Die co-exprimierten KlDoa10 Fragmente rekonstituieren in S. cerevisiae

Bereits vorangegangene Studien in S. cerevisiae offenbarten, dass die beiden Fragmente des Split-KlDoa10 zusammen in S. cerevisiae eine funktionelle Doa10 E3-Ligase rekonstituieren können (Stürner, Diplomarbeit Universität Konstanz, 2009). In Wachstumstests in S. cerevisiae wurde dabei eine mögliche E3-Ligaseaktivität des Split-KlDoa10 gegenüber den ScDoa10 Modellsubstraten Deg1-Vma12-KanMX und Deg1-Ura3 untersucht. Beide Modellsubstrate stellen Fusionsproteine mit dem ScDoa10 spezifischen Degron Deg1 dar. Das membranständige Modellsubstrat Deg1-Vma12-KanMX besteht neben dem Deg1 Degron aus dem ER-Membranprotein Vma12 und der Aminoglykosid-Phosphotransferase des Transposons Tn903 (KanMX), die eine Resistenz gegen Geniticin (G418) vermittelt (Kreft & Hochstrasser 2011). Das integrale Membranprotein Vma12 besitzt zwei TMs sowie cytosolisch exponierte N- und C-Termini und ist für die korrekte Assemblierung der vakuolären H⁺-ATPase mitverantwortlich (Jackson & Stevens 1997). Die C-terminal an Deg1-Vma12 fusionierte Aminoglykosid-Phosphotransferase erlaubt eine spätere Selektion gegen das Antibiotikum Geniticin (G418). Im löslichen Modellsubstrat Deg1-Ura3 ist das Degron Deg1 N-terminal an das Enzym Ura3 fusioniert (Swanson et al. 2001). Das URA3 Gen codiert für die Orotidin-5´-Monophosphat Decarboxylase, ein essentielles Enzym der Uracil Biosynthese. Durch Analyse des Wachstumsverhaltens der die Reporter exprimierenden Zellen können Rückschlüsse auf die Doa10 E3-Ligaseaktivität gezogen werden. Ein funktioneller Doa10 Komplex vermag beide Reporter sehr schnell und effizient abzubauen. Die Doa10 vermittelte Degradation des Reporters hat im Falle von Deg1-Vma12-KanMX einen Verlust der G418-Resistenz zur Folge und die Zellen können nicht mehr auf G418-haltigem Medium wachsen. Die Doa10 vermittelte Degradation des Reporters Deg1-Ura3 verhindert ein Wachstum der Zellen auf Medium ohne Uracil, wenn der Reporter Deg1-Ura3 die einzige Quelle für das Enzym darstellt.

Zur Verifikation der in S. cerevisiae beobachteten E3-Ligaseaktivität des Split-KlDoa10 wurden die Wachstumstests mit den beiden ScDoa10 Modellsubstraten Deg1-Vma12-KanMX und Deg1-Ura3 in S. cerevisiae wiederholt (Abb. 3.1.7 A. und B.); jedoch wurden diesmal Epitop getaggte Versionen der beiden Split-KlDoa10 Fragmente verwendet, um die Expressionlevels der beiden Fragmente detektieren zu können (Abb.

3.1.7 C. und D.). S. cerevisiae doa10Δ Zellen, die entweder Deg1-Vma12-KanMX oder Deg1-Ura3 im Genom integriert hatten, wurden mit CEN Plasmiden transformiert, die ein N-terminal FLAG getaggtes Nt (FLAG-Nt) bzw. ein 13MYC getaggtes Ct (Ct-13MYC) unter der Kontrolle eines ScGPD Promotors exprimierten (Abb. 3.1.7 C. und D.). Serielle Verdünnungen dieser Transformanten wurden tropfenweise auf entsprechende Selektionsplatten aufgebracht.

Im Falle des Reporters Deg1-Vma12-KanMX wuchsen S. cerevisiae doa10Δ Zellen, die FLAG-Nt und Ct-13MYC (Nt+Ct) co-exprimierten (Abb. 3.1.7 C.), deutlich langsamer auf einer G418-haltigen Platte als S. cerevisiae doa10Δ Zellen, die keines (Kontrolle) oder nur eines der beiden Fragmente (Nt oder Ct) exprimierten (Abb. 3.1.7 A. und C.).

Bei Co-Expression in S. cerevisiae besaßen die beiden Fragmente des Split-KlDoa10 eine dem ScDoa10 (ScDoa10) annähernd vergleichbare E3-Ligaseaktivität gegenüber dem membranständigen Modellsubstrat Deg1-Vma12-KanMX (Abb. 3.1.7 A. vgl.

Nt+Ct und ScDoa10; C.). Die Co-Expression der beiden getaggten Split-KlDoa10 Fragmente (Nt+Ct) in S. cerevisiae doa10Δ Zellen mit dem Reporter Deg1-Ura3 führte zur Inhibierung des Wachstums auf Minimalmedium ohne Uracil (Abb. 3.1.7 B. und D.). Ein vergleichbarer inhibitorischer Effekt konnte bei S. cerevisiae doa10Δ Zellen beobachtet werden, die ScDoa10 (ScDoa10) ektopisch exprimierten (Abb. 3.1.7 B., vgl.

Nt+Ct und ScDoa10). Keine Inhibierung des Zellwachstums konnte bei S. cerevisiae doa10Δ Zellen verzeichnet werden, die keines (Kontrolle) oder nur eines der beiden getaggten Fragmente (Nt und Ct) exprimierten (Abb. 3.1.7 B. und D.). Die korrekte Expression der getaggten Split-KlDoa10 Fragmente FLAG-Nt und Ct-13MYC sowie des ScDoa10 in den verwendeten Transformanten konnte durch Analyse der Zelllysate mittels Immunblots nachgewiesen werden (Abb. 3.1.7 C. und D.).

Zusammengefasst bestätigte die Wiederholung der Wachstumstests in S. cerevisiae die bereits erlangten Ergebnisse vollständig: In Co-Expression zeigten die beiden Split-KlDoa10 Fragmente in S. cerevisiae eine dem ScDoa10 vergleichbare E3-Ligaseaktivität sowohl gegenüber dem membranständigen Modellsubstrat Deg1-Vma12-KanMX als auch gegenüber dem löslichen Modellsubstrat Deg1-Ura3. Weder das Nt- noch das Ct-Fragment allein besaßen eine im Wachstumstest detektierbare Doa10 E3-Ligaseaktivität gegenüber den beiden ScDoa10 Modellsubstraten. Für die Bildung einer funktionellen Doa10 E3-Ligase sind folglich beide Fragmente des Split-KlDoa10 notwendig. Das Nt-Fragment und das Ct-Fragment des Split-Split-KlDoa10 rekonstituieren in S. cerevisiae durch Interaktion eine funktionelle Doa10 E3-Ligase.

3. Ergebnisse

Abbildung 3.1.7: Die co-exprimierten KlDoa10 Fragmente rekonstituieren in S. cerevisiae eine funktionelle Doa10 E3-Ligase. A. Wachstumstest mit dem membranständigen ScDoa10 Modellsubstrat Deg1-Vma12-KanMX in S. cerevisiae. Der Reporter Deg1-Vma12-KanMX ist in das Genom von S.

cervisiae doa10Δ Zellen integriert. CEN S. cerevisiae Plasmide, die FLAG-Nt-ORF oder Ct-ORF-13MYC unter der Kontrolle eines ScGPD Promotors codieren, wurden entweder einzeln oder zusammen in diese Zellen transformiert. Serielle Verdünnungen dieser Transformanten wurden tropfenweise auf SD-his-trp Minimalmedium ohne oder mit G418 aufgebracht. S. cerevisiae doa10Δ Stämme mit chromosomal integriertem Deg1-Vma12-KanMX Reporter, die mit einem ScDoa10-ORF codierenden Plasmid oder einem Leervektor transformiert wurden, dienten als Kontrolle. Oberer und unterer Ausschnitt stammen von derselben Platte. B. Wachstumstest mit dem löslichen ScDoa10 Modellsubstrat Deg1-Ura3. Der Reporter Deg1-URA3 ist in das Genom von S. cervisiae doa10Δ Zellen integriert. CEN

S. cerevisiae Plasmide, die FLAG-Nt-ORF oder Ct-ORF-13MYC unter der Kontrolle eines ScGPD Promotors codieren, wurden entweder einzeln oder zusammen in diese Zellen transformiert. Serielle Verdünnungen dieser Transformanten wurden tropfenweise auf SD-his-trp Minimalmedium ohne oder mit Uracil (ura) aufgebracht. S. cerevisiae doa10Δ Stämme mit chromosomal integriertem Deg1-URA3 Reporter, die mit einem ScDoa10-ORF codierenden Plasmid oder einem Leervektor transformiert wurden, dienten als Kontrolle. Oberer und unterer Ausschnitt stammen von derselben Platte. C.

Expressionslevels von FLAG-Nt und Ct-13MYC in den im Wachstumstest in A. verwendeten Transformanten. D. Expressionslevels von FLAG-Nt und Ct-13MYC in den im Wachstumstest in B.

verwendeten Transformanten. C. und D.: Nach Herstellung von Zelllysaten dieser Transformanten wurde die Expression von FLAG-Nt, Ct-13MYC oder ScDoa10 mittels eines Immunblots mit α-FLAG, α-MYC oder α-Doa10 Antikörper analysiert. Der Stern (*) markiert eine unspezifische Bande. (Abbildung modifiziert aus Stuerner et al. (2012))

3.1.5.2 Endogenes Split-KlDoa10 zeigt in K. lactis Doa10 E3-Ligaseaktivität

Nach der funktionellen Charakterisierung des Split-KlDoa10 in S. cerevisiae stellte sich nun unausweichlich die Frage, ob auch endogenes Split-KlDoa10 in K. lactis -in vivo- eine Doa10 E3-Ligaseaktivität besitzt und ob auch in K. lactis beide Fragmente zur Formation einer funktionellen Doa10 E3-Ligase notwendig sind. Die Etablierung eines Expressionssystems in K. lactis sowie die Generierung von K. lactis doa10Δ Stämmen ermöglichten eine funktionelle Charakterisierung des Split-KlDoa10 in K. lactis (Schaffrath & Breunig 2000; Heinisch et al. 2010; Rodicio & Heinisch 2013).

Um zu untersuchen, ob endogenes Split-KlDoa10 eine Doa10 E3-Ligaseaktivität besitzt, wurde zunächst ein Wachstumstest mit dem membranständigen ScDoa10 Modellsubstrat Deg1-Vma12-KanMX in K. lactis WT und doa10Δ Zellen durchgeführt (Abb. 3.1.8 A.). K. lactis WT Zellen, die mit einem Deg1-Vma12-KanMX Expressionsplasmid transformiert wurden (WT+), wuchsen in Anwesenheit von G418 langsamer und bildeten deutlich kleinere Kolonien als K. lactis doa10Δ Zellen, die ebenfalls mit einem Deg1-Vma12-KanMX Expressionsplasmid transformiert wurden (doa10Δ+) (Abb. 3.1.8 A., vgl. WT+ und doa10Δ+). In K. lactis WT Zellen war folglich endogenes Split-KlDoa10 gegenüber dem membranständigen ScDoa10 Modellsubstrat Deg1-Vma12-KanMX aktiv geworden und verursachte durch Abbau des Reporters den Verlust der G418-Resistenz dieser Zellen und damit die Inhibierung ihres Wachstums auf G418-haltigem Medium. Dieser in K. lactis durchgeführte Wachstumstest mit dem ScDoa10 Modellsubstrat Deg1-Vma12-KanMX deutete darauf hin, dass auch endogenes Split-KlDoa10 eine Doa10 E3-Ligaseaktivität besitzt.

Reporter-basierte Wachstumstests zeigen allerdings gleich wie Degradationsassays lediglich indirekt eine vorhandene E3-Ligaseaktivität gegenüber Substraten auf; das durch eine funktionelle E3-Ligase veränderte Proteinlevel des Reporters bewirkt unmittelbar eine Änderung des Wachstumsverhalten, die in Wachtumstests detektiert wird. Wachstumstests sind daher in keinster Weise quantitativ und lassen keine Aussage über eine E3-Ligaseaktivität per se zu.

3. Ergebnisse

Abbildung 3.1.8: Endogenes Split-KlDoa10 zeigt in K. lactis gegenüber dem membranständigen ScDoa10 Modellsubstrat Deg1-Vma12 und dem löslichen ScDoa10 Modellsubstrat Ura3-HA-CL1 Doa10 E3-Ligaseaktivität. A. Wachstumstest mit Deg1-Vma12-KanMX in K. lactis WT und doa10Δ Zellen. K. lactis WT und doa10Δ Zellen wurden entweder mit einem Leervektor (-) oder einem CEN K.

lactis Expressionsvektor (+) transformiert, das den Reporter Deg1-Vma12-KanMX unter der Kontrolle des ScMET25 Promotors codiert. Serielle Verdünnungen dieser Transformanten wurden tropfenweise auf SD-leu Minimalmedium ohne oder mit G418 aufgebracht. B. Degradationsassay von Deg1-Vma12-ProtA in K. lactis WT und doa10Δ Zellen. Deg1-Vma12-ProtA wurde unter der Kontrolle des ScMET25 Promotors von einem CEN K. lactis Expressionsplasmid in K. lactis WT und doa10Δ Zellen exprimiert.

Nach Zugabe des Translationsinhibitors Anisomycin wurden zu den angegebenen Zeitpunkten Aliquote entnommen und der Zelllyse unterzogen. Nach SDS-PAGE und Western Blot erfolgte die Immundetektion von Deg1-Vma12-ProtA mittels α-ProtA Antikörper. Eine unspezifische Bande (bkg) diente als Ladekontrolle. Ein Lysat von WT Zellen (Kontrolle) fungierte als Negativkontrolle. Der Stern (*) markiert prozessiertes Deg1-Vma12-ProtA. C. Degradationsassay von Ura3-HA-CL1 in K. lactis WT und doa10Δ Zellen. Ura3-HA-CL1 wurde unter der Kontrolle des ScGPD Promotors von einem CEN K.

lactis Expressionsplasmid in K. lactis WT und doa10Δ Zellen exprimiert. Nach Zugabe von Anisomycin wurden zu den angegebenen Zeitpunkten Aliquote entnommen und der Zelllyse unterzogen. Nach SDS-PAGE und Western Blot erfolgte die Immundetektion von Ura3-HA-CL1 mittels α-HA Antikörper. Eine unspezifische Bande (bkg) diente als Ladekontrolle. Ein Lysat von WT Zellen (Kontrolle) fungierte als Negativkontrolle. (A.: Abbildung modifiziert aus Stuerner et al. (2012); B.+C.: unter Betreuung erstellte Abbildungen von Lea Güntner)

Um die mögliche Doa10 E3-Ligaseaktivität des endogenen Split-KlDo10 quantitativ bestimmen zu können, wurde die Stabilität von ScDoa10 Modellsubstraten in K. lactis in biochemischen Degradationsassays analysiert (Abb. 3.1.8 B. und C.). Neben Deg1-Vma12-ProtA stellte das Modellsubstrat ScUra3-HA-CL1 ein weiteres getestetes Substrat des Split-KlDoa10 dar. Ura3-HA-CL1 ist ein lösliches cytosolisches Fusionsprotein und wird in S. cerevisiae über sein artifizielles CL1 Degron spezifisch von der ScDoa10 E3-Ligase erkannt und abgebaut. Das membranständige Modellsubstrat Deg1-Vma12-ProtA entspricht größtenteils dem bereits erläuterten Reporterkonstrukt Deg1-Vma12-KanMX; die C-terminale fusionierte Aminoglykosid-Phosphotransferase (KanMX) wurde lediglich durch einen ProtA Tag ersetzt, der eine Detektion des Reporters mittels Immunblots erlaubte. Zur Durchführung von Degradationsassays in K. lactis wurde anstatt Cycloheximid der Translationsinhibitor Anisomycin verwendet, da K. lactis Ribosomen resistent gegenüber Cycloheximid sind (Dehoux et al. 1993).

Sowohl Deg1-Vma12-ProtA als auch Ura3-HA-CL1 wurden in K. lactis WT Zellen sehr schnell und effizient abgebaut (Abb. 3.1.8 B. und C., WT). In K. lactis doa10Δ Zellen hingegen konnte eine Stabilisierung der Reporter vermerkt werden (Abb. 3.1.8 B. und C., doa10Δ). Die Stabilität beider Reporterwar in doa10Δ Zellen bereits zum t₀ -Zeitpunkt der Degradationsassays dramatisch höher als in WT Zellen (Abb. 3.1.8 B.

und C., vgl. 0 min WT und doa10Δ). Aufgrund des schnellen Abbaus der Reporter und ihres bereits zu Beginn des Degradationsassays geringen Expressionslevels in K. lactis WT Zellen stellte sich die Quantifizierung der Degradationen als sehr schwierig heraus.

Festzuhalten war jedoch, dass die Halbwertszeiten der beiden Reporter unter fünf Minuten zu liegen scheinen. Die in K. lactis durchgeführten Degradationsassays zeigten damit, dass endogenes Split-KlDoa10 gegenüber dem membranständigen Modellsubstrat Deg1-Vma12-ProtA und dem löslichen Modellsubstrat Ura3-HA-CL1 eine spezifische Doa10 E3-Ligaseaktivität aufweist und deren Degradation in K. lactis innerhalb weniger Minuten vermittelt.

3.1.5.3 Weder das Nt- noch das Ct- Fragment verfügt für sich allein über eine Doa10 E3-Ligaseaktivität

Zuletzt galt es zu klären, ob auch in K. lactis beide Fragmente des Split-KlDoa10 für eine funktionelle Doa10 E3-Ligase essentiell sind. Abermals wurden hierzu Degradationsassays mit den Modellsubstraten Deg1-Vma12-ProtA und Ura3-HA-CL1 in K. lactis durchgeführt, jedoch diesmal in Co-Expression mit 13 MYC getaggten Versionen des Split-KlDoa10 KlDoa10-13MYC), des Nt-Fragments (13MYC-Nt) oder des Ct-Fragments (Ct-13MYC). 13MYC-KlDoa10-13MYC, 13MYC-Nt oder Ct-13MYC wurden dabei unter der Kontrolle ihrer endogenen Promotoren von einem CEN K. lactis Expressionsplasmid in K. lactis doa10Δ Zellen mit Deg1-Vma12-ProtA oder Ura3-HA-CL1 co-exprimiert (Abb. 3.1.9 A. und B.).

3. Ergebnisse

Abbildung 3.1.9: Das Nt- und Ct- Fragment des Split-KlDoa10 verfügen einzeln über keine Doa10 E3-Ligaseaktivität gegenüber den Modellsubstraten Deg1-Vma12-ProtA und Ura3-HA-CL1. A.

Degradationsassay von Deg1-Vma12-ProtA in Co-Expression mit KlDoa10-13MYC, 13MYC-Nt oder Ct-13MYC in K. lactis doa10Δ Zellen. B. Degradationsassay von Ura3-HA-CL1 in Co-Expression mit 13MYC-KlDoa10-13MYC, 13MYC-Nt oder Ct-13MYC in K. lactis doa10Δ Zellen. A.

und B.: 13MYC-KlDoa10-13MYC, 13MYC-Nt oder Ct-13MYC wurden unter der Kontrolle ihrer endogenen Promotoren von einem CEN K. lactis Expressionsplasmid in K. lactis doa10Δ Zellen mit Deg1-Vma12-ProtA (A.) oder mit Ura3-HA-CL1 (B.) co-exprimiert. Deg1-Vma12-ProtA wurde unter der Kontrolle des ScMET25 Promotors von einem CEN K. lactis Expressionsplasmid exprimiert (A.).

Ura3-HA-CL1 wurde unter der Kontrolle des ScGPD Promotors von einem CEN K. lactis Expressionsplasmid exprimiert (B.). Nach Zugabe von Anisomycin wurden zu den angegebenen Zeitpunkten Aliquote entnommen und der Zelllyse unterzogen. Nach SDS-PAGE und Western Blot erfolgte die Immundetektion von Deg1-Vma12-ProtA mittels α-ProtA Antikörper, von Ura3-HA-CL1 mittels α-HA Antikörper und der 13 MYC getaggten Split-KlDoa10 Fragmente mittels α-MYC Antikörper. Eine unspezifische Bande (bkg) diente als Ladekontrolle. Ein Lysat von doa10Δ Zellen (Kontrolle) fungierte als Negativkontrolle. Der Stern (*) markiert eine unspezifische Bande. (A.+B.: unter Betreuung erstellte Abbildungen von Lea Güntner)

Das in doa10Δ Zellen ektopisch exprimierte 13MYC-KlDoa10-13MYC vermittelte wie endogenes Split-KlDoa10 den Abbau beider Modellsubstrate in K. lactis (Abb. 3.1.9 A.

und B., 13MYC-KlDoa10-13MYC). Eine starke und komplette Stabilisierung der Reporter war jedoch nicht nur in K. lactis doa10Δ Zellen zu beobachten, die zur Kontrolle mit einem Leervektor transformiert worden waren, sondern auch in K. lactis doa10Δ Zellen, die entweder nur das Nt-Fragment 13MYC-Nt oder das Ct-Fragment

13MYC des Split-KlDoa10 exprimierten (Abb. 3.1.9 A. und B., 13MYC-Nt und Ct-13MYC). Sowohl 13MYC-KlDoa10-13MYC als auch die einzelnen Fragmente 13MYC-Nt und Ct-13MYC waren über den gesamten untersuchten Zeitraum stabil exprimiert (Abb. 3.1.9 A. und B., α-MYC Immunblot). Die Resultate dieser Degradationsassays ließen damit den Schluss zu, dass auch in K. lactis weder das Nt-Fragment noch das Ct-Nt-Fragment über eine Doa10 E3-Ligaseaktivität gegenüber den Modellsubstraten Deg1-Vma12-ProtA oder Ura3-HA-CL1 verfügt. Zur Formation einer funtionellen Doa10 E3-Ligase und damit zur Degradation von löslichen und membranständigen ScDoa10 Substrate sind beide Fragmente des Split-KlDoa10 essentiell.

Das Split-Doa10 der Milchhefe K. lactis stellt somit wie ScDoa10 eine Ubiquitinligase dar, welche die Degradation von löslichen und membranständigen Modellsubstraten der zellulären Proteinqualitätskontrolle vermittelt. Für die Doa10 E3-Ligasefunktion benötigt das Split-KlDoa10 sowohl sein Nt- als auch sein Ct-Fragment.

3.1.6 Alle Spezies des Genus Kluyveromyces enthalten eine IVS in ihrem DOA10 Locus

Die Analyse orthologer DOA10 Sequenzen in Pilzen und in einer Vielzahl anderer eukaryotischer Organismen zeigte, dass Doa10 in der Regel als ein einzelnes großes Polypeptid exprimiert wird (Abb. 3.1.10 A., Links (contin.)) (Daten und Abbildung:

Stefan Kreft; Kreft & Hochstrasser 2011). Dies gab Anlass zur Vermutung, dass der DOA10 Locus des letzten gemeinsamen Vorfahren der Eukaryoten Doa10 auch in Form eines einzelnen Polypeptid exprimierte (LECA; Last Eukaryotic Common Ancestor) (Kreft & Hochstrasser 2011). Die Teilung des einst durchgehenden DOA10 ORFs in K.

lactis ist daher aller Wahrscheinlichkeit nach evolutionär relativ jung und fand im Genom eines K. lactis Vorfahren statt (Abb. 3.1.10 A., schwarzes Kreuz) (Daten und Abbildung: Stefan Kreft; Stuerner et al. 2012). Um die Teilung des einst durchgehenden DOA10 ORFs phylogenetisch besser einordnen zu können, wurden die DOA10 Loci aller anderen Spezies des Genus Kluyveromyces auf die Anwesenheit einer IVS hin analysiert (Daten: Stefan Kreft; Stuerner et al. 2012).

Das Genus Kluyveromyces besteht derzeit aus sechs Spezies: K. lactis, K. marxianus, K.

aestuarii, K. wickerhamii, K. dobzhanskii und K. nonfermentas (Abb. 3.1.10 A., Rechts) (Kurtzman 2003; Lachance 2007). Zu Beginn dieser Dissertation war lediglich das Genom der Spezies K. lactis vollständig sequenziert (Dujon et al. 2004). Während dieser Arbeit wurden dann die kompletten Genomsequenzen der Spezies K. aestuarii und K. wickerhamii bekannt und zur Vefügung gestellt (Baker et al. 2011). Durch Amplifizierung und Sequenzierung der DOA10 Loci konnten auch die komplette Sequenz des DOA10 Locus in K. marxianus bzw. Teilsequenzen des DOA10 Locus in K. dobzhanskii aufgedeckt werden (Daten: Stefan Kreft; Stuerner et al. 2012). Für K.

nonfermentas war bis dato keine Sequenz des DOA10 Locus verfügbar.

3. Ergebnisse

Abbildung 3.1.10: Alle Spezies des Genus Kluyveromyces enthalten eine IVS in ihrem DOA10 Locus.

A. Links: Phylogenetischer Stammbaum des Subphylums Saccharomycotina. Die An- und Abwesenheit einer IVS im DOA10 Locus ist für alle Genera des Subphylums Saccharomycotina seitlich vermerkt (contin. oder split). Rechts: Phylogenetischer Stammbaum des Genus Kluyveromyces. Derzeit beinhaltet das Genus Kluyveromyces sechs Spezies. Die experimentell ermittelte Anwesenheit einer IVS im DOA10 Locus ist für jede Spezies seitlich vermerkt (split). Die Teilung des einst durchgehenden DOA10 ORF ließ sich im phylogenetischen Stammbaum auf das Genus Kluyveromyces zurückverfolgen (schwarzes Kreuz). B. Schematische Darstellung der DOA10 Loci in S. cerevisiae und in den Spezies des Genus Kluyveromyces. Nummern oberhalb der IVS geben das erste und letzte Nukleotid der jeweiligen IVS an.

(Abbildung: Stefan Kreft, modifiziert aus Stuerner et al. (2012))

Alle untersuchten Spezies des Genus Kluyveromyces enthielten in ihrem genomischen DOA10 Locus eine IVS (Abb. 3.1.10 B.). Die IVSs der jeweiligen DOA10 Loci variierten beträchtlich in ihrer Länge. Die Spezies K. marxianus, K. aestuarii und K.

wickerhamii verfügten über eine deutlich kürzere IVS als K. lactis (Abb. 3.1.10 B.). Die IVS des DOA10 Locus in K. dobzhanskii entsprach in ihrer Größe der KlIVS (Abb.

3.1.10 B.). Die IVSs der Kluyveromyces DOA10 Loci unterschieden sich nicht nur in ihrer Länge, sondern auch maßgeblich in ihrer Sequenz (Daten: Stefan Kreft; Stuerner et al. 2012). Aufgrund der Divergenz in ihrer Sequenz konnte zunächst keine definitive

Aussage über die Funktion der IVSs getroffen werden. Wie die K. lactis IVS zeigten auch die IVSs der anderen untersuchten Kluyveromyces Spezies keine klar ersichtlichen Homologien zu Sequenzen der GenBank Datenbank (Daten: Stefan Kreft; Stuerner et al. 2012). In Anbetracht der verifizierten Promotorfunktion der KlIVS lag jedoch nahe, dass auch die IVSs der anderen Kluyveromyces Spezies über eine Promotoraktivität verfügen könnten. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde die 303 bp große IVS der Spezies K. marxianus auf eine Promotoraktivität hin untersucht (Abb. 3.1.11).

Mittels eines Northern Blots wurden zunächst die endogenen Transkripte des K.

marxianus DOA10 Locus mit KmNt- und KmCt-ORF spezifischen Sonden analysiert (Abb. 3.1.11 A. und B.). Die Gesamt-RNA aus K. lactis und K. marxianus WT Zellen wurde isoliert, über ein denaturierendes Gel aufgetrennt und auf eine postiv geladene Nylonmembran transferiert. Die Hybridisierung der Membran erfolgte mit ³² P-endmarkierten Oligonukleotidsonden, die sequenzspezifisch an die mRNA des KmNt-ORFs und des KmCt-ORFs banden (Nt- und Ct- Sonde). Mittels Auto-Radiographie konnten die gebundenen radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden detektiert werden.

Mit einer KmNt-ORF spezifischen und einer KmCt-ORF spezifischen Sonde konnte in der Gesamt-RNA der K. marxianus Zellen ein ~ 1400 Nukleotide großes und ein ~ 3100 Nukleotide großes Transkript detektiert werden (Abb. 3.1.11 A. und B., Blot Spur 3 Pfeil). In ihrer Größe entsprachen die beiden Transkripte einer mRNA des KmNt-ORFs und einer mRNA des KmCt-ORFs, die ihren Transkriptionsstartpunkt in der IVS hat.

Die Abwesenheit dieser detektierten Transkripte in der Gesamt-RNA von K. lactis Zellen legte nahe, dass die detektierten Transkripte KmDOA10 spezifisch waren (Abb.

3.1.11 A. und B., Blot Spur 2). Wie der DOA10 Locus in K. lactis exprimiert auch der DOA10 Locus in K. marxianus zwei unterschiedlich große Transkripte. Die Expression des KmCt-ORFs wird dabei sehr wahrscheinlich wie in K. lactis durch einen in der IVS enthaltenen Promotor vermittelt.

Um unabhängig zu verifizieren, dass auch die KmIVS über einen Promotor verfügt, wurde in K. lactis ein Reporterassay mit Ura3-HA durchgeführt (Daten: Stefan Kreft;

Stuerner et al. 2012). Die 303 bp große IVS Sequenz des K. marxianus DOA10 Locus wurde hierzu in einem K. lactis Expressionsplasmid (CEN, ohne Promotor) vor das Reportergen URA3-HA (KmIVS-Ura3-HA) inseriert. Zum Vergleich und zur Kontrolle wurden weitere Plasmidkonstrukte generiert, in denen URA3-HA unter Kontrolle keines Promotors (Ura3-HA), unter der Kontrolle der KlIVS (KlIVS-Ura3-HA) oder unter Kontrolle des ScGPD Promotors stand (ScGPD-URA3-HA) (Abb. 3.1.11 C.).

Nach Transformation der Plasmide in K. lactis WT Zellen wurden Zellextrakte hergestellt und die Expression des Reporters Ura3-HA mittels eines α-HA Immunblots analysiert. Wie die KlIVS vermittelt auch die KmIVS die Expression des Reporters

Nach Transformation der Plasmide in K. lactis WT Zellen wurden Zellextrakte hergestellt und die Expression des Reporters Ura3-HA mittels eines α-HA Immunblots analysiert. Wie die KlIVS vermittelt auch die KmIVS die Expression des Reporters