Indirekte Nachweismethoden

2.6.1.1. SFT

Der Sabin-Feldman-Test (SFT) wurde in den späten 1940ern entwickelt (SABIN u. FELDMAN 1948). In der Humanmedizin erlangte dieses Verfahren insbesondere in der Diagnose von T.-gondii-Infektionen bei Schwangeren und Neugeborenen große Bedeutung. Trotz der Notwendigkeit von lebenden Tachyzoiten für dessen Durchführung ist er bis heute der Standardtest geblieben, an dem die Qualität anderer Testverfahren zur Diagnose einer T.-gondii-Infektion gemessen wird (ASHBURN 1992). Im SFT werden IgG1-, IgG3- und IgM-Antikörper gegen T. gondii erfasst (GROSS et al. 2004). Das Testprinzip beruht auf der Tatsache, dass sich vitale T.-gondii-Tachyzoiten mit Methylenblau intensiv blau anfärben lassen, während die Parasiten in Anwesenheit spezifischer Antikörper nahezu ungefärbt bleiben. Als Voraussetzung für diese Änderung der Anfärbbarkeit wird ein humanes Serum als Aktivator (accessory factor) benötigt. Der Aktivator ist nach neueren Untersuchungen mit dem Komplement identisch. Das Testserum wird zunächst hitzeinaktiviert, um körpereigenes Komplement zu zerstören. Anschließend erfolgt nach Zusatz des Aktivatorserums eine Inkubation des Untersuchungsgutes mit lebenden Tachyzoiten bei 37 °C. Sind Antikörper gegen T. gondii im Testserum vorhanden, findet eine komplementvermittelte Zytolyse der Tachyzoiten statt und diese lassen sich durch die anschließend zugesetzte basische Methylenblaulösung nicht mehr anfärben (positive Reaktion). Ist das Testserum frei von spezifischen Antikörpern, findet keine Zytolyse statt und der Farbstoff wird in die Zellen eingeschleust, die dadurch eine tiefblaue Färbung (negative Reaktion) annehmen (BUNDESGESUNDHEITSBLATT 1989).

Der SFT besitzt für die Untersuchung von humanen Seren eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität.

Unspezifische Reaktionen sind bei Humanseren selten. Da mit dem SFT auch sehr niedrige Antikörpertiter erfasst werden, ist der Test sowohl für die Untersuchung von akuten als auch von latenten T.-gondii-Infektionen geeignet. Nachteile des SFTs sind, dass er nicht automatisierbar ist

und dass immer frisch infizierte Versuchstiere als Quelle vitaler Tachyzoiten benötigt werden. Die Durchführung erfolgt daher nur noch in sehr wenigen Speziallaboren. Bei den nicht humanen Primaten wurde der Test in der Vergangenheit häufig genutzt (siehe Kap. 2.5.2.), ist aber in neuerer Zeit durch modernere Methoden wie IFAT, MAT und ELISA abgelöst worden.

2.6.1.2. IFAT

Für den indirekten Immunfluoreszenzantikörpertest (IFAT) werden intakte T.-gondii-Tachyzoiten auf einem festen Träger (z. B. einem Objektträger) fixiert. Anschließend erfolgt eine Überschichtung des fixierten Antigens mit dem Testserum, das in verschiedenen Verdünnungsstufen auf markierten Flächen des Objektträgers aufgetragen wird. Im Serum vorhandene Antikörper gegen T. gondii lagern sich an die Zelloberfläche der Tachyzoiten und werden anschließend mit fluoreszeinmarkierten Sekundärantikörpern (Konjugat) nachgewiesen. Die zweiten Antikörper sind gegen bestimmte Immunglobuline der zu untersuchenden Tierart gerichtet.

Die Auswertung erfolgt unter UV-Licht mit einem Fluoreszenzmikroskop. Als positives Ergebnis wird eine helle, ununterbrochene periphere Fluoreszenz des Parasiten gewertet. Die alleinige Fluoreszenz des apikalen Teils der Tachyzoiten (Polfluoreszenz) wird hingegen als unspezifische Reaktion beurteilt und durch eine Infektion mit anderen kreuzreagierenden apikomplexen Arten verursacht. Die mit dem IFAT messbaren Titer nehmen einen ähnlichen Verlauf wie durch den SFT bestimmte Titer (CARMICHAEL 1975).

Im IFAT ist der Nachweis verschiedener Immunglobulinisotypen durch die Verwendung eines klassenspezifischen Konjugates (z. B. anti-IgG oder anti-IgM) möglich. Dadurch kann der IFAT für eine Bestimmung des Infektionszeitpunktes eingesetzt werden und eignet sich sowohl für den Nachweis von akuten als auch von latenten Infektionen. Die verschiedenen Immunglobulinisotypen werden nach einer Infektion unterschiedlich schnell gebildet und sind verschieden lange im Serum nachweisbar. In einer von ARAUJO et al. (1973) durchgeführten Studie wurden acht Bärenmakaken entweder subcutan oder intravenös mit T.-gondii-Tachyzoiten oder oral mit Gewebezysten infiziert. Bei fünf Tieren wurden im IFAT bereits nach einer Woche IgM-Antikörper

gegen T. gondii ermittelt, nach zwei Wochen wiesen sieben Tiere einen spezifischen IgM-Antikörpertiter auf.

Nachteile des IFATs bestehen in der subjektiven Auswertung des Tests, für die ein geschultes Personal notwendig ist, sowie in der Zeitaufwendigkeit und einer möglichen Kreuzreaktion mit eng verwandten Apicomplexa.

2.6.1.3. Agglutinationstests

Zu den bei nicht humanen Primaten verwendeten Agglutinationstests zählen der direkte Agglutinationstest (DAT), der indirekte Hämagglutinationstest (IHAT) sowie der Latex-Agglutinationstest (LAT).

Der DAT zum Nachweis von T.-gondii-Infektionen wurde erstmals von FULTON u. TURK (1959) beschrieben und durch DESMONTS u. REMINGTON (1980) modifiziert. Das Testprinzip beruht darauf, dass intakte, formalinbehandelte Tachyzoiten in der Gegenwart von spezifischen Antikörpern agglutinieren. Diese Agglutination wird durch den Zusatz von Farbstoffen sichtbar gemacht. Im DAT werden nur IgG-Antikörper gegen T. gondii detektiert, weil spezifische und unspezifische IgM-Antikörper durch den Zusatz von Mercapthoethanol zerstört werden. Bei dem in Mikrotiterplatten durchgeführten Test bildet sich bei Anwesenheit von spezifischen Antikörpern im Testserum durch Bindung der Antikörper an die Tachyzoiten ein Schleier, der den gesamten Boden der Plattenvertiefung bedeckt (positive Reaktion). Enthält das Testserum keine Antikörper gegen T.

gondii, sinken die Tachyzoiten unvernetzt zu Boden und bilden am tiefsten Punkt der Vertiefung einen knopfförmigen Bodensatz (negative Reaktion). Der Test ist einfach durchführbar, besitzt eine hohe Sensitivität und Spezifität und ergibt bei Menschen und Tieren dem SFT vergleichbare Titer (referiert in CARME et al. 2002). Der DAT ist aber kommerziell nur schwer erhältlich.

Der IHAT zum Nachweis von T.-gondii-Infektionen wurde erstmals von JACOBS u. LUNDE (1957) beschrieben. Bei diesem Test wird aus Tachyzoiten gewonnenes lösliches Antigen an Tannin-behandelte Erythrozyten gekoppelt und anschließend mit Glutaraldehyd stabilisiert. Sind in dem Testserum spezifische Antikörper gegen T. gondii enthalten, kommt es zu einer Agglutination

(positive Reaktion). Der Test ist zwar einfach durchzuführen und nicht speziesspezifisch, jedoch auch sehr störanfällig und die Ergebnisse sind schwer reproduzierbar (CARUANA 1980).

Agglutinierende Antikörper treten nach einer Infektion später im Serum auf, als die im SFT nachweisbaren Antikörper. Das Testverfahren ist daher bei frischen Infektionen oft noch negativ (REMINGTON u. DESMONTS 1983). In der veterinärmedizinischen Labordiagnostik werden IHAT-Titer unter 1:128 als unspezifische Reaktionen gewertet (DUBEY et al. 1985b).

Beim LAT wird aus T.-gondii-Tachyzoiten gewonnenes lösliches Antigen an Latex-Partikel gekoppelt. Sind im Testserum Antikörper gegen T. gondii enthalten, kommt es zu einer Agglutination der antigenbeschichteten Partikel. Dieser Test lässt sich einfach und zuverlässig mit dem Serum von Menschen und Tieren durchführen. Es ergeben sich dabei mit dem SFT vergleichbare Titer (BALFOUR et al. 1982). Ein Nachteil des LATs ist, dass durch IgM-Antikörper zu einem geringen Prozentsatz unspezifische (und somit falsch positive) Ergebnisse ausgelöst werden können (HOLLIMAN et al. 1989).

2.6.1.4. KBR

Die Komplementbindungsreaktion (KBR) zum Nachweis von T.-gondii-Infektionen wurde erstmals von WARREN u. SABIN (1942) beschrieben. In der KBR wird eine definierte Menge Komplement mit einer Mischung aus Antigen und Testserum inkubiert. Sind in dem Testserum Antikörper gegen T. gondii enthalten, bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex, an den sich das Komplement bindet. Enthält das Testserum keine spezifischen Antikörper, so bleibt das zugefügte Komplement frei in Lösung und verursacht bei einem dem Testansatz zugefügten Indikatorsystem, das Erythrozyten einer anderen Tierart enthält, eine Lysis der roten Blutkörperchen (negative Reaktion).

Bei Anwesenheit von spezifischen Antikörpern im Testserum bleibt diese Hämolyse aus (positive Reaktion).

Da in der KBR latente Infektionen nicht erfasst werden dient dieser Test in der Humanmedizin nur als ergänzende Methode. So gibt ein positives Ergebnis in der KBR zusammen mit den Ergebnissen aus IFAT oder SFT einen Hinweis auf das Vorliegen einer akuten T.-gondii-Infektion

(BUNDESGESUNDHEITSBLATT 1989). Bei nicht humanen Primaten wurde die KBR entweder allein oder in Kombination mit dem SFT und/oder dem IFAT eingesetzt (siehe Kap. 2.5.2.).Da das Testverfahren sehr aufwendig ist, praktisch keine standardisierten Antigene und Reagentien erhältlich sind und der Test an jede Spezies neu angepasst werden muss, wird die KBR heute kaum noch eingesetzt. Stattdessen erfolgt heute der Nachweis spezifischer IgM-Antikörper (z. B. im IFAT oder ELISA).

2.6.1.5. ELISA

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wurde Anfang der 1970er Jahre entwickelt. In diesem Test können spezifische Antikörper oder Antigene nachgewiesen werden. Zum Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii wird aus Tachyzoiten gewonnenes lösliches Antigen an einen festen Träger, z. B. an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, gebunden und mit dem Testserum überschichtet. Sind spezifische Antikörper gegen T. gondii im Serum vorhanden, binden diese an das Antigen. Die übrigen, ungebundenen Antikörper werden durch nachfolgende Waschschritte entfernt. Der Nachweis der spezifischen Antikörper erfolgt durch die Zugabe eines enzymmarkierten Sekundärantikörpers. Das Konjugat bindet sich an den Antigen-Antikörper-Komplex und das daran gekoppelte Enzym kann ein anschließend hinzugefügtes Substrat umsetzen, wobei eine Farbreaktion stattfindet. Die Enzym-Substrat-Reaktion wird nach einer bestimmten Zeit abgestoppt und das Ergebnis durch eine photometrische Messung quantitativ bestimmt. Dabei wird die Absorption oder die optische Dichte gemessen.

Durch die Verwendung eines klassenspezifischen Konjugates eignet sich der ELISA sowohl für den Nachweis von akuten als auch von latenten T.-gondii-Infektionen. Zudem wird eine quantitative Bestimmung durch die Festlegung von Titern ermöglicht. Gegenüber dem IFAT besitzt er den Vorteil, dass die Erfassung der Ergebnisse objektiv geschieht. Der ELISA lässt sich leicht automatisieren und ist daher für Screening-Untersuchungen mit großen Probenzahlen geeignet.

2.6.1.6. Immunoblot

Für den Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii im Immunoblot erfolgt zunächst mit Hilfe des stark ionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) eine Auftrennung von löslichem Tachyzoiten-Antigen in der Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE). Die aufgetrennten Proteine werden anschließend elektrophoretisch auf eine Trägermembran übertragen und mit dem Testserum inkubiert. Sind spezifische Antikörper im Testserum enthalten, binden diese an die Antigenproteine und werden anschließend mit einem enzymmarkierten Konjugat nachgewiesen. Nachteile dieser Methode sind, dass nur der qualitative Nachweis der Infektion erfolgen kann somit keine Titerbestimmung möglich ist. Zudem ist für die Auswertung ein geschultes Personal notwendig.

In einer von FURUTA et al. (2001) durchgeführten Studie wurde ein Immunoblot für den Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii bei experimentell infizierten Totenkopfaffen benutzt.