Doa10 Substrate

Aufgrund ihrer Funktion in mehreren zellulären Qualitätskontrollsystemen sowie in der physiologisch regulierten Degradation von Proteinen verfügt die Ubiquitinligase Doa10 über ein sehr breites Substratspektrum. Dieses umfasst nicht nur Membranproteine der ER- und der Nukleus-Membran, sondern auch lösliche Proteine des Cytosols und des Nukleus (Abb. 1.8) (Vashist & Ng 2004; Ravid et al. 2006). Für die Degradation all seiner nukleären Substrate ist eine Lokalisation des Doa10 E3-Ligasekomplexes in der Inneren Nukleus-Membran unerlässlich (Deng & Hochstrasser 2006). Die Substrate von Doa10 sind von sehr diverser Topologie und weisen kein universales Degron auf.

Jedoch scheint Doa10 bevorzugt amphipathische Helices bzw. hydrophobe helikale Oberflächen zu erkennen (Gilon et al. 1998; Johnson et al. 1998; Gilon et al. 2000;

Swanson et al. 2001; Ravid et al. 2006; Kim et al. 2013). Die an der Interaktion mit den Substraten beteiligten Domänen von Doa10 sind weitestgehend unbekannt.

Als erstes Substrat des Doa10 E3-Ligasekomplexes wurde der nukleäre Transkriptionsfaktor MATα2 identifiziert (Hochstrasser & Varshavsky 1990;

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Hochstrasser et al. 1991; Swanson et al. 2001). MATα2 wird in S. cerevisiae vom MATα Locus codiert und reprimiert in haploiden α Hefezellen die Transkription von a-zellspezifischen Genen. Der Repressor MATα2 stellt in α Zellen ein äußerst instabiles Protein mit einer Halbwertszeit von ~ 5 min dar, in diploiden Zellen jedoch wird er durch die Heterodimerisierung mit MATa1 stabilisiert.

Abbildung 1.8: Substrate des E3-Ligasekomplexes Doa10 in S. cerevisiae. Der E3-Ligasekomplex Doa10 hat ein sehr breites Substratspektrum. Neben cytosolischen und nukleären lösliche Proteinen stellen auch Proteine der ER-Membran und der Inneren Nukleus-Membran Substrate des Doa10 Komplexes dar. (blau: Membranproteine, schwarz: lösliche Proteine, *: mutierte Proteine)

Neben dem E3-Ligasekomplex Doa10 vermittelt noch die STUbL Slx5/Slx8 zusammen mit dem E2 Ubc4 die Ubiquitinierung und proteasomale Degradation von MATα2 (Xie et al. 2010). Die ersten 67 N-terminalen Aminosäuren von MATα2 bilden ein für die E3-Ligase Doa10 spezifisches Degradationssignal, das als Deg1 bezeichnet wird (Chen et al. 1993; Johnson et al. 1998). Innerhalb des Degrons Deg1 ist dabei ein Segment von ~ 19 meist hydrophoben Aminosäuren, das die Formation einer amphipathischen Helix mit hydrophober Oberfläche begünstigt, für die Doa10 vermittelte Degradation entscheidend (Johnson et al. 1998). Doa10 scheint vornehmlich diese amphipathische Helix mit ihren exponierten hydrophoben Aminosäureresten als Degron zu erkennen. In diploiden Zellen ist diese Helix in die Bildung des Heterodimers MATα2-MATa1 involviert. Ihre hydrophobe Oberfläche wird durch die Interaktion mit MATa1 maskiert und kann daher von Doa10 nicht mehr als Degron erkannt werden. Dies hat die Stabilisierung von MATα2 in diploiden Zellen zur Folge (Johnson et al. 1998; Laney &

Hochstrasser 2003). Die Fusion des Degrons Deg1 an ein eigentliches stabiles Protein bewirkt die proteasomale Degradation des Proteins durch den Doa10 E3-Ligasekomplex (Chen et al. 1993; Swanson et al. 2001; Ravid et al. 2006). Deg1-Fusionsproteine wurden und werden vorwiegend als Reporterproteine zur Identifizierung neuer Komponenten des Doa10 Komplexes sowie zur Überprüfung der Aktivität des Doa10 Komplexes verwendet. Die E3-Ligase Doa10 selbst wurde in einem Screen mit

Deg1-Fusionsproteinen entdeckt (Swanson et al. 2001). Neben löslichen Deg1-Fusionsproteinen wie Deg1-Ura3 oder Deg1-β-gal werden auch membranständige Fusionsproteine wie Deg1-Vma12 als Reporter eingesetzt. Aufgrund eines Kernlokalisierungssignals (NLS; Nuclear Localization Signal) in Deg1 sind Deg1-Fusionsproteine sehr wahrscheinlich teilweise oder gänzlich nukleär lokalisiert (Hall et al. 1990; Lenk & Sommer 2000; Deng & Hochstrasser 2006; Ravid et al. 2006).

Überraschenderweise wird das membranständige Deg1-Fusionsprotein Deg1-Sec62 nicht Doa10, sondern Hrd1 vermittelt abgebaut (Mayer et al. 1998; Rubenstein et al.

2012). Die dauerhafte Bindung von Deg1-Sec62 an das Sec61 Translokon nach seiner co-translationalen Insertion in die ER-Membran bewirkt eine Änderung der Topologie von Deg1-Sec62, die wiederum seine Hrd1-abhängige Degradation zur Folge hat (ERAD-T Substrat) (Rubenstein et al. 2012).

Doa10 vermittelt ebenfalls die physiologisch regulierte Degradation von membranständigen Proteinen des Nukleus. Neueste Forschungsergebnisse identifizierten das integrale Membranprotein Asi2 (Amino acid sensor-independent protein 2) als Substrat des Doa10 E3-Ligasekomplexes (Boban et al. 2014; Boban et al.

2015). Asi2 ist in S. cerevisiae ausschließlich in der Inneren Nukleus-Membran lokalisiert und verfügt über eine große, ins Nukleoplasma ragende N-terminale Domäne (Zargari et al. 2007). Zusammen mit den Proteinen Asi1 und Asi3 wirkt Asi2 als negativer Regulator in dem SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5)-Signalweg (Forsberg et al. 2001b;

Forsberg & Ljungdahl 2001; Andreasson & Ljungdahl 2002; Andreasson & Ljungdahl 2004; Boban et al. 2006; Zargari et al. 2007).

Im Rahmen der nukleären Proteinqualitätskontrolle vollzieht der Doa10 E3-Ligasekomplex die Ubiquitinierung von mutierten löslichen und membranständigen Nukleusproteinen wie Ndc10* und Mps2* (Ravid et al. 2006). Ndc10* (oder auch Ndc10-2) ist eine temperatursensitive Mutante des nukleoplasmatischen Proteins Ndc10 (Nuclear division cycle protein 10), das ein essentielles Protein des Kinetochors sowie eine Untereinheit des CBF3-Komplexes darstellt (Doheny et al. 1993; Kopski &

Huffaker 1997). Die Mutation in Ndc10* befindet sich im C-terminalen Teil des Proteins und bewirkt eine strukturelle Veränderung dieses Segments, welche die Exposition des Doa10 spezifischen Degradationssignals DegAB zur Folge hat (Furth et al. 2011; Alfassy et al. 2013). Das C-terminale Degron DegAB besteht aus den zwei hydrophoben Elementen DegA und DegB: DegA umfasst zwei amphipathische Helices, die über ihre hydrophoben Oberflächen miteinander interagieren; als DegB wird eine hydrophobe, gering strukturierte Region im äußersten C-terminalen Teil des Degrons bezeichnet (Alfassy et al. 2013). DegB ist im Gegensatz zu DegA für die Ubiquitinierung von Ndc10* irrelevant, jedoch essentiell für dessen proteasomale Degradation (Alfassy et al. 2013). Für die Ubiquitinierung und Degradation des löslichen Substrates Ndc10* sind als zusätzliche Faktoren die Hsp70 Chaperone Ssa1 und Ssa2 sowie das Hsp40 Co-Chaperon Sis1 erforderlich (Shiber et al. 2013). Es wird vermutet, dass den Hsp70 Proteinen Ssa1 und Ssa2 dabei die Entscheidung obliegt, ob Ndc10* abgebaut oder sequestriert wird; das Co-Chaperon Sis1 scheint den Transport

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des mutierten Proteins zum E3-Ligasekomplex zu vermitteln (Shiber et al. 2013).

Ebenso könnte bei dem integralen Membranprotein Mps2 (Monopolar spindle protein 2) durch Mutation (Mps2* oder Mps2-1) ein Doa10 spezifisches Degron offengelegt werden, das aus hydrophoben amphipathischen Segmenten besteht (McBratney &

Winey 2002; Ravid et al. 2006). Mps2 hilft den Spindelpolkörper (SPB, Spindel Pol Body) in der Nukleus-Membran zu verankern.

Die cytosolische Exposition des Großteils der E3-Ligase Doa10 und ihrer Co-Faktoren ermöglicht dem Doa10 Komplex auch eine Funktion in der cytosolischen Qualitätskontrolle sowie in der prERAD (pre-insertional ERAD) (Gilon et al. 1998;

Gilon et al. 2000; Ravid et al. 2006; Metzger et al. 2008; Ast et al. 2014). C-terminal an ein cytosolisches stabiles Protein fusioniert veranlassen die artifiziellen Degrons CL1 und SL17 die Doa10 vermittelte Ubiquitinierung und Degradation des Proteins (Gilon et al. 2000; Ravid et al. 2006). CL1 und SL17 Degrons sind zwischen 16 und 60 Aminosäuren lange Peptide, die amphipathische Helices mit hydrophoben Oberflächen bzw. stark hydrophobe Sequenzen beinhalten (Gilon et al. 1998; Gilon et al. 2000). Die E3-Ligase Doa10 vermag wie in Deg1 diese hydrophoben Segmente zu erkennen und daraufhin die Degradation des Fusionsproteins einzuleiten (Gilon et al. 2000; Ravid et al. 2006). Vielfach verwendete artifizielle cytosolische Fusionsproteine sind Ura3-CL1 oder β-gal-SL17, die auch als Reporter in Screens ihren Einsatz finden (Gilon et al.

1998; Gilon et al. 2000; Ravid et al. 2006; Metzger et al. 2008). Für eine effiziente Ubiquitinierung und Degradation dieser cytosolischen Fusionsproteine benötigt Doa10 die Hilfe des cytosolischen Hsp70 Chaperons Ssa1 und seines Hsp40 Co-Chaperons Ydj1 (Metzger et al. 2008). Sie erkennen das Doa10 Substrat im Cytosol und geleiten es zum Doa10 E3-Ligasekomplex in der ER-Membran (Metzger et al. 2008). Neben Chaperonen spielt auch der Cdc48-Ufd1-Npl4-Komplex eine Rolle in der Doa10 vermittelten Degradation der cytosolischen CL1/SL17-Fusionsproteine (Metzger et al.

2008). Er könnte nach erfolgter Ubiquitinierung helfen, das Substrat vom Doa10 E3-Ligasekomplex bzw. von der ER-Membran abzutrennen (Metzger et al. 2008). Neueste Forschungsergebnisse schreiben dem ER-membranständigen Doa10 E3-Ligasekomplex auch eine Funktion in der sogenannten cytosolischen prERAD zu (Ast et al. 2014). Die prERAD stellt ein Kontrollsystem innerhalb der SRP (Signal Recognition Particle)-unabhängigen Biosynthese von sekretorischen Proteinen dar. Eine essentielle Komponente dieses Kontrollsystems ist neben dem Doa10 Komplex auch das DUB Ubp1 (Ast et al. 2014). SRP-unabhängige Substrate wie z.B. GPI (Glycosylphospatidylinositol)-verankerte Proteine verweilen vor ihrer Translokation ins ER vorübergehend auf der cytosolischen Seite der ER-Membran (Ast et al. 2013).

Vermögen GPI-verankerte Proteine nicht zeitnah ins ER zu translozieren, vermittelt der Doa10 Komplex ihre proteasomale Degradation; C-terminale hydrophobe Motive dienen dabei als Degrons (Ast et al. 2014).

In der ERAD (Abschnitt 1.2) ist der Doa10 Komplex für die Ubiquitinierung und Degradation von ER-Membranproteinen zuständig, die Läsionen oder Degrons in ihren cytosolisch exponierten Domänen aufweisen (ERAD-C Substrate) (Huyer et al. 2004;

Vashist & Ng 2004; Carvalho et al. 2006; Ravid et al. 2006). ERAD-C Modellsubstrate stellen Mutanten der polytopischen Plasmamembranproteine Ste6 (Sterile) und Pma1 (Plasma membrane ATPase 1) dar. Ste6 besitzt 12 TMs und gehört zur Familie der ABC Transporter (ATP-Binding Cassette). Als solcher vermittelt es in S. cerevisiae den Transport des a-Faktor Pheromons über die Plasmamembran. In der Mutante Ste6*

(Ste6-166) sind die letzten 52 Aminosäuren im cytosolischen C-Terminus aufgrund eines verfrühten Stop-Codons deletiert (Loayza et al. 1998). Das C-terminal trunkierte Ste6* verbleibt im ER und ist dort in speziellen Subkompartimenten des ERs, den ERACs (ER-Associated Compartments), lokalisiert (Huyer et al. 2004). Zusammen mit dem cytosolischen Hsp70 Chaperon Ssa1 und den Hsp40 Co-Chaperonen Ydj1 und Hlj1 ermöglicht der Doa10 E3-Ligasekomplex eine schnelle Degradation des mutierten Proteins (Huyer et al. 2004; Vashist & Ng 2004; Carvalho et al. 2006; Ravid et al.

2006; Nakatsukasa et al. 2008). Die Chaperone sorgen dabei für eine erleichterte Interaktion des Substrates mit der E3-Ligase (Nakatsukasa et al. 2008). Die Trunkierung des cytosolischen C-Terminus in Ste6* führt sehr wahrscheinlich zu einer Fehlfaltung dieser Domäne, welche die Exposition eines amphipathischen oder hydrophob helikalen Segments im C-Terminus von Ste6* begünstigt. Dieses dient der E3-Ligase Doa10 als Degron (Huyer et al. 2004; Vashist & Ng 2004; Carvalho et al.

2006; Ravid et al. 2006). In Abwesenheit von Doa10 und Hrd1 sowie unter Stressbedingungen vermag auch die cytosolische E3-Ligase Ubr1 den Abbau der Mutante Ste6* zu vermitteln (Stolz et al. 2013). Wie Ste6* verwehrt das ER-Qualitätskontrollsystem auch Pma1*, einer Mutante der H⁺-ATPase Pma1, den Weitertransport zur Plasmamembran und führt das in Folge einer Mutation (D378N) fehlgefaltete Protein der ERAD durch die E3-Ligase Doa10 zu (Wang & Chang 2003;

Ravid et al. 2006). Zur Erkennung des Substrates Pma1* (Pma1-D378N) ist Doa10 auf die Mithilfe der ER-membranständigen Proteindisulfidisomerase Eps1 (ER-retained PMA1-suppressing protein 1) angewiesen (Wang & Chang 2003). Zu den aufgeführten ERAD-C Substraten von Doa10 ist noch das peroxisomale Membranprotein Pex29 (Peroxisomal membrane protein 29) hinzuzufügen, das die Anzahl, Größe und Verteilung von Peroxisomen in der Zelle reguliert (Liu et al. 2010).

Der ERAD E3-Ligasekomplex Doa10 hat nicht nur die Degradation von Substraten der ER-Qualitätskontrolle zur Aufgabe, sondern er vollzieht auch die physiologisch regulierte Degradation von ER-membranständigen Proteinen wie Ubc6, Pca1, Erg1, Zrt1, Sbh2 oder hD2 (Swanson et al. 2001; Walter et al. 2001; Ravid et al. 2006; Adle et al. 2009; Foresti et al. 2013; Avci et al. 2014; Habeck et al. 2015). Das polytopische Plasmamembranprotein Pca1 (P-type cation-transporting ATPase 1) gehört der Familie der P1B-Typ ATPasen an und sorgt bei Cadmium-Stress für den Export des Schwermetalls (Adle et al. 2007). In Abwesenheit von Cadmium stellt Pca1 ein kurzlebiges Protein dar, dessen Ubiquitinierung und proteasomale Degradation dem ERAD E3-Ligasekomplex Doa10 obliegt (Adle & Lee 2008; Adle et al. 2009). Als Doa10 spezifisches Degron dient dabei die cytosolisch exponierte Cadmium-sensitive N-terminale Domäne (Aminosäuren 1-392) von Pca1 (Adle & Lee 2008; Adle et al.

2009). Cadmium verhindert durch die Maskierung des Doa10 Degrons die Degradation

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von Pca1 und bewirkt seine erhöhte Expression in der Plasmamembran. Der Hefezelle ist es auf diese Weise möglich, sehr schnell auf Cadmiumstress zu antworten. Die Squalen Monooxygenase Erg1 unterliegt ebenfalls der Signal-induzierten Degradation durch die E3-Ligase Doa10 (Foresti et al. 2013). Das ER-membranständige Protein Erg1 stellt in S. cerevisiae ein Schlüsselenzym des Mevalonatsynthesewegs dar. Die Doa10-abhängige Degradation des Enzyms wird durch das Sterolintermediat Lanosterol reguliert und stimuliert (Foresti et al. 2013). Der Lysinrest K311 im C-terminalen Teil von Erg1 ist als einziger Lysinrest essentiell für die ERAD von Erg1 (Foresti et al.

2013). Das Doa10 spezifische Degron von Erg1 ist bislang unbekannt. Im Rahmen des vor kurzem definierten ERAD-R (ERAD Regulatory) Wegs vermittelt Doa10 in Abwesenheit von Zink zusammen mit der intramembranen Protease Ypf1 (Yeast presenilin fold 1) die Degradation des polytopischen Zinktransporters Zrt1 (Avci et al.

2014). Ein weiteres ER-membranständiges Doa10 Substrat stellt die in S. cerevisiae heterolog exprimierte humane Typ2 Monodejodinase D2 dar (Botero et al. 2002; Ravid et al. 2006). Das N-terminal in der ER-Membran verankerte D2 aktiviert in humanen Zellen das Prohormon Thyroxin (T₄) durch Dejodierung zu Triiodthyronin (T₃). Seine Aktivität und Expression wird in humanen Zellen mitunter durch das Doa10 Ortholog TEB4 kontrolliert (Steinsapir et al. 2000; Zavacki et al. 2009). In der ERAD wurde dem Doa10 E3-Ligasekomplex bislang ausschließlich die Degradation von Substraten mit cytosolisch lokalisierten Degrons (ERAD-C) zugeschrieben. Neueste Forschungsergebnisse jedoch brechen mit diesem Dogma und zeigen, dass der Doa10 Komplex auch die Degradation eines Substrates mit einem intramembranen Degron (ERAD-M) zu vermitteln vermag (Habeck et al. 2015). Das Transmembranprotein Sbh2 (Sec61 β-subunit homolog 2) stellt dieses ERAD-M Substrat des Doa10 Komplexes dar.

Sbh2 ist eine Untereinheit des trimeren Ssh1-Translokonkomplexes (Ssh1; Sbh2; Sss1), der in S. cerevisiae neben dem Sec61 Translokon die co-translationale Translokation von Proteinen vollführt. In Abwesenheit seines Bindungspartners Ssh1 wird nicht-assembliertes Sbh2 effizient durch Doa10 abgebaut (Habeck et al. 2015).