Offene Forschungsfragen des E3-Ligasekomplexes Doa10

1. Einleitung

1.4 Die E3-Ligase Doa10 und ihre Rolle in der zellulären Qualitätskontrolle

1.4.5 Offene Forschungsfragen des E3-Ligasekomplexes Doa10

Trotz der relativ fortgeschrittenen Charakterisierung der einzelnen Komponenten des Doa10 Komplexes sind ihre Zusammenarbeit und ihr Wirken innerhalb des Komplexes immer noch nicht genau erforscht. Bislang ist ungeklärt, warum die E3-Ligase Doa10 ungewöhnlicher Weise zur Ubiquitinierung all ihrer Substrate zwei E2-Enzyme, nämlich Ubc6 und Ubc7, benötigt. Ihr Beitrag zur Degradation unterschiedlicher Substrate variiert zwar, jedoch sind sie für die Degradation aller Doa10 Substrate essentiell (Swanson et al. 2001; Huyer et al. 2004; Carvalho et al. 2006; Ravid et al.

2006). Für beide E2s wird zur Ausführung ihrer Funktion innerhalb des Doa10 Komplexes eine Dimerisierung vermutet (Ravid & Hochstrasser 2007; Kreft &

Hochstrasser 2011; Metzger et al. 2013). Es ist fraglich, ob Ubc6 und Ubc7 dabei in einem Komplex agieren oder sequentiell mit Doa10 interagieren. Ubc6 und Ubc7 scheinen mehrere und unterschiedliche Bindungsstellen in Doa10 zu haben; neben der Interaktion von Ubc7 mit der RING Domäne und von Ubc6 mit der TD Domäne sind die genauen Positionen der zusätzlichen Interaktionsstellen innerhalb des Doa10

Proteins nicht bekannt (Kreft & Hochstrasser 2011). Ubc6 und Ubc7 vermögen unterschiedlich verknüpfte Ubiquitinketten zu assemblieren; katalysiert Ubc7 vornehmlich K48-verknüpfte Ubiquitinketten, synthetisiert Ubc6 K48- und K11-verknüpfte Ubiquitinketten (Walter et al. 2001; Bazirgan & Hampton 2008; Xu et al.

2009; Bagola et al. 2013). Es stellt sich dabei die immer noch unbeantwortete Frage, wie wohl die Ubiquitinketten von Doa10 Substraten verknüpft sein mögen. Ein weiterer ungeklärter Aspekt in der Doa10 vermittelten Degradation ist die Retrotranslokation der membranständigen Doa10 Substrate. Es wird vermutet, dass das polytopische Membranprotein Doa10 selbst einen Retrotranslokationskanal bilden könnte bzw. Teil davon sein könnte (Swanson et al. 2001; Kreft et al. 2006). Bislang konnten jedoch keinerlei Beweise hierzu erbracht werden. Ebenfalls weitgehend unerforscht ist die Erkennung von Substraten durch die E3-Ligase Doa10. Im Gegensatz zu Hrd1 verzichtet Doa10 in seinem E3-Ligasekomplex auf dauerhaft assoziierte Co-Faktoren zur Erkennung seiner Substrate; es interagiert mit diesen in der Regel direkt, die Erkennung mancher Substrate vermittelt es zusammen mit cytosolischen Hsp70 und Hsp40 Chaperonen (Ravid et al. 2006; Metzger et al. 2008; Alfassy et al. 2013; Shiber et al. 2013). Ungeklärt ist jedoch, welche Domänen innerhalb der Doa10 E3-Ligase mit den Substraten direkt interagieren und wie Doa10 eine spezifische Erkennung seiner strukturell diversen Substrate bewerkstelligt. Aufgrund der bevorzugten Erkennung von amphipathischen Helices bzw. helikalen hydrophoben Oberflächen als Degron mancher löslicher Substrate wurde die Hypothese aufgestellt, dass Doa10 über komplementäre helikale Segmente mit diesen Degrons interagieren könnte (Gilon et al. 1998; Johnson et al. 1998; Gilon et al. 2000; Swanson et al. 2001; Ravid et al. 2006; Kim et al. 2013).

Die cytosolische Exposition des Großteils der E3-Ligase Doa10 (~ 63% des Proteins) gab Anlass zur Vermutung, dass ihre großen cytosolischen Loops (Loop 2, Loop 6 und Loop 8) mitunter eine Rolle bei der Substraterkennung oder bei der Bindung von löslichen Co-Faktoren spielen könnten (Kreft et al. 2006).

1. Einleitung 1.5 Zielsetzung

Zur Wahrung ihrer zellulären Proteostase verfügt die Hefezelle in jedem ihrer subzellulären Kompartimente über ein komplexes, fein reguliertes Proteinqualitätskontrollsystem. Zentrale Komponenten dieser Qualitätskontrollsysteme sind neben Chaperonen E3-Ligasekomplexe, die anomale Proteine zur Elimination ubiquitinieren und dadurch ihre Degradation vermitteln können. Trotz breiter und intensiver Forschungsarbeiten sind viele Teilaspekte der durch E3-Ligasekomplexe vermittelten Degradationsprozesse, die Funktionsweise der E3-Ligasen selbst sowie das Zusammenwirken der E3-Ligasekomplexe in der zellulären Proteinqualitätskontrolle noch nicht genau geklärt.

Die membranständige Ligase Doa10 stellt in S. cerevisiae eine der wichtigsten E3-Ligasen des Proteinqualitätskontrollsystems im ER, im Cytoplasma und im Nukleus dar. Im Gegensatz zu S. cerevisiae exprimiert die Milchhefe Kluyveromyces lactis Doa10 nicht als ein einziges Polypeptid, sondern in Form von zwei Untereinheiten.

Dieses als Split-Doa10 bezeichnete Doa10 Ortholog in K. lactis sollte im ersten Teil dieser Arbeit funktionell charakterisiert werden. Neben dem genauen Expressionsmechanismus des Split-Doa10 sollte seine E3-Ligaseaktivität in K. lactis untersucht werden. Zudem sollte die Arbeit in ihrem ersten Teil noch versuchen, den Split des Doa10 Proteins evolutionär einzuordnen und seine physiologische Funktion zu bestimmen. Die funktionelle Charakterisierung des Split-KlDoa10 soll nicht zuletzt auch dem besseren Verständnis der Doa10 E3-Ligase in S. cerevisiae dienen.

Zur Erleichterung einer detaillierteren funktionellen Charakterisierung der Ubiquitinligase Doa10 in S. cerevisiae sollte im zweiten Teil dieser Arbeit nach dem Vorbild des natürlich gesplitteten Doa10 Orthologs in K. lactis ein stabiles, artifiziell in Loop 2 gesplittetes S. cerevisiae Doa10 Protein generiert werden. Mit seiner Hilfe sollte dann untersucht werden, ob dem großen cytosolischen Loop 2 der Doa10 E3-Ligase bei der Degradation von Doa10 Substraten eine essentielle Rolle zukommt.

Ein dritter Teil dieser Arbeit sollte sich der Analyse der im Rahmen der Generierung eines artifiziell gesplitteten ScDoa10 beobachteten Degradation des N-terminalen ScDoa10 Fragments Nt_1-390 widmen. Neben der Identifizierung der am Abbau von Nt

1-390 beteiligten E2-Enzyme und weiterer für die Degradation essentieller Co-Faktoren galt es insbesondere, die für die Degradation von Nt1-390 verantwortliche E3-Ligase zu ermitteln und damit den zellulären Qualitätskontrollweg zu definieren, der die Degradation von Nt1-390 vermittelt.

Die im Rahmen dieser Dissertation erzielten Ergebnisse sollen nicht nur zur weiterführenden Charakterisierung des E3-Ligasekomplexes Doa10, sondern auch zum besseren Verständnis der zellulären Proteinqualitätskontrolle insgesamt beitragen.

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Puffer und Lösungen

Tabelle 2.1: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Puffer und Lösungen

Name Zusammensetzung

AE Puffer 50 mM NaAc pH 5.3, 10 mM EDTA

Annealing-Puffer 0.5 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M MgCl₂

Extraktionspuffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, Proteaseinhibitoren: 625 µM PMSF, 1 µg/ml Aprotonin/Leupeptin

1x DNA-Ladepuffer 5% Saccharose, 5 mM EDTA, Bromphenolblau, Xylencyanol Dilution-Puffer 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl

pH 7.5; Proteaseinhibitoren: 1 μg/ml Aprotinin/Leupeptin, 2 µM Pepstatin A, 1 mM Pefabloc; 6 mM NEM

1x Formaldehyd Ladepuffer 5% Glycerol, 1 mM EDTA, Bromphenolblau, Xylencyanol

Fraktionierungspuffer 200 mM D-Mannitol, 20 mM Natriumphosphat pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂; Proteaseinhibitoren: 1 μg/ml Aprotinin/Leupeptin, 2 µM Pepstatin A, 1 mM Pefabloc

1x Laemmli-Laufpuffer 25 mM Tris-HCl pH 8.4, 200 mM Glycin, 0.1% (w/v) SDS 10 x MOPS

Elektrophoresepuffer

0.2 M MOPS pH 7.0, 20 mM NaAc, 10 mM EDTA

Northern Blot Laufpuffer 1x MOPS Elektrophoresepuffer, 18 % Formaldehyd (37-40%) Northern Blot Waschpuffer 2x SSC, 0.5% SDS

One Step Puffer 0.2 M LiAc, 40% (w/v) PEG 3350, 100 mM DTT

Puffer A 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA

Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM NaAc, 10% (v/v) Glycerol;

Proteaseinhibitoren: 1 μg/ml Aprotinin/Leupeptin, 2 µM Pepstatin A, 1 mM Pefabloc

1x RNA-Ladepuffer 1x MOPS Elektrophoresepuffer, 7.4% Formaldehyd, 50%

Formamid, 10 µg/ml Ethidiumbromid

S1-Puffer 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase A

S2-Puffer 200 mM NaOH, 1% (w/v) SDS

S3-Puffer 2.8 mM KAc pH 5.1

2. Material und Methoden

Sammelgelpuffer 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 0.4 % SDS, Bromphenolblau

1x Semi-Dry Transferpuffer 48 mM Tris-HCl, 39 mM Glycin pH 9.2, 0.0375% SDS, 25%

Methanol

4x SDS-Probenpuffer 200 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% Saccharose, 5 mM EDTA, 3%

SDS, 10% β-Mercaptoethanol, Bromphenolblau,

Sporulationsmedium 2% (w/v) KAc, je 10 µg/ml von Adenin, Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, L-Threonin, L-Tryptophan und Uracil

20x SSC 3 M NaCl, 0.3 M NaCitrat pH 7.0

STOP Puffer 0.5x Medium, 0.15 mg/ml Cycloheximid, 10 mM NaN₃ 1x TAE-Puffer 40 mM Tris-HCl, 19 mM Essigsäure, 1 mM EDTA pH 8.0

1x TCA-Probenpuffer 80 mM Tris, 3.5% SDS, 8 mM EDTA pH 8.0, 15% (v/v) Glycerol, 0.5 M DTT, Bromphenolblau

TE 10 mM TrisH-Cl pH8.0, 1 mM EDTA

1x Transferpuffer 12.5 mM TrisH-Cl pH 8.3, 100 mM Glycin Trenngelpuffer 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 0.4% SDS

1x TTBS 1 mM Tris-HCl pH 8.8, 10 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween 20

2.1.2 Chemikalien und Reagenzien

Tabelle 2.2: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und Reagenzien

Name Hersteller

Adenin Sigma-Aldrich

Agar Becton Dickinson

Agarose (Ultra Pure^TM) Invitrogen

Ammoniumacetat (NH₄Ac) Sigma-Aldrich

Ammoniumperoxidisulfat (APS) Roth

Ampicillin (Amp) Roth

Anisomycin Sigma-Aldrich

Aprotinin/Leupeptin Roth

L-Arginin Sigma-Aldrich

β-Mercaptoethanol Merck

Bromphenolblau Serva

Chloroform Sigma-Aldrich

Cycloheximid Sigma-Aldrich

Digitonin Serva

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth

Dithiothreitol (DTT) Roth

dNTPs Fermentas

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Roth

Ethanol Sigma-Aldrich

Ethidiumbromid Roth

Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄) Sigma-Aldrich Natriumdihydrogenphosphat (NaH₂PO₄) Merck

Natriumhydroxid (NaOH) Honeywell Riedel-de Haën

2. Material und Methoden

Salzsäure (HCl) Roth

ssDNA Sigma-Aldrich

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth

Trichloressigsäure (TCA) Roth

L-Threonin Merck

Triton X-100 Roth

Trizma Base (Tris) Sigma-Aldrich

L-Tryptophan Roth

Tween 20 Roth

UltraHybOligo Ambion

Uracil Sigma-Aldrich

Xylencyanol Roth

Yeast Nitrogen Base Invitrogen/Becton Dickinson

2.1.3 Medien

2.1.3.1 Medien zur Kultivierung von E. coli Zellen Flüssigkulturen: LB-Medium (2.5% LB-Mischung)

Feste Nährböden: LB-Medium (2.5% LB-Mischung, 1.5% LB-Agar)

Nach Bedarf wurde den Medien nach dem Autoklavieren Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml hinzugegeben.

2.1.3.2 Medien zur Kultivierung von S. cerevisiae und Kluyveromyces Zellen Flüssigkulturen:

YPDA-Vollemedium: 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose, 0.002% Adenin SD-Minimalmedium: 0.67% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 0.002% Adenin,

0.004% Uracil, 2% Glukose, 1% 100x Aminosäuremix (2 mg/ml L-Arginin, 1 mg/ml L-Histidin, 6 mg/ml L-Isoleucin, 6 mg/ml Leucin, 4 mg/ml Lysin, 1 mg/ml Methionin, 6 mg/ml L-Phenylalanin, 5 mg/ml L-Threonin, 4 mg/ml L-Tryptophan) Feste Nährböden:

YPDA-Vollmedium: 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose, 0.002% Adenin, 2%

Agar

SD-Minimalmedium: 0.67% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 0.002% Adenin, 0.004% Uracil, 2% Glukose, 1% 100x Aminosäuremix (2 mg/ml L-Arginin, 1 mg/ml L-Histidin, 6 mg/ml L-Isoleucin, 6 mg/ml Leucin, 4 mg/ml Lysin, 1 mg/ml Methionin, 6 mg/ml L-Phenylalanin, 5 mg/ml L-Threonin, 4 mg/ml L-Tryptophan), 2%

Agar

Die Herstellung von Selektivnährmedien für Hefezellen folgte dem Protokoll von Guthrie & Fink (1991). Selektivnährmedien enthielten einen der Selektion

entsprechenden 1% 100x drop out Aminosäuremix. Zur Selektion von Hefezellen, die eine kanMX- bzw. eine hphMX-Resistenzkassette in ihrem Genom integriert hatten, wurde dem autoklavierten Medium Geneticindisulfat (G418; Roth) in einer Endkonzentration von 300 µg/ml bzw. Hygromycin B (InvivoGen) in einer Endkonzentration von 250 µg/ml hinzugefügt.

2.1.4 Zellen

2.1.4.1 E. coli Bakterienstämme

Tabelle 2.3: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten E. coli Bakterienstämme

Stamm Genotyp Referenz

Top 10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mrcBC) Ф80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(araleu)7679 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Invitrogen XL10-Gold Tet^r Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1

recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [Fc proAB lacI^qZΔM15 Tn10 (Tet^r) Amy Cam^r]

Stratagene

2.1.4.2 Hefestämme 2.1.4.2.1 S. cerevisiae

Tabelle 2.4: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten S. cerevisiae Stämme

Stamm Genotyp Referenz

MHY500 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2 Chen et al. (1993) MHY551 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2

ubc7::LEU2

Chen et al. (1993) MHY1702 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2

doa10Δ::HIS3 hrd1Δ::LEU2

Hochstrasser Labor, Yale MHY2822 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2

hrd1Δ::LEU2

Stefan Kreft MHY2923 MATα his3-Δ200 leu2-Δ1 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63

doa10-1-1319myc13-HisMX6

Hochstrasser Labor, Yale MHY3033 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 doa10Δ::kanMX Tong et al. (2001) MHY4086 MATa his3-Δ200 ura3-52 trp1-Δ63 leu2-3,112

lys2-801::LYS2:: Deg1-URA3 doa10Δ::hphMX4

Stefan Kreft, Stuerner et al. (2012)

MHY4175 MATa his3-Δ200 leu2-Δ1 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 ade2-101 leu2-Δ1::LEU2::pRS305MET25-Deg1-VMA12-kanMX6 doa10Δ::hphMX4

Stefan Kreft, Stuerner et al. (2012)

SKY122 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 pdr5::kanMX Open Biosystems Deletion Library

SKY128 MATa leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 can⁺ cir⁺ doa10Δ::kanMX4

Stefan Kreft

SKY167 MHY4086 mit Plasmid YCplac22-GPD-DOA10 Stefan Kreft, Stuerner et al. (2012)

SKY200 MATa his3-Δ200 leu2-Δ1 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 doa10-N1-1319myc13-His3MX6 TRP1::pRH373-2HA-UBC7

Hochstrasser Labor, Yale

SKY218 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2 ubc6-Δ1::HIS3

Sommer & Jentsch (1993) SKY239 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2

doa10(MER-aa394-1319)-13MYC-His3MX6

Stefan Kreft SKY270 MATa leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 can⁺

cir⁺ doa10Δ::kanMX4 pep4Δ::hphMX4

Stefan Kreft

2. Material und Methoden

SKY272 MATα his3-Δ200 leu2-Δ1 ura3-52 lys2-801 trp1-Δ63 doa10-1-950myc13-His3MX6 TRP1::pRH373-2HA-UBC7

diese Arbeit, Stuerner et al. (2012)

SKY330 MHY4175 mit Plasmid Ycplac22-GPD-DOA10 diese Arbeit, Stuerner et al. (2012)

SKY335 MATa ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3,112 can1-100 Rothstein Labor, New York

SKY336 MATa ade2-1 ura3-52 his3-11 trp1-1 leu2-3,112 can1-100 cdc48-3

Ye et al. (2001) SKY405 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2

doa10Δ::hphMX4

Stefan Kreft SKY408 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2

doa10Δ::hphMX4 ubc7Δ::LEU2

Stefan Kreft

SKY427 MATα his4-912δ lys2-128δ leu2-Δ1 ura3-52 RSP5⁺ Hochstrasser Labor, Yale SKY429 MATα his4-912δ lys2-128δ leu2-Δ1 ura3-52 rsp5-1 Hochstrasser Labor, Yale SKY435 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ubc7Δ::kanMX Tong et al. (2011) SKY436 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 gal2

doa10(MER-aa462-1319)-13MYC-His3MX6

diese Arbeit

SKY444 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ubr1Δ::kanMX4 Open Biosystems Deletion Library

SKY454 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 hul5Δ::kanMX4 Open Biosystems Deletion Library

SKY455 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 san1Δ::kanMX4 Open Biosystems Deletion Library

SKY459 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 asi1Δ::kanMX Open Biosystems Deletion Library

SKY460 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 asi2Δ::kanMX Open Biosystems Deletion Library

SKY461 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 asi3Δ::kanMX Open Biosystems Deletion Library

SKY463 MATa his3-Δ200 leu2-3,112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 ubc1-Δ1::URA3

Hochstrasser Labor, Yale SKY465 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 asi1Δ::hphMX Stefan Kreft

SKY467 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 asi1Δ::hphMX pdr5Δ::kanMX

Stefan Kreft

SKY468 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ubc4Δ::kanMX Open Biosystems Deletion Library

SKY469 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ubc5Δ::kanMX Open Biosystems Deletion Library

2.1.4.2.2 Genus Kluyveromyces

Tabelle 2.5: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Kluyveromyces Stämme

Stamm Genotyp Referenz

K. lactis

SKY193 MATα trp1-11 ura3-12 ade1-600 adeT-600 Breunig and Kuger (1987) SKY241 MATα trp1-11 ura3-12 ade1-600 adeT-600

doa10Δ::kanMX6

Stefan Kreft, Stuerner et al. (2012)

SKY243 MATa ura3 leu2 his::loxP KHO46-12B (OS162),

Heinisch et al. (2010)

SKY244 MATα ura3 leu2 his::loxP KHO46-12A (OS163),

Heinisch et al. (2010) SKY281 MATα ura3 leu2 his::loxP doa10Δ::hphMX4 diese Arbeit, Stuerner et

al. (2012) SKY432 MATα trp1-11 ura3-12 ade1-600 adeT-600

doa10CtΔ::kanMX Klon 23

diese Arbeit

SKY433 MATα trp1-11 ura3-12 ade1-600 adeT-600

SKY285 DSM 70792; natürliches Isolat DSM Braunschweig

K. dobzhanskii

SKY367 CBS 2104; natürliches Isolat CBS, Utrecht

2.1.5 Synthetische Oligonukleotide

Synthetische Oligonukleotide wurden von der Sigma-Aldrich GmbH oder von IDT (Integrated DNA Technologies, Inc.) hergestellt. Bei Oligonukleotiden für Mutagenese-PCRs sind die an einer Position alternativ eingebauten Nukleotide in Klammern angegeben. Restriktionsschnittstellen innerhalb der Oligonukleotide sind in Kleinbuchstaben angegeben.

Tabelle 2.6: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten synthetischen Oligonukleotide

Nr. Name Sequenz in 5´-3´Richtung

2. Material und Methoden

* Oligonukleotide, die ³²P-endmarkiert in Northern Blots als Oligonukleotidsonden dienten (+): forward Primer

(-): reverse Primer

2.1.6 Plasmide

Tabelle 2.7: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten S. cerevisiae Expressionsplasmide

Nr. Name Genotyp Referenz

STK02-2-3 pRS416-Ubc6-HA Amp^R; CEN URA3 mit Ubc6-HA ORF unter endogenem Promotor;

CYCI Terminator

Walter et al. (2001)

STK02-8-6 YCplac22 Amp^R; CEN TRP1 Gietz and Sugino (1988)

STK03-2-4 YEp110 YEp96 mit UbK48R ORF Hochstrasser et al.

(1991)

STK03-7-5 p414MET25 Amp^R; CEN TRP1 mit ScMET25 Promotor und CYCI Terminator

Mumberg et al. (1994) STK03-7-6 p416MET25 Amp^R; CEN URA3 mit ScMET25

Promotor und CYCI Terminator

Mumberg et al. (1994)

STK04-2-7

STK06-6-9 p416GPD-HA-PCA1 Amp^R; CEN URA3 mit 3HA-Pca1 ORF unter ScGPD Promotor;

2. Material und Methoden STK08-5-1 pCUP1-UbK11R YEp96 mit UbK11R ORF diese Arbeit

Tabelle 2.8: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten K. lactis Expressionsplasmide

Nr. Name Genotyp Referenz

STK04-8-5 pCXs18 Amp^R; KlCEN2 ScURA3 Heinisch et al. (2010) STK04-8-6 pCse20 Amp^R; KlCEN2 ScLEU2 Heinisch et al. (2010) STK04-9-3

STK06-1-3 pCXs18-URA3-HA pCXs18 mit Ura3-HA ORF; CYCI Terminator

STK06-9-6

Tabelle 2.9: Auflistung sonstiger Plasmide, die in dieser Arbeit verwendet wurden

Nr. Name Genotyp Referenz

STK04-4-1 pBSSK bzw. pBlsIISK(-) Amp^R; Klonierungsvektor Stratagene STK04-7-4

Es wurden jeweils die vom Hersteller vorgegebenen Puffer bzw. Puffersyteme verwendet.

Restriktionsendonukleasen:

Es wurden Restriktionsendonukleasen des Herstellers New England Biolabs (NEB) mit den jeweils vom Hersteller vorgegebenen Puffern verwendet.

Polymerasen:

Phusion^® High Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) Pfu Turbo^®DNA Polymerase (Stratagene)

Taq Polymerase (AG Scheffner, Universität Konstanz)

2. Material und Methoden

Folgende Antikörper wurden zur Immundetektion und Immunpräzipitation verwendet:

Tabelle 2.10: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Antikörper

Antikörper Charakteristika Hersteller Verdünnung^*

Primärantiköper

anti-FLAG M2 monoklonal, Maus Sigma 1:5000

anti-HA HA.11 monoklonal, Maus Covance 1:5000

anti-c-Myc (A-14) sc-789

polyklonal, Kaninchen Santa Cruz Biotechnology 1:7500

anti-c-Myc 9E10 monoklonal, Maus Abcam 1:7500

anti-Ubc6 polyclonal, Kaninchen Thomas Sommer, MDC Berlin

1:5000^**

anti-Doa10 polyklonal, Kaninchen Stefan Kreft, Universität Konstanz

1:5000

anti-Pgk1 monoklonal, Maus Invitrogen 1:10000

anti-ProtA (PAP) Kaninchen Sigma 1:7500

anti-Rad23

**Verhältnis Stocklösung : in 5% (w/v) in TTBS gelöstem Magermilchpulver (v/v)

2.1.9 Längenstandards 2.1.9.1 DNA-Marker

Gene Ruler^TM1kb DNA Ladder Plus (Fermentas)

bp: 20000, 10000, 7000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 75 2.1.9.2 Proteinmarker

Page Ruler^TMPrestained Protein Ladder (Fermentas) kDa: 170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17, 11

Page Ruler^TMUnstained Protein Ladder (Fermentas) kDa: 200, 150, 120, 100, 85, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20,15, 10

2.1.10 Kits

Tabelle 2.11: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Kits

Name Hersteller

Nukleospin^®Extract II Machery-Nagel

PureYield^®Midipreps Promega

QuikChange^®Site-Directed Mutagenesis Kit Stratagene Western Lightning^®Plus-ECL Perkin Elmer WesternBright ECL HRP Substrate Advansta

2.1.11 Geräte

Tabelle 2.12: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten Geräte

Name Hersteller

Axioskop 40 Durchlichtmikroskop Zeiss

Concentrator 5301 (SpeedVac) Eppendorf

Centrifuge 5415D Eppendorf

Durchlichtmikroskop Leitz

FLA-5000 Imaging System Fuji

Function Line Microbiological Incubators Heraeus

G25 Incubator Shaker New Brunswick Scientific

Heraeus Fresco 17 Refrigerated Micro Centrifuge Thermo Scientific

Imagersystem FUJI LAS 3000 Fuji

Innova 4000 Incubator Shaker New Brunswick Scientific Innova^®44/44R Incubator Shaker New Brunswick Scientific

Mastercycler gradient Eppendorf

NanoPhotometer^TM Implen

Phosphorimager BAS Reader Raytest

PowerPac Basic^TM Bio-Rad

SmartSpec^TM Plus Spectrophotometer Bio-Rad

TPersonal Thermocycler Biometra

Trans-Blot^® Transfer Cell Bio-Rad

Trans-Blot^® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell

Bio-Rad

2. Material und Methoden 2.2 Methoden

Die angewandten molekularbiologischen und biochemischen Methoden richten sich im Wesentlichen nach Standardprotokollen von Ausubel (1996) und Sambrook (2001). In nahezu allen der unten beschriebenen Methoden wurden sterile Lösungen und sterile Gefäße eingesetzt.

2.2.1 Kultivierung und Lagerung von Zellen 2.2.1.1 Escherichia coli Bakterien

Die Anzucht von E. coli Bakterien erfolgte in LB-Medium bei 37°C in einem Schüttler bei 200 rpm über Nacht. Nach Bedarf wurde dem LB-Medium Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml hinzugegeben. Zur Anlage von Dauerkulturen wurde 1 ml einer E. coli Übernachtkultur mit 600 µl sterilem 75% Glycerol versetzt und bei -80°C eingefroren.

2.2.1.2 Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces Hefezellen

Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces Hefezellen wurden in Flüssigkulturen in einem Schüttler bei 200 rpm bzw. in einem Rotator oder auf Agarplatten bei 30°C kultiviert. Zur Selektion von Transformanten wurde SD-Minimalmedium mit den entsprechenden Aminosäuren bzw. Antibiotika verwendet; die Kultivierung ohne erforderliche Selektion erfolgte in YPDA-Vollmedium. Zur langfristigen Aufbewahrung von Hefezellen wurden zu 1 ml Übernachtkultur 600 µl steriles 75%

Glycerol hinzugegeben und bei -80°C eingefroren.

2.2.2 Präparation und Quantifizierung von Plasmid-DNA 2.2.2.1 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen

Die Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen erfolgte bei Übernachtkulturen bis zu 3 ml (Mini-Präparation) nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Stephen et al. 1990).

3 ml Übernachtkultur wurden durch Zentrifugation (6000 x g, 1 min, RT) geerntet. Das Zellpellet wurde in 250 µl S1-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 250 µl S2-Puffer wurde die Probe bei RT für 3 min inkubiert. Die Zelllyse wurde durch Zugabe von 250 µl S3-Puffer gestoppt. Nach 5-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zelltrümmer inklusive denaturierter Proteine und chromosomaler DNA bei 16800 x g und 4°C für 10 min abzentrifugiert. Zur Fällung der Plasmid-DNA wurden 600 µl kaltes 100%

Isopropanol zu dem Überstand hinzugegeben. Die DNA wurde durch Zentrifugation für 30 min bei 16800 x g und 4°C gefällt. Nach Waschen des DNA-Pellets mit 70%

Ethanol wurde es in einer SpeedVac für 5 min bei 45°C getrocknet. Die Plasmid-DNA wurde in 30 µl destilliertem, sterilem H₂O resuspendiert.

Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen bei 100 ml Übernachtkulturen (Midi-Präparation) wurde das Kit PureYield^®Midipreps (Promega) verwendet. Die Präparation erfolgte gemäß den Vorschriften des Herstellers. Die gereinigte DNA wurde mit 400 µl destilliertem, sterilem H2O eluiert.

2.2.2.2 Quantifizierung von Plasmid-DNA

Die Konzentration von Plasmid-DNA aus Mini-Präparationen wurde durch den Vergleich des Signals der Plasmid-DNA mit dem Signal einer Plasmidpräparation mit bekannter Konzentration in einem mit Ethidiumbromid bzw. MidoriGreen gefärbten Agarose-Gel bestimmt.

Die Konzentrationsbestimmung von Plasmid-DNA aus Midi-Präparationen erfolgte durch spektrophotometrische Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260) unter Zuhilfenahme des NanoPhotometers^TM (Implen). Der Quotient aus OD260/OD280 diente als Maß für die Reinheit der DNA.

2.2.3 Präparation und Quantifizierung von RNA aus Kluyveromyces Hefezellen 2.2.3.1 Isolierung der Gesamt-RNA aus Kluyveromyces Hefezellen

Die Isolierung der Gesamt-RNA aus Kluyveromyces Hefezellen erfolgte nach der Hot-Phenol Methode von Schmitt et al. (1990). 10 ml YPDA-Kultur mit einer OD₆₀₀ ~ 2.5-5.0 wurden geerntet (3000 x g, 10 min, RT). Die pelletierten Zellen wurden in 400 µl AE Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 40 µl 10% SDS und 440 µl Phenol (in AE

Im Dokument Proteinqualitätskontrolle am ER und im Nukleus : Funktionelle Charakterisierung der RING E3-Ligasekomplexe Doa10 und Asi (Seite 48-0)