten Anzahl von ERAD Substraten in S.
cerevisiae beruht und keineswegs als allgemeingültig und endgültig anzusehen ist.
Durch die Identifizierung und Charakterisierung neuer ERAD Substrate und neuer ERAD E3-Ligasekomplexe verliert diese Klassifizierung mehr und mehr ihre Gültigkeit in Säugern, aber auch in S. cerevisiae (Yamasaki et al. 2007; Rubenstein et al. 2012;
Tsai et al. 2012; Faulkner et al. 2013; Foresti et al. 2013; Habeck et al. 2015).
Die Erkennung von Substraten durch ERAD E3-Ligasekomplexe ist ein fein regulierter und äußerst komplexer Prozess, der bis heute noch sehr wenig geklärt ist. Die Substrate der ERAD sind in ihrer Topologie, Struktur und Funktion sehr divers und weisen daher kein universales Degradationssignal auf. Vielmehr steht die Identifikation der Degrons vieler ERAD Substrate noch aus (Nakatsukasa & Brodsky 2008; Ravid & Hochstrasser 2008; Varshavsky 2012). Die Charakterisierung von bereits identifizierten ERAD Degrons zeigt, dass bei den meisten ERAD Substraten exponierte Regionen als Degrons dienen, die normalerweise bei korrekter Faltung oder während der Interaktion mit Bindungspartnern verborgen sind (Ravid & Hochstrasser 2008). Im Fall von löslichen Substraten enthalten diese Regionen eine hohe Anzahl von hydrophoben Aminosäureresten. Bei membranständigen Substraten liegen die als Degron dienenden Bereiche in transmembranen Regionen mit einer hohen Anzahl von hydrophilen
