Der Expressionsmechanismus des Split-Doa10 in K. lactis

Der Vergleich orthologer DOA10 Sequenzen von sequenzierten Hefegenomen des Subphylums Saccharomycotina offenbarte in der Milchhefe Kluyveromyces lactis die Besonderheit, dass der DOA10 Locus durch eine Intervening Sequence (IVS) in zwei ORFs, einen Nt-ORF und einen Ct-ORF, unterteilt ist (Abb. 3.1.1 und Abb. 3.1.2 A.;

Abb. 4.1.1). Die Entdeckung dieses gesplitteten DOA10 Locus in K. lactis warf unmittelbar die Fragen auf, welche(s) Genprodukt(e) der DOA10 Locus in K. lactis exprimiert und was für eine Funktion der IVS obliegen könnte.

4.1.2.1 Das Split-KlDoa10 besteht aus zwei Untereinheiten

Die ektopische Expression einer getaggten Version des gesamten DOA10 Locus in K.

lactis zeigte, dass das Doa10 Ortholog in K. lactis im Gegensatz zum ScDoa10 und anderen Doa10 Orthologen nicht als ein großes Polypeptid, sondern in Form von zwei separaten Polypeptiden exprimiert wird: einem N-terminalen Fragment (Nt) und einem C-terminalen Fragment (Ct) (Abb. 3.1.2 A., B. und C. und Abb. 3.1.3 B. und C.; Abb.

4.1.1). Es wurde daher als KlDoa10 bezeichnet. Die beiden Fragmente des Split-KlDoa10 sind zu dem N- bzw. C-terminalen Teil des ScDoa10 homolog (Nt: ~39%; Ct:

~35%) (Abb. 3.1.2. B.; Anhang Abb. 5.1 und Abb. 5.2); Bereiche hoher Homologie stellen die RING-CH Domäne sowie die TD Domäne dar. Das 34 kDa Nt-Fragment des Split-KlDoa10 besteht aus der N-terminalen cytosolischen RING-CH Domäne und zwei TMs, das größere 105 kDa Ct-Fragment umfasst sehr wahrscheinlich 12-14 TMs inklusive der konservierten TD Domäne (Abb. 3.1.2 C.; Abb. 4.1.1). Der Split ereignete sich somit im großen cytosolischen Loop 2 zwischen der TM2 und der TM3 des ScDoa10 Proteins (Abb. 3.1.2 C.). Eine korrekte Insertion der beiden Fragmente des Split-KlDoa10 in die Membran konnte mittels eines Fraktionierungs- und Solubilisierungsassays belegt werden (Abb. 3.1.5). Das Nt- und Ct-Fragment des Split-KlDoa10 stellen damit wie ScDoa10 integrale Membranproteine dar.

Der natürliche Split des Doa10 Proteins erfolgte aller Wahrscheinlichkeit nicht zufällig ausgerechnet im Loop 2 des Proteins: Der große cytosolische Loop 2 ist in allen Doa10 Orthologen von einer sehr geringen Komplexität und verfügt über eine hohe Anzahl von intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs; Intrinsically Disordered Regions). Aufgrund seiner geringen Sequenzkomplexität könnte Loop 2 durchaus die Insertion eines DNA Fragments und/oder eine Sequenzdivergenz erlauben. Diese besonderen Eigenschaften der Loop 2 Sequenz erschweren nicht zuletzt ein Alignment der Loop 2 Sequenzen von Doa10 Orthologen. Der direkte Vergleich der Aminosäuresequenz des (gespaltenen) Loops 2 des Split-KlDoa10 mit der des Loops 2 des ScDoa10 ließ erkennen, dass im (gespaltenen) Loop 2 des Split-Doa10 anscheinend eine ~ 100 Aminosäuren große

Sequenz fehlt (Abb. 3.1.2 B.; Anhang Abb. 5.1 und Abb. 5.2). Es ist fraglich, ob und welche Auswirkungen der Verlust dieser Sequenz innerhalb des Loops 2 für das Split-KlDoa10 hat. Die Funktion des großen cytosolischen Loops 2 der S. cerevisiae E3-Ligase Doa10 ist bislang nicht bekannt. Aufgrund seiner Größe und seiner Sequenzbeschaffenheit wurde ihm eine Funktion in der Interaktion mit Substraten oder mit cytosolischen Co-Faktoren zugeschrieben (Kreft et al. 2006). Bislang konnten hierfür jedoch definitiv keine Beweise erbracht werden (vgl. Abschnitt 3.2 und Abschnitt 4.2).

4.1.2.2 Die IVS Sequenz des KlDOA10 Locus enthält einen funktionellen Promotor Angesichts der nachgewiesenen Expression zweier Doa10 Fragmente von dem K. lactis DOA10 Locus wurde für die 508 bp große IVS des KlDOA10 Locus eine Funktion als IRES oder als Promotor postuliert. Dabei führten zwei wesentliche Experimente zur Entdeckung einer Promotorfunktion der K. lactis IVS Sequenz: In einer Northern Blot Analyse der K. lactis Gesamt-RNA konnten zwei verschieden große, KlDOA10 spezifische Transkripte detektiert werden (Abb. 3.1.4 A. und B.; Abb. 4.1.1). Das kleinere, ~1200 Nukleotide große Transkript entsprach in seine Größe einer mRNA des Nt-ORFs des KlDOA10, das größere, ~3200 Nukleotide große Transkript einer mRNA des Ct-ORFs. Damit war erwiesen, dass sich in der IVS Sequenz ein Promotor zur Expression des Ct-ORFs, jedoch auch ein Terminator für die Expression des Nt-ORFs befinden muss. Ein Reporterassay mit URA3-HA als Reportergen bestätigte die Resultate der Northern Blot Analyse und zeigte, dass die IVS Sequenz für sich allein die Expression eines Reportergens vermitteln kann (Abb. 3.1.4 C.). Der genaue Expressionsmechanismus des Split-KlDoa10 war damit aufgeklärt (Abb. 4.1.1): Die IVS Sequenz des K. lactis DOA10 Locus enthält einen funktionellen Promotor, der die Expression des Ct-Fragments des Split-KlDoa10 bewirkt. Der DOA10 Locus in K. lactis exprimiert demnach zwei verschieden große DOA10 mRNAs: die kleinere codiert für das Nt-Fragment und die größere für das Ct-Fragment des Split-KlDoa10.

Die IVS Sequenz des KlDOA10 Locus besitzt keine für eukaryotische Gene klassische Promotor-Konsensussequenz wie z.B. die TATA-Box, das INR-Element (Initiator), das BRE-Element (B Recognition Element), die CCAAT-Box, die GC-Box oder CpG-Inseln (Pedersen et al. 1999; Zhang 2007; Decker & Hinton 2013). Sie zeigte zudem auch keine klar ersichtlichen Homologien zu Sequenzen der GenBank Datenbank (Daten: Stefan Kreft). Durch Mapping konnte die 5´-Grenze des Promotors innerhalb der IVS Sequenz lokalisiert werden (Abb. 3.1.4 D.): Der Promotor des Ct-ORFs scheint zwischen den ersten 150 und 260 bp der IVS zu beginnen, also ungefähr 250-360 bp stromaufwärts vom Transkriptionsstart des Ct-ORFs. Aufgrund des durchgeführten Reporterassays mit URA3-HA als Reportergen kann auch eine erste, jedoch keine definitive Aussage über die Stärke des IVS Promotors getroffen werden. Im Vergleich zum IVS Promotor führte der konstitutive ScGPD Promotor in K. lactis zu einer ~5fach höheren Expression des Reportergens (Abb. 3.1.4 C.). Der GPD Promotor stellt in S.

cerevisiae einen sehr starken Promotor dar, der eine Überexpression des Reporters zur Folge hat (Miller et al. 1998). In einem weiteren Reporterassay mit URA3-HA wurde

4. Diskussion

zusätzlich die Promotoraktivität der IVS Sequenz mit der eines endogenen K. lactis Promotors verglichen, nämlich mit der des endogenen Promotors des Nt-ORFs (~400 bp Sequenz stromaufwärts vom Transkriptionsstart des Nt-ORFs). Im Vergleich zum endogenen Promotor des Nt-ORFs vermochte die IVS Sequenz eine ~ 2fach höhere Expression des URA3-HA Reportergens zu bewirken (Daten nicht gezeigt). Der IVS Promotor scheint damit kein extrem starker Promotor zu sein, jedoch könnte er sich als etwas stärker als der Promotor des Nt-ORFs des Split-KlDoa10 erweisen. Zur genauen Definition und Charakterisierung des IVS Promotors werden detailliertere Untersuchungen notwendig sein. Weitere Hinweise über die Stärke des IVS Promotors könnte beispielsweise die Bestimmung der relativen mRNA Levels der beiden Split-KlDoa10 Fragmente mittels einer quantitative Real-Time PCR (qPCR) liefern.

Abbildung 4.1.1: Der Expressionsmechanismus des Split-Doa10 in K. lactis. Der DOA10 Genlocus in K. lactis ist durch eine Intervening Sequence (IVS) in einen N-terminalen ORF (Nt-ORF) und einen C-terminalen ORF (Ct-ORF) geteilt. Die IVS enthält einen Promotor (P) für die Expression des Ct-ORFs und einen Terminator (T) für die Expression des Nt-ORFs. Der K. lactis DOA10 Locus exprimiert damit zwei unterschiedlich große Transkripte bzw. mRNAs: Das kleinere ~1200 Nukleotide (nts) große Transkript codiert für das 291 Aminosäuren (aa) große N-terminale Fragment des Split-KlDoa10, das größere ~3200 Nukleotide große Transkript für das 923 Aminosäuren große C-terminale Fragment.

4.1.2.3 Das relative Expressionsverhältnis der beiden Split-KlDoa10 Fragmente Ein Vergleich der relativen Expressionslevels der beiden Split-KlDoa10 Fragmente offenbarte, dass in logarithmisch wachsenden K. lactis Zellen anscheinend das kleinere Nt-Fragment des Split-KlDoa10 im Verhältnis zum größeren Ct-Fragment ~ 5-10fach höher exprimiert ist (Abb. 3.1.3 D.). Abzuklären wäre dabei zunächst, ob der detektierte Unterschied im Proteinlevel der Fragmente in der Zelle wirklich gegeben ist oder ob er lediglich ein experimentelles Artefakt darstellt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass das detektierte niedrigere Proteinlevel des größeren Ct-Fragments auf einer ineffizienten Extraktion und/oder einem ineffizienten Elektrotransfer beruhen könnte.

Ein tatsächlich bestehender Unterschied im Expressionslevel der beiden Fragmente des Split-KlDoa10 in logarithmisch wachsenden K. lactis Zellen könnte die Folge entweder einer erhöhten Expression des Nt-Fragments oder einer verminderten Expression des Ct-Fragments sein. Eine veränderte Expression eines der beiden Fragmente kann grundsätzlich durch Regulation der Expression auf Gen-, mRNA- oder Protein-Ebene erreicht werden. Die einfachste Erklärung für ein im Vergleich zum Nt-Fragment niedrigeres Expressionslevel des Ct-Fragments wäre eine verminderte Biosynthese des Ct-Fragments aufgrund einer schwächeren Transkription des Ct-ORFs. Gegen diese Hypothese könnte jedoch die bereits diskutierte Beobachtung sprechen, dass im Reporterassay der IVS Promotor des Ct-ORFs im Vergleich zum Promotor des Nt-ORFs eine höhere Expression des Reportergens URA3-HA bewirkte (Daten nicht gezeigt; vgl. Diskussion 4.1.2.2). Die Expression des Ct-Fragments könnte jedoch auch post-translational negativ reguliert werden. Aufgrund einer post-translationalen Modifikation könnte das Ct-Fragment instabiler als das Nt-Fragment sein. Dagegen spricht jedoch, dass sowohl das Nt-Fragment als auch das Ct-Fragment des Split-KlDoa10 weitestgehend stabil sind (Abb. 3.1.14 A. und B.). Zur Aufklärung des tatsächlichen relativen Expressionsverhältnisses der beiden Split-KlDoa10 Fragmente könnte zunächst eine Analyse der relativen mRNA-Levels der beiden Fragmente mittels einer quantitativen Real Time PCR (qPCR) beitragen; zusätzlich könnten die relativen Proteinlevels der beiden Split-KlDoa10 Fragmente mittels quantitativer Massenspektrometrie analysiert werden.

Fraglich ist, ob der erhöhten Expression des Nt-Fragments gegenüber dem Ct-Fragment in logarithmisch wachsenden K. lactis Zellen eine besondere Funktion zugrunde liegen könnte und wenn ja, welche. Eine potentielle Funktion der höheren Expression des Nt-Fragments wird im nachfolgenden Abschnitt 4.1.5 diskutiert (vgl. Abschnitt 3.1.7.2 und Abschnitt 4.1.5).

4. Diskussion

4.1.3 Das Split-Doa10 stellt in K. lactis eine funktionelle Doa10 E3-Ligase dar