ERAD E3-Ligasekomplexe in S. cerevisiae

Die Ubiquitinierung der meisten ERAD Substrate wird in S. cerevisiae durch die beiden E3-Ligasekomplexe Hrd1/Der3 und Doa10 vermittelt (Abschnitt 1.2.2.1 und Abschnitt 1.2.2.2 und 1.4) (Bays et al. 2001; Deak & Wolf 2001; Swanson et al. 2001). Beide E3-Ligasekomplexe stellen membranständige Multiproteinkomplexe dar, deren Herzstücke RING E3-Ligasen sind. Für die Erkennung, die Ubiquitinierung, den Transport und die Extraktion ihrer Substrate sowie zur eigenen Regulation benötigen Hrd1 und Doa10 ein Repertoire an Co-Faktoren (Abb. 1.5 und Abb. 1.7). Die E3-Ligasen Hrd1 und Doa10 sowie ihre Co-Faktoren sind evolutionär konserviert. Metazoen besitzen Orthologe dieser E3-Ligasekomplexe (Hassink et al. 2005; Schulze et al. 2005; Mueller et al.

2008; Bernasconi et al. 2010; Christianson et al. 2012) und entwickelten zusätzliche ERAD E3-Ligasekomplexe wie z.B. Rma1/Rnf5, Trc8, Rfp2, Rnf170 oder Rnf185 (Claessen et al. 2012; Mayor 2012; Olzmann et al. 2013). Auch in Hefe wird die Existenz von weiteren, noch nicht identifizierten ERAD E3-Ligasekomplexen vermutet (Theesfeld & Hampton 2013). Zudem scheinen in Metazoen und in S. cerevisiae auch E3-Ligasen eine Rolle in der ERAD zu spielen, die primär an anderen Prozessen beteiligt sind (Haynes et al. 2002; Kohlmann et al. 2008; Stolz et al. 2013).

1.2.2.1 Der Hrd1 Komplex

Die E3-Ligase Hrd1 (HMG-CoA reductase degradation 1) oder auch Der3 (Degradation in the ER 3) wurde in den 1990er Jahren in Screens für Mutanten identifiziert, die die HMG-CoA Reduktase nicht mehr abzubauen vermochten (Hampton et al. 1996) bzw. in denen die mutierten Proteine CPY* und PrA* aufgrund einer fehlerhaften Degradation im ER akkumulierten (Hiller et al. 1996; Knop et al.

1996; Bordallo et al. 1998). Zusammen mit einer Anzahl von luminalen und membranständigen Co-Faktoren vermittelt die E3-Ligase Hrd1 die Ubiquitinierung und damit Degradation von löslichen, ER-luminalen fehlgefalteten Proteinen sowie von

1. Einleitung

integralen Membranproteinen mit Läsionen im Transmembranbereich oder im luminalen Bereich (ERAD-L und ERAD-M Substrate) (Hampton 2002; Vashist & Ng 2004; Carvalho et al. 2006; Nakatsukasa et al. 2008).

Das integrale ER-Protein Hrd1 hat sechs Transmembrandomänen und besitzt in seiner C-terminalen cytosolischen Domäne eine hoch konservierte RING-H2 Domäne. Sowohl der N-Terminus als auch der C-Terminus von Hrd1 sind cytosolisch exponiert (Abb.

1.5) (Gardner et al. 2000; Deak & Wolf 2001). In den meisten Fällen vollführt die E3-Ligase Hrd1 die Ubiquitinierung ihrer Substrate zusammen mit dem cytosolischen E2-Enzym Ubc7, für dessen Rekrutierung an die ER-Membran und Aktivierung das membranständige Cue1 (Coupling of ubiquitin conjugation to ER degradation 1) verantwortlich ist (vgl. Abschnitt 1.4.3.2) (Biederer et al. 1997; Bays et al. 2001;

Bazirgan & Hampton 2008; Kostova et al. 2009). Seltener ist anstatt Ubc7 das lösliche E2-Enzym Ubc1 in die Ubiquitinierung von Hrd1 Substraten involviert (Friedlander et al. 2000; Bays et al. 2001).

Abbildung 1.5: Der Hrd1 ERAD E3-Ligasekomplex in S. cerevisiae. Der Hrd1 E3-Ligasekomplex besteht aus der RING E3-Ligase Hrd1 und ihren Co-Faktoren Ubc7, Cue1, Hrd3, Yos9, Kar2, Usa1, Der1 und Ubx2. Eine detaillierte Beschreibung der Komponenten des Hrd1 Komplexes ist im Haupttext zu finden. (Abbildung entnommen aus Zattas & Hochstrasser (2015))

Für die Funktionalität und Stabilität von Hrd1 ist eine stöchiometrische Komplexbildung mit dem transmembranen Glykoprotein Hrd3 (HMG-CoA reductase degradation 3) notwendig (Abb. 1.5) (Plemper et al. 1999; Gardner et al. 2000). In Abwesenheit von Hrd3 ubiquitiniert sich Hrd1 selbst und veranlasst auf diese Weise seinen eigenen Abbau (Plemper et al. 1999; Gardner et al. 2000). Als primärer Substratrezeptor kommt Hrd3 bei der Erkennung von löslichen Substraten eine besondere Bedeutung innerhalb des Hrd1 Komplexes zu (Gauss et al. 2006a; Gauss et al. 2006b; Stanley et al. 2011; Mehnert et al. 2015). Hrd3 interagiert über seine große

N-terminale luminale Domäne mit dem ER-Lektin Yos9 (Yeast OS-9 homolog), das bevorzugt die modifizierte N-Glykan-Struktur von fehlgefalteten luminalen Glykoproteinen erkennt (Buschhorn et al. 2004; Bhamidipati et al. 2005; Szathmary et al. 2005; Carvalho et al. 2006; Denic et al. 2006; Gauss et al. 2006a; Clerc et al. 2009).

Unabhängig von einem Glykan-Degron scheint Yos9 fehlgefaltete luminale Proteine zu erkennen und deren Retention im ER zu bewirken (Izawa et al. 2012). Der Hrd3/Yos9 Heterodimer bildet zusammen mit dem Hsp70 Chaperon Kar2 und seinem Hsp40 Co-Chaperon Sjc1 einen luminalen Subkomplex, der nach Erkennen des Substrates sein Ablösen vom Rezeptor Hrd3 und damit die Übergabe des Substrates an Komponenten des Komplexes vermittelt, welche die Retrotranslokation des Substrates initiieren (Abb.

1.5) (Denic et al. 2006; Mehnert et al. 2015). Eine korrekte Assemblierung des Hrd1 Komplexes gewährleistet mitunter das membranständige Protein Usa1 (U1-Snp1-associating-1) (Carvalho et al. 2006; Horn et al. 2009; Carroll & Hampton 2010). Usa1 interagiert über seine N-terminale cytosolische Domäne mit der RING Domäne von Hrd1 und vermittelt dessen Oligomerisierung, die insbesonders für die Ubiquitinierung und Degradation von membranständigen Substraten essentiell zu sein scheint (Horn et al. 2009; Carroll & Hampton 2010). Über seine C-terminale cytosolische Domäne bindet Usa1 an das Membranprotein Der1 und rekrutiert dieses zum Abbau von löslichen Substraten zu der E3-Ligase Hrd1 (Abb. 1.5) (Carvalho et al. 2006; Horn et al. 2009; Kim et al. 2009). Neben seiner Bedeutung in der Substratdegradation wird Usa1 eine wesentliche Rolle bei der Regulation der E3-Ligase Hrd1 zugeschrieben:

Usa1 und seine N-terminal lokalisierte UBL Domäne ist für die in Abwesenheit von Hrd3 vollzogene Auto-Ubiquitinierung von Hrd1 unverzichtbar (Carroll & Hampton 2010). Der1 (Degradation in the ER 1) ist ein polytopisches ER-Membranprotein mit vier Transmembrandomänen (Knop et al. 1996; Hitt & Wolf 2004). Seine Anwesenheit im Hrd1 Komplex ist für die Degradation von löslichen Substraten essentiell, für den Abbau von membrangebundenen Substraten ist Der1 aber entbehrlich (Knop et al.

1996; Taxis et al. 2003; Hitt & Wolf 2004; Vashist & Ng 2004; Mehnert et al. 2014).

Seine exakte Funktion innerhalb dieses Prozesses ist bislang nicht geklärt, jedoch wird eine Beteiligung von Der1 bei der Retrotranslokation löslicher ER-luminaler Substrate vermutet (Lilley & Ploegh 2004; Ye et al. 2004; Carvalho et al. 2010; Mehnert et al.

2014). Die Stabilität und damit auch die Bindung von Der1 an den Hrd1 Komplex wird über seine N-terminale Acetylierung reguliert (Zattas et al. 2013; Mehnert et al. 2014).

ER-luminale sowie membranständige Hrd1 Substrate werden von der AAA-ATPase Cdc48 zusammen mit ihren Co-Faktoren Npl4 und Ufd1 vom ER extrahiert und zum Proteasom geleitet (Neuber et al. 2005; Schuberth & Buchberger 2005). Das Transmembranprotein Ubx2 (UBX domain-containing protein 2) rekrutiert dabei den Cdc48-Npl4-Ufd1-Komplex zur ER-Membran und somit zum Hrd1 Komplex (Abb.

1.5) (Neuber et al. 2005; Schuberth & Buchberger 2005; Carvalho et al. 2006).

1.2.2.2 Der Doa10 Komplex

Neben Hrd1 kommt der E3-Ligase Doa10 (Degradation of MATalpha2 10) eine zentrale Bedeutung in der ERAD zu (Swanson et al. 2001). Zusammen mit den beiden E2-Enzymen Ubc6 und Ubc7 sowie dem für Ubc7 essentiellen Co-Faktor Cue1

1. Einleitung

vermittelt Doa10 nicht nur die Ubiquitinierung und Degradation von löslichen anomalen Proteinen des Cytosols und des Nukleus, sondern auch den Abbau von Membranproteinen mit Läsionen bzw. Degrons im cytosolischen Bereich (ERAD-C Substrate) (Swanson et al. 2001; Huyer et al. 2004; Carvalho et al. 2006; Ravid et al.

2006). Die E3-Ligase Doa10 wird in Abschnitt 1.4 im Detail beschrieben.