ISBN 978-3-86345-229-2
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Jacqueline Notzon Hannover 2014 Jacqueline Notzon
Beeinflussung der Resistenzentwicklung
kommensaler Escherichia coli von
Geflügel durch Wirkstoffkombinationen
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2014
© 2014 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-229-2
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
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Beeinflussung der Resistenzentwicklung kommensaler Escherichia coli von Geflügel durch
Wirkstoffkombinationen
INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
-
Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)vorgelegt von Jacqueline Notzon
Seesen
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. M. Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. S. Schwarz
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2014
Denen, die mich stets unterstützten
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Escherichia coli ... 3
2.2 Bakterielle Resistenz ... 3
2.2.1 Resistenzentstehung ... 4
2.2.2 Resistenzentstehung und Antibiotikaeinsatz ... 6
2.2.2.1 Auswirkung subinhibitorischer Antibiotikakonzentrationen ... 8
2.2.3 Kreuzresistenzen und kollaterale Sensitivität ... 9
2.2.4 Resistenz in Verbindung mit Antibiotikakombinationen ... 11
2.2.5 Resistenzübertragung ... 12
2.3 Resistenzsituation von E. coli bei Geflügel ... 14
2.4 Antibiotikaverbrauch in der Veterinärmedizin in Deutschland ... 16
2.5 Fluorchinolone ... 19
2.5.1 Resistenz gegen Fluorchinolone ... 21
2.6 Aminoglykoside ... 24
2.6.1 Resistenz gegen Aminoglykoside ... 25
2.7 Colistin ... 26
2.7.1 Resistenz gegen Colistin ... 26
2.8 Aminopenicilline ... 26
2.8.1 Resistenz gegen Aminopenicilline ... 27
2.9 Weitere Stoffe mit antibakterieller Wirkung ... 28
2.9.1 Pflanzenextrakte ... 28
2.9.2 Antimikrobielle Peptide ... 31
2.9.3 Nichtsteroidale antiinflammatorische Stoffe ... 32
3 Material und Methoden ... 34
3.1 Material ... 34
3.1.1 Geräte ... 34
3.1.2 Verbrauchsmaterialien ... 34
3.1.3 Nährmedien ... 35
3.1.4 Reagenzien, Chemikalien ... 35
3.1.5 Arzneimittel ... 36
3.1.6 Referenzstämme ... 36
3.2 Methoden ... 37
3.2.1 Versuchsübersicht ... 37
3.2.2 In-vitro-Experiment I ... 38
3.2.3 In-vivo-Experimente ... 42
3.2.3.1 Versuchstiere/ Tierhaltung ... 42
3.2.3.2 Versuchsdurchführung ... 44
3.2.4 In-vitro-Experiment II ... 50
3.2.4.1 In-vitro-Experiment II a ... 53
3.3 Statistische Auswertung ... 53
4 Ergebnisse ... 55
4.1 Ergebnisse der Resistenzinduktion ... 55
4.2 Ergebnisse der Kombination von Enrofloxacin und Neomycin im Vergleich zu einer Enrofloxacin-Monotherapie in vivo ... 57
4.3 Ergebnisse der Kombination von Enrofloxacin und Colistin im Vergleich zu einer Enrofloxacin-Monotherapie in vivo ... 63
4.4 Ergebnisse der Bouillon-Mikrodilution von Stoffen mit antibakterieller Wirkung.. ... 69
4.5 Ergebnisse der Kombination aus Carvacrol und Thymol mit Enrofloxacin ... 72
5 Diskussion ... 73
5.1 Nutzung einer kollateralen Sensitivitätsentwicklung für die Behandlung von resistenten Bakterien ... 75
5.2 Nutzung von Antibiotikakombinationen für die Abtötung von resistenten Bakterien in vivo ... 79
5.3 Auswirkungen einer Antibiotikatherapie auf unbehandelte Tiere ... 88
5.4 Nutzung weiterer antibakteriell wirksamer Stoffe ... 89
5.4.1 Carvacrol und Thymol in Kombination mit Enrofloxacin ... 92
5.5 Schlussfolgerung und Ausblick ... 93
6 Zusammenfassung ... 95
7 Summary ... 97
8 Literaturverzeichnis ... 99
Abkürzungsverzeichnis
4-MU 4-Methylumbelliferon 4-MUG 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid AME Aminoglykosid-modifizierende Enzyme AMP antimikrobielle Peptide Ampi Ampicillin ATP Adenosintriphosphat BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BVL Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit ca. circa cBp clinical Breakpoint CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute Cmax Maximale Plasmakonzentration d.h. das heißt DNA/DNS Desoxyribonukleinsäure/Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli ECOFF epidemiologischer Cut-Off EFSA European Food Safety Authority EMEA European Medicines Agency Enro Enrofloxacin ESBL Extended-spectrum β-lactamase EU Europäische Union EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing g Gramm Gen. Generation GUD β-D-Glucuronidase
Kana Kanamycin KBE Koloniebildende Einheiten kg Kilogramm LPS Lipopolysaccharid Mar Multiply antibiotic-resistant MBC Minimal bakterizide Konzentration MHK/MIC Minimale Hemmkonzentration/Minimum inhibitory concentration MPC Mutant prevention concentration MSW Mutant selection window nm Nanometer NSAID nichtsteroidaler antiinflammatorischer Stoff/
non-steroidal anti-inflammatory drug NRL-AR Nationales Referenzlabor für Antibiotika-Resistenz OIE Office International des Epizooties Omp Outer membrane protein PBS Phosphate buffered saline PFGE Pulsfeld-Gelelektrophorese pH Potentia Hydrogenii pmf Proton motive force QRDR Quinolone resistance-determining region SPF spezifiziert Pathogen frei t Tonnen u.a. unter anderem UV Ultraviolett VCIA Veterinary Critically Important Antimicrobial Agents VetCAb Veterinary Consumption of Antibiotics
VTEC Verotoxin-bildende Escherichia coli
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1 Einleitung
Die Resistenzraten bakterieller tierpathogener und kommensaler Bakterien nehmen seit Jahren kontinuierlich zu (BVL 2012, 2013, 2014a, b, c). Dass der Einsatz von Antibiotika zur Resistenzentwicklung beiträgt, belegen verschiedene Studien (MONIRI u. DASTEHGOLI 2005; MIRANDA et al. 2008; VAN DER HORST et al.
2013; SCHERZ et al. 2014).
Im Geflügelbereich erfolgt oft die Verabreichung von antimikrobiellen Wirkstoffen im Rahmen der Therapie von Infektionen (LANUV-NRW 2012). Aufgrund der hohen Tierzahlen (Durchschnittsgröße von Betrieben, die Masthühner halten in Niedersachsen 47.600 Tiere) werden hohe Mengen von antimikrobiellen Wirkstoffen im Fall einer Erkrankung eingesetzt (NMELVL/ LAVES 2011; VAN RENNINGS et al.
2014). Laut Bericht über den Antibiotikaeinsatz in der landwirtschaftlichen Nutztierhaltung in Niedersachsen vom November 2011, werden in 83% der niedersächsischen Masthühnerbetriebe Antibiotika eingesetzt (NMELVL/ LAVES 2011). Die dabei verwendeten Wirkstoffklassen umfassen u.a. auch Fluorchinolone wie z.B. Enrofloxacin, die in ca. 5 % der Mastdurchgänge Anwendung finden. Der Einsatz von Stoffen aus dieser Antibiotikaklasse ist dabei besonders kritisch zu sehen, da sie eine wichtige Bedeutung bei der Therapie ernsthafter Infektionen bei Mensch und Tier hat. Dabei stuft nicht nur die Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) Fluorchinolone als Veterinary Critically Important Antimicrobial Agents (VCIA) ein (OIE 2014), sondern auch die World Health Organization (WHO) ordnet sie in die höchste Kategorie, nämlich Highest Priority Critically Important Antimicrobials, ein (WHO 2012).
Da Bakterien gegen die derzeit eingesetzten Antibiotika oft Resistenzen aufweisen bzw. unter deren Einsatz eine verminderte Sensitivität gegen diese entsteht, werden verschiedene Möglichkeiten diskutiert, um dieser Entwicklung Einhalt zu gebieten.
Dabei geht es u.a. um die Entwicklung neuer antibakterieller Wirkstoffe, die jedoch seit Jahren nachlässt (PROJAN 2003; BASSETTI et al. 2013). Außerdem wird die Nutzung von Kombinationen derzeit verfügbarer Antibiotika von einigen Autoren vorgeschlagen (DRLICA 2003; LI et al. 2007), zum einen um eine synergistische Wirkung hervorzurufen (CHAIT et al. 2007) und zum anderen aber auch um eine entstehende kollaterale Sensitivitätsentwicklung zu nutzen (IMAMOVIC u. SOMMER
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2013; LAZAR et al. 2013). Schon Fleming stellte 1946 fest, dass es wahrscheinlich kein Chemotherapeutikum gibt, gegen das Bakterien unter bestimmten Umständen keine Resistenz erwerben können (FLEMING 1946).
Eine andere Möglichkeit, um die Entwicklung von resistenten Keimen zu verhindern bzw. die eingesetzten Antibiotikamengen zu reduzieren, besteht darin, Naturstoffe wie z.B. Pflanzenextrakte oder natürlich vorkommende antimikrobielle Peptide für die Bekämpfung bakterieller Infektionen zu nutzen. Die Wirkung dieser Stoffe ist lange bekannt und erfährt durch die derzeitige Resistenzsituation erneute Aufmerksamkeit (STEINER et al. 1981; SHELEF 1984; BEHR 2008). Auch Stoffe, die primär nicht wegen ihrer antimikrobiellen Wirkungen eingesetzt werden, wie NSAID, sind im Gespräch im Zusammenhang mit bakteriell bedingten Erkrankungen genutzt zu werden (YIN et al. 2014).
In dieser Dissertation soll ein Beitrag zu Möglichkeiten der Nutzung von kollateralen Sensitivitäten, Antibiotikakombinationen und weiteren antimikrobiellen Wirkstoffen zur Verminderung oder Vermeidung einer Resistenzentwicklung unter einer Enrofloxacinbehandlung ermittelt werden. Hierzu werden verschiedene Experimente in vitro sowie in vivo an kommensalen E. coli-Isolaten durchgeführt und dabei deren minimale Hemmkonzentration (MHK) ermittelt.
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2 Literaturübersicht 2.1 Escherichia coli
Die Gattung Escherichia coli (E. coli) gehört zur Familie der Enterobacteriaceae. Bei E. coli handelt es sich um gerade gramnegative Stäbchen, deren natürliches Habitat der Darm ist. Ein wichtiges Merkmal ist, wie bei allen gramnegativen Bakterien, die äußere Membran, die aus Lipopolysacchariden (LPS) und Phospholipiden besteht. In Fäzes vom Säuger kommen E. coli in einer Konzentration von bis zu 1010 pro Gramm Kot vor. E. coli-Stämme besitzen nur ein gemeinsames Kerngenom von 30%. Der Rest besteht aus einem flexiblen Genpool (WIELER u. EWERS 2010). Außerdem verfügen E. coli über eine hohe Neigung, Resistenzgene zu verbreiten (WHO 1997).
Kommensale E. coli werden im Rahmen des Monitoring-Programms des Bundesamts für Risikobewertung (BfR) untersucht. Alle Nutztiere, die für die Nahrungsmittelproduktion verwendet werden, sowie Menschen tragen E. coli im Darm. Die Resistenz bei kommensalen E. coli ist ein guter Indikator für die Diversität von Resistenzdeterminanten in der Population. Sie stellen ein potentielles Reservoir von Resistenzgenen dar, die sich horizontal und vertikal in pathogenen oder kommensalen Bakterien derselben oder anderer Gattungen verbreiten können. Über Nahrungsmittel oder Tierkontakt kann eine direkte Übertragung auf den Menschen erfolgen. Da bei jeder Antibiotikaanwendung nicht nur der jeweilig zu behandelnde pathogene Zielkeim der Bakterienpopulation im Darm dem Antibiotikum ausgesetzt ist, sondern auch die Kommensalen, stellen die Resistenzen bei kommensalen Bakterien einen Indikator für den Selektionsdruck dar (EFSA 2008; KAESBOHRER et al. 2012; KAESBOHRER et al. 2013).
2.2 Bakterielle Resistenz
Ein Bakterium gilt dann als klinisch resistent gegenüber einem Wirkstoff, wenn die maximal in einem bestimmten Gewebe erreichbare Konzentration bei normaler Dosierung niedriger liegt als die festgestellte MHK. Eine Behandlung wird daher mit hoher Wahrscheinlichkeit keinen Erfolg bringen (CLSI 2002; KAESBOHRER et al.
2013; EUCAST 2014b).
Als mikrobiologisch sensibel gelten Isolate, die eine MHK haben, die unter dem epidemiologischen Cut-Off-(ECOFF) liegt oder diesem entspricht. Diese Bakterien
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stammen aus der natürlichen, empfindlichen Population, entsprechen also dem Wildtyp. Bakterien, die eine MHK haben, die über dem ECOFF liegt, werden als Nicht-Wildtyp bezeichnet. Diese besitzen eine z.B. durch Mutation entstandene oder erworbene erhöhte Resistenz (EUCAST 2014b) und sind als mikrobiologisch resistent zu bezeichnen. Diese Art der Einstufung ist vor allem für epidemiologische Fragestellungen wichtig (BVL 2010, 2013).
2.2.1 Resistenzentstehung
Es gibt verschiedene Wege, über die Bakterien eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum erwerben können. Es besteht die Möglichkeit einer Mutation von chromosomalen Genen, deren Produkte eine Rolle im physiologischen Zellmetabolismus spielen. Bakterien können die Zielstruktur für Antibiotika durch Single-step- oder Multi-step-Mutationen modifizieren. Dadurch kann das Antibiotikum nicht mehr binden oder angreifen und die Wirkung bleibt aus. Die dritte wichtige Art der Resistenzentstehung besteht in der Aufnahme von Resistenzdeterminanten über mobile genetische Elemente wie Plasmide, Transposons oder Integrons / Genkassetten von Bakterien, die bereits eine Resistenz besitzen (SCHWARZ u.
CHASLUS-DANCLA 2001). Dies kann über horizontalen Gentransfer in Form von Konjugation, Transformation oder Transduktion erfolgen (Abb. 1) (CATRY et al.
2003). Gentransfer erfolgt meist zwischen Bakterien derselben Spezies, er kann aber auch zwischen verschiedenen Bakterienarten wie grampositiven und gramnegativen erfolgen (COURVALIN 1994). Plasmide sind extrachromosomale Elemente, die in der Lage sind, sich eigenständig zu vermehren. Informationen auf einem Plasmid können eine Resistenz gegenüber verschiedenen Stoffen, wie auch Antibiotika, vermitteln. Ein Bakterium kann zudem mehrere Plasmide beherbergen (SCHWARZ u. CHASLUS-DANCLA 2001) und ein Plasmid kann Informationen für Resistenzen gegenüber mehreren Antibiotikaklassen tragen (SUN et al. 2012). Auch Transposons, Genkassetten und Integrons können bei der Teilung vertikal auf Tochterzellen des Bakteriums oder auf andere Bakterien durch Konjugation, Transformation oder Transduktion übertragen werden. Bei der Konjugation werden Plasmide oder Transposons durch engen Kontakt über einen Membrankanal von einem Bakterium auf ein anderes transferiert. Dies stellt den wichtigsten Weg der
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Verbreitung von Resistenzgenen in einer gemischten Bakterienpopulation dar (BENNETT 1995; SCHWARZ u. CHASLUS-DANCLA 2001).
Transformation beschreibt die Aufnahme von freier Desoxyribonukleinsäure (DNS) durch kompetente Bakterien; sie spielt in vivo jedoch nur eine untergeordnete Rolle.
Die Übertragung von DNS durch Bakteriophagen wird als Transduktion bezeichnet.
Bei der Vermehrung von Bakteriophagen in Bakterien kann es dazu kommen, dass die in die Wirtszelle integrierte DNS der Phage nicht exakt aus der chromosomalen DNS des Wirts entfernt wird. Dabei können Resistenzgene, die sich nah neben der Phagen-DNS befinden, mit herausgeschnitten und somit bei der Bindung an andere Bakterien an diese weitergegeben werden. Außerdem können versehentlich auch Plasmide statt DNS bei der Neuformierung von Phagen aufgenommen werden.
Diese können dann wiederum in andere Bakterien appliziert werden. Die Transduktion spielt vor allem bei Bakterien derselben Spezies eine Rolle (BENNETT 1995; SCHWARZ u. CHASLUS-DANCLA 2001).
Abb. 1: Transduktion, Konjugation und Transformation, nach SCHWARZ u. NOBLE (1999)
a) Transduktion
b) Konjugation
c) Transformation
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Die Resistenz beruht auf verschiedene Ursachen. Die drei Hauptmechanismen sind dabei eine enzymatische Inaktivierung durch Anhängen von Acetyl-, Adenyl- oder Phosphorgruppen an das Antibiotikum oder durch Spaltung mittels Enzymen wie β-Laktamasen, Hydrolase und Esterasen, die das Antibiotikum direkt zerstören, eine reduzierte intrazelluläre Akkumulation des Antibiotikums z.B. durch Alterationen von Porinen bei gramnegativen Bakterien, über die das Antibiotikum in das Bakterium gelangt, oder durch einen aktiven energieabhängigen Efflux sowie Schutz, Alteration oder Ersatz der Zielstruktur für das Antibiotikum, so dass es nicht mehr binden und seine antibakterielle Wirksamkeit nicht mehr entfalten kann (SCHWARZ u.
CHASLUS-DANCLA 2001; HARBOTTLE et al. 2006).
2.2.2 Resistenzentstehung und Antibiotikaeinsatz
Grundsätzlich kann jede Anwendung eines Antibiotikums zu einer Resistenzentwicklung führen (WHO 1997; AARESTRUP 1999).
Antibiotikum Entdeckung bzw.
Entwicklung
Einführung in klinischen Gebrauch
Erste Beschreibung einer Resistenzen
Penicillin 1940 1943 1940
Streptomycin 1944 1947 1947, 1956
Tetrazyklin 1948 1952 1956
Erythromycin 1952 1955 1956
Vancomycin 1956 1972 1987
Nalidixin Säure 1960 1962 1966
Gentamicin 1963 1967 1970
Fluorchinolone 1978 1982 1985
Tab. 1: Zeitverlauf zwischen der Entdeckung eines Antibiotikums, der Einführung in den klinischen Gebrauch und dem Auftreten von Resistenzen, modifiziert nach EMEA (1999a)
Tabelle 1 zeigt die Zeitspanne der Entdeckung bzw. Entwicklung eines Antibiotikums bis zur ersten Beschreibung einer Resistenz. Nach Einführung in den klinischen Gebrauch variiert das Intervall bis zur ersten Schilderung einer Resistenz je nach Wirkstoff und beträgt durchschnittlich fünf Jahre (EMEA 1999a).
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Die Gefahr der Selektion von resistenten Bakterien steht in besonderem Fokus bei der Therapie von bakteriellen Infektionen von Nutztieren wie Geflügel, da hier aus Gründen der Praktikabilität oftmals der gesamte Bestand über Trinkwasser oder Futter behandelt werden muss (LÖHREN 2008). Ein nötiger Wirkstoffspiegel wird möglicherweise nicht erreicht, da die Tiere ungenügende Mengen an Wasser bzw.
Futter aufnehmen, das Arzneimittel nicht homogen verteilt ist oder es aus verschiedenen Gründen zu einer Inaktivierung des Antibiotikums kommt (KAMPHUES 1996; KIETZMANN u. BÄUMER 2009).
MONIRI u. DASTEHGOLI (2005) bestätigten mit ihrer Studie die These, dass eine Therapie mit Antibiotika zu einer Resistenzentwicklung führen kann. Bei Untersuchungen von E. coli-Stämmen aus Hühnern mit bzw. ohne Enrofloxacinbehandlung konnten sie feststellen, dass der Gebrauch von Fluorchinolonen resistente Mutanten selektierte. Tiere mit vorheriger Antibiotikaexposition waren häufiger gegenüber dem Fluorchinolon Ciprofloxacin (dem Hauptmetabolit von Enrofloxacin) resistent als Tiere ohne bisherigen Antibiotikakontakt. Ciprofloxacin hat in der Humanmedizin eine große Bedeutung, Resistenzen gegen dieses Fluorchinolon werden deshalb im Rahmen von Monitoring Studien besonders beobachtet (BVL 2014a). Während und auch noch 12 Tage nach einer fünftägigen Therapie mit Enrofloxacin in bestimmungsgemäßer Dosierung bei Hühnern konnten auch MIRANDA et al. (2008) signifikant mehr resistente E. coli nachweisen als bei einer unbehandelten Kontrolle. ASAI et al. (2005) bestätigten diese These, denn sie fanden ebenfalls eine positive Korrelation zwischen dem Einsatz von Antibiotika und der Resistenz von E. coli gegenüber diesen.
Auch SCHERZ et al. (2014) fanden ähnliche Entwicklungen bei einer Behandlung von Hühnern mit Enrofloxacin. Hierbei konnten sie sowohl bei Tieren, die eine bestimmungsgemäße Dosierung (10 mg/kg) erhielten, als auch bei Tieren, die subtherapeutische Dosen zur Simulation einer Verschleppung (0,3 bzw. 1 mg/kg) und erst danach die bestimmungsgemäße Dosierung erhielten, das Auftreten von Resistenzen beobachten. Hochresistente E. coli konnten bei einer Dosierung von Enrofloxacin von 1 mg/kg und anschließender therapeutischer Dosierung nachgewiesen werden. Auch 20 Wochen nach Ende dieser Behandlung, konnte die klinische Resistenz noch detektiert werden.
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Ähnliche Untersuchungen führten auch VAN DER HORST et al. (2013) durch, die Hühner über zwei Tage mit der therapeutischen sowie zwei niedrigeren Dosierungen (75%, 2,5%) von Enrofloxacin behandelten. Die geringeren Dosierungen dienten zur Simulation einer Verschleppung von Antibiotikum bzw. einer inhomogenen Verteilung des Antibiotikums im Futter. Dabei erzeugte die volle Dosis den höchsten Anteil an mikrobiologischen Resistenzen aber auch bei den beiden Behandlungen mit niedrigeren Dosen wurden Resistenzen detektiert. Jedoch verschwanden diese nach Beendigung der kurzen Behandlung.
Im Gegensatz dazu konnten VAN BOVEN et al. (2003) keine Resistenzentwicklung während und nach einer 10-tägigen Behandlung von Hühnern mit Enrofloxacin bei E. coli feststellen. Als resistent galten hierbei Bakterien mit einer MHK >1 µg/ml. Die Anzahl von E. coli-Isolaten im Kot nahm während der Behandlung so weit ab, dass zum Teil keine Bakterien mehr nachweisbar waren. Allerdings wurden bereits zwei Tage nach Therapiebeginn resistente Campylobacter jejuni-Isolate detektiert.
READ et al. (2011) stellten fest, dass die gängige Praxis „hit early and hit hard“ - also eine frühe und aggressive Therapie - nur in äußerst wenigen Fällen wirklich nötig sei.
Diese Art der Therapie war zwar geeignet, um eine De-novo-Resistenzentwicklung, die eher eine kleine Rolle spielt, zu vermeiden. Wenn resistente Bakterien bereits vorhanden sind, haben diese laut READ et al. (2011) jedoch den größtmöglichen Selektionsvorteil.
2.2.2.1 Auswirkung subinhibitorischer Antibiotika- konzentrationen
Nicht nur therapeutische Dosen von Antibiotika können zu Resistenzen führen, sondern auch subinhibitorische Konzentrationen, wie sie z.B. durch Verschleppung von Antibiotika (SCHERZ et al. 2014) oder Rückstände im Tränkesystem (VAN DER HORST et al. 2013) auftreten können.
GULLBERG et al. (2011) konnten anhand von In-vitro-Untersuchungen an E. coli- und Salmonella-Stämmen zeigen, dass bereits sehr niedrige Antibiotikakonzentrationen ausreichen, um resistente Mutanten zu erzeugen. Zum Beispiel lagen diese Konzentrationen im Bereich von 100 pg/ml für Ciprofloxacin und 15 ng/ml im Fall von Tetrazyklin. Sie lagen somit mehrere Hundertfach unter der MHK des empfindlichen Stammes.
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In vitro konnten VAN DER HORST et al. (2011) zeigen, dass zuvor sensible E. coli- Stämme, die niedrigen Konzentrationen (sub-MHK) von Enrofloxacin, Amoxicillin oder Tetrazyklin ausgesetzt waren, eine Resistenz gegen diese entwickelten. Bei den beiden bakteriziden Antibiotika Enrofloxacin und Amoxicillin blieb diese auch nach Ende der Antibiotikaexposition bestehen.
2.2.3 Kreuzresistenzen und „kollaterale Sensitivität“
Bereits 1952 stellten SZYBALSKI u. BRYSON (1952) fest, dass es durch die gezielte Induktion einer Antibiotikaresistenz nicht nur zu einer Resistenzentwicklung gegenüber dem eingesetzten Wirkstoff und gegenüber anderen Antibiotika kommen kann (sogenannte kollaterale Resistenz), sondern auch zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber bestimmten anderen Wirkstoffen im Gegensatz zum Ausgangsstamm (sogenannte kollaterale Sensitivität).
Kreuzresistenzen entstehen unter anderem dadurch, dass derselbe Resistenzmechanismus bei strukturell ähnlichen Antibiotika mit ähnlicher Wirkungsweise zu einer Resistenz führen kann (SHAH 2005). Ein Bakterium, das gegen ein Antibiotikum resistent ist, kann je nach zugrunde liegendem Resistenzmechanismus, wie z.B. Effluxpumpen, die verschiedene Substrate transportieren, auch resistent gegen andere strukturell unterschiedliche Antibiotikaklassen sein (ACAR u. ROSTEL 2001). Außerdem besteht die Möglichkeit, dass Resistenzen gegenüber verschiedenen Stoffen aus unterschiedlichen Antibiotikaklassen auf dem gleichen mobilen genetischen Element lokalisiert sind und so immer zusammen auftreten. Dies nennt man Parallelresistenz (WERCKENTHIN u. SCHWARZ 2003).
Das „Japanische Veterinärmedizinische Antimikrobielle-Resistenz-Monitoring- System“, das seit 1999 besteht, zeigte, dass das Auftreten von Resistenzen bei E. coli mit dem therapeutischen Einsatz von Antibiotika korrelierte. Dabei wurden nicht nur Resistenzen gegenüber dem jeweiligen eingesetzten antimikrobiellen Stoff, sondern auch eine indirekte Selektion von Kreuz- und Coresistenzen beobachtet (HARADA u. ASAI 2010).
Bei der kollateralen Sensitivität vermitteln die genetischen Veränderungen, die zu einer Resistenz gegenüber einem Wirkstoff führten, gleichzeitig eine gesteigerte
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Empfindlichkeit gegenüber anderen Stoffen (HALL et al. 2009). Bereits SANDERSON et al. (1974) konnten anhand von Salmonella Typhimurium Mutanten zeigen, dass diese eine Resistenz gegen bestimmte Antibiotika entwickelten, gleichzeitig jedoch auch sensibler gegenüber anderen Wirkstoffen wurden. Die zu Grunde liegenden Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unerforscht.
IMAMOVIC u. SOMMER (2013) hatten durch die In-vitro-Adaptierung von E. coli- Stämmen an verschiedene Antibiotika eine Steigerung der MHK im Sinne einer Resistenzentwicklung gegenüber diesen erreichen können. Es konnte jedoch nicht nur eine Resistenz gegen das Antibiotikum detektiert werden, dem der Keim ausgesetzt war, sondern auch gegenüber anderen Antibiotika. Außerdem entwickelten die E. coli-Isolate wiederum eine gesteigerte Sensitivität gegenüber anderen Wirkstoffen, die sich in niedrigeren MHK-Werten äußerten. Die beobachtete Anzahl an entstehenden sogenannten kollateralen Resistenzen bzw. Sensitivitäten, hing vom jeweiligen Antibiotikum ab. Während eine Resistenz gegen das Fluorchinolon Ciprofloxacin ausschließlich mit kollateralen Resistenzen gegenüber anderen Antibiotika verbunden war, konnte durch eine Resistenzentwicklung gegenüber dem Aminoglykosid Kanamycin eine kollaterale Sensitivität gegenüber 12 anderen Antibiotika erlangt werden. Die Autoren erklärten diese Entwicklung von kollateralen Sensitivitäten bzw. Resistenzen durch Störungen der Genexpression, die die Angreifbarkeit der Bakterien für chemische Substanzen beeinflusste.
Auch LAZAR et al. (2013) stellten fest, dass die Resistenzsteigerung von E. coli gegenüber einigen Antibiotika mehr kollaterale Sensitivitäten hervorbrachte als bei anderen. Besonders die Gruppe der Aminoglykoside fiel auf, da eine Resistenz gegen diese zu den meisten Sensitivitäten führte. Bei weiteren Untersuchungen dieser aminoglykosidresistenten Mutanten konnte festgestellt werden, dass der für die Aufnahme von Aminoglykosiden wichtige elektrochemische Protonengradient (proton motive force = pmf) der Bakterien vermindert war. Außerdem waren die Ubichinone, die wichtig für die Atmungskette sind, verändert. Letztlich wurde weniger Antibiotikum in die Zelle befördert. Viele andere Antibiotika wurden durch pmf- abhängige Pumpen aus dem Bakterium herausbefördert. War der Gradient in den Mutanten nun verändert, kam es zu einer geringeren Aktivität der pmf-abhängigen Pumpen und somit zu einem stärkeren Influx und Anreicherung der anderen Antibiotika. Das AcrAB-System ist ein membranständiges Zweikomponenten-System,
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das den Efflux von Antibiotika bewerkstelligen kann. Es stellt einen Hauptmechanismus der Multiresistenz bei E. coli dar (OKUSU et al. 1996). Eine Überexpression führte zu einer Resistenz gegenüber vielen Stoffen, jedoch nicht gegenüber Aminoglykosiden. Der elektrochemische Protonengradient war die Treibkraft für dieses Efflux-System. Da bei aminoglykosidresistenten Mutanten dieser Gradient vermindert war, führte eine Überexpression des AcrAB-Efflux-Systems zu einer weniger starken Resistenzentwicklung im Vergleich zum Wildtyp. Daraus schlossen LAZAR et al. (2013), dass eine Mutation, die zu einer Aminoglykosid- Resistenz in Folge der Verminderung des Membranpotenzials führte, die Sensitivität gegenüber anderen Antibiotika durch Beeinträchtigungen des AcrAB-Efflux-Systems steigern könnte. Die Mechanismen, die für die kollateralen Sensitivitätsentwicklungen bei den anderen getesteten Antibiotika verantwortlich waren, konnten auch hier nicht geklärt werden. Es konnte ebenfalls nicht eindeutig bewiesen werden, ob eine Rotationstherapie, also die Verabreichung von verschiedenen Antibiotika nacheinander, oder die gleichzeitige Applikation von zwei Antibiotika eine Resistenzentwicklung vermeiden könnte. Die Behandlung mit einem Antibiotikum könnte zur Entwicklung einer kollateralen Sensitivität gegenüber einem anderen Antibiotikum führen. Der anschließende Wechsel zu diesem Antibiotikum wäre denkbar, so LAZAR et al. (2013). Jedoch müssten weitere Untersuchungen folgen um die Ergebnisse dieser Studie klinisch nutzen zu können.
2.2.4 Resistenz in Verbindung mit Antibiotikakombinationen
Mit den Auswirkungen einer Kombinationstherapie von verschiedenen Antibiotika beschäftigten sich u.a. CHAIT et al. (2007). Sie führten Untersuchungen an einem sensiblen sowie an einem gegen Doxyzyklin resistenten E. coli-Stamm durch und setzten diese beiden Stämme zwei unterschiedlichen Antibiotikakombinationen aus.
Die Doxyzyklinresistenz beruhte auf einer Effluxpumpe für Tetrazykline. Die Kombinationen bestanden zum einen aus Doxyzyklin und Erythromycin, die zusammen synergistisch wirkten, und zum anderen aus Doxyzyklin und Ciprofloxacin, die gemeinsam eine antagonistische Wirkung hatten. CHAIT et al.
(2007) stellten die Hypothese auf, dass es bei antagonistisch wirkenden Antibiotikakombinationen einen Nachteil für das Wachstum eines Bakteriums darstellt, resistent gegen eines der Antibiotika zu sein. Sie konnten diese Hypothese
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beweisen, indem sie den resistenten und den sensiblen Stamm gemeinsam den verschiedenen Kombinationen aussetzten. In bestimmten Konzentrationsbereichen kam es bei der Doxyzyklin-Ciprofloxacin-Kombination zu einer Selektion gegen den doxyzyklinresistenten Stamm. Die Autoren hoben jedoch hervor, dass es sich um ein In-vitro-Experiment handelt und klinische Schlussfolgerungen noch nicht gezogen werden könnten. Außerdem war der hier zugrunde liegende Resistenzmechanismus spezifisch für Tetrazykline und beeinflusste nicht die Wirkung der anderen beiden Kombinationspartner.
PENA-MILLER et al. (2013) konnten in Verbindung mit synergistisch wirkenden Antibiotikakombinationen feststellen, dass es zu einer Abschwächung der synergistischen Wirkung kam und anschließend ein Vermehrung von antibiotikaresistenten Bakterien (bereits nach einem Tag Therapie) stattfand, wenn die resistenten Bakterien nicht bereits in der ersten Behandlungsphase vollständig abgetötet wurden. Diese hatten durch den Selektionsdruck, den das Antibiotikum verursachte, einen klaren Wachstumsvorteil gegenüber den sensiblen Bakterien und konnten sich umso besser vermehren. Analysen zeigten, dass dieser schnellen Resistenzentwicklung genetische Veränderungen zu Grunde lagen. Wenn keine hohen Antibiotikakonzentrationen angewendet und so lange aufrechterhalten wurden, bis das Pathogen abgetötet war, hatten synergistisch wirkende Antibiotikakombinationen einen gegenteiligen Effekt und steigerten das Wachstum von resistenten Keimen sogar noch.
2.2.5 Resistenzübertragung
Verschiedene Studien haben sich mit dem gleichzeitigen Auftreten von Antibiotikaresistenzen bei Tier und Mensch beschäftigt. WITTE (1998) zeigte mögliche Übertragungswege von Resistenzen von Tieren auf Menschen auf. Hierzu zählten unmittelbarer Tierkontakt sowie die Aufnahme von resistenzvermittelnden Genen durch Nahrung tierischen Ursprungs oder durch Ausscheidungen von Tieren, die in Oberflächengewässer gelangten und so von Kulturpflanzen aufgenommen werden konnten. Im Anschluss daran kann es zu einer Kolonisierung mit tierischen Bakterien und dem Transfer von Resistenzinformationen zwischen Bakterien tierischer und menschlicher Herkunft kommen. WAGNER (1999) beschrieb
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außerdem die Möglichkeit einer Resistenzentwicklung aufgrund der Aufnahme von Antibiotikarückständen mit der Nahrung.
Es war jedoch schwer, den Ursprung eines Resistenzgens festzustellen, das sich bereits weitreichend in einer Population verteilt hatte, und so Aussagen darüber zu treffen wer der ursprüngliche Träger eines Resistenzgens war (WITTE 1998).
Eine Übertragung durch direkten Tierkontakt konnte bereits 1976 nachgewiesen werden. LEVY et al. (1976b) stellten bei einem markierten E. coli-Stamm fest, dass dieser unter dem Druck einer antibakteriellen Behandlung (die Tiere wurden mit einem Antibiotika supplementierten Futter gefüttert) sowohl von einem Huhn auf ein anderes sowie auch auf Personen, die engen Kontakt zu den Tieren hatten (wie Landwirte) übertragen werden konnte. Weitere Studien stützen diese Hypothese, LEVY et al. (1976a) und TSCHÄPE (1994) konnten eine Übertragung von Resistenzen bei E. coli von Schweinen auf die Landwirte und deren Familien sowie auf die umliegende Bevölkerung nachweisen. Außerdem konnte die gleiche Resistenzdeterminante in einem pathogenen Keim (Shigella beim Menschen) gefunden werden (LEVY et al. 1976a).
Eine Übertragung von resistenten Keimen durch Aufnahme von Bakterien tierischer Herkunft, wurde von ENDTZ et al. (1991) vermutet, da die Resistenz von Campylobacter-Isolaten gegenüber Fluorchinolonen von Menschen und Hühnern in den Niederlanden, in den Jahren von 1982 bis 1989 stark zugenommen hatte. In den gleichen Jahren fand auch die Markteinführung von verschiedenen Fluorchinolonen statt. Gerade Enrofloxacin wurde im Geflügelbereich bei Infektionen mit E. coli und Mycoplasma spp. eingesetzt. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass dieser massive Gebrauch zu einer Resistenzentwicklung in Hühnern führte, die daraufhin auf Menschen übertragen wurde.
Eine Aufnahme von Bakterien tierischen Ursprungs kann auch über die Luft stattfinden, denn 80% der Staubpartikel in der Stallluft tragen Keime. Diese stammen vor allem von den Tieren und sind überwiegend Staphylokokken sowie Streptokokken aber auch Enterobakterien wie E. coli, die von den Ausscheidungen der Tiere stammen. Je größer die Entfernung zum Tierstall ist, desto weniger Keime können in der Luft nachgewiesen werden (HARTUNG 1995).
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SALEH (2006) konnte bei Untersuchungen von Geflügelhaltungen E. coli in Mengen von 10 - 1.000 KBE/m³ in der Stallluft nachweisen. Vermutlich wurden diese vor allem durch das Scharren der Tiere in der Einstreu in die Luft gewirbelt.
Dass sowohl eine Übertragung von Resistenzdeterminanten von Nutztier auf Mensch als auch von Mensch auf Nutztier stattfinden kann, konnten CHASLUS-DANCLA et al. (2000) zeigen. Auch beobachteten sie einen Austausch von plasmidvermittelten Resistenzen von einer Bakteriengattung zu einer anderen.
Bei Untersuchungen in den Niederlanden konnte gezeigt werden, dass Truthähne sowie Broiler und deren Halter deutlich mehr gegen Ciprofloxacin resistente kommensale E. coli aufwiesen als Schweine und deren Halter. Dies wurde u.a. durch den Einsatz von Enrofloxacin bei Geflügel erklärt. Bei Schweinen hingegen war der Gebrauch von Enrofloxacin in den Niederlanden eher unüblich. Bei der Genotypisierung mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) konnte gezeigt werden, dass es sich bei den E. coli-Stämmen vom Geflügel und deren Haltern um die gleichen Stämme handelte, was die Theorie der Übertragung von Resistenzen von Tieren auf Menschen durch unmittelbaren Kontakt und die Aufnahme von resistenten Bakterien bekräftigte (VAN DEN BOGAARD et al. 2001).
2.3 Resistenzsituation von E. coli bei Geflügel
In Deutschland erfolgt die Erfassung von bakteriellen Resistenzen bei Keimen von Tieren auf unterschiedlichen Ebenen. Das Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) führt das Resistenz-Monitoring sowie die Untersuchung für Tierpathogene (GERM-Vet) durch. Das BfR führt seit 2009 das Monitoring und die Untersuchung der Resistenz bei Zoonoseerregern wie Salmonella spp., Campylobacter spp., Listeria monocytogenes, Verotoxin-bildenden E. coli (VTEC), Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus sowie kommensalen E. coli durch.
Hierfür nimmt das BfR die Aufgaben des Nationalen Referenzlabors für Antibiotika- Resistenz (NRL - AR) wahr. Die stichprobenartige Probenentnahme für die weitergehenden Untersuchungen im BfR erfolgt dabei entlang der Lebensmittelkette im Rahmen der amtlichen Lebensmittel- und Veterinärüberwachung der Länder. Die Proben für die Untersuchungen im BVL stammen von klinisch erkrankten, nicht antibiotisch vorbehandelten Tieren und werden durch staatliche und private Labore sowie universitäre Einrichtungen eingesandt (BVL 2010, 2013, 2014b).
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Grundsätzlich liegen die Resistenzraten bei Jung- bzw. Legehennen unabhängig vom antibakteriellen Wirkstoff niedriger als bei Mastgeflügel. Beispielsweise war 2010 laut GERM-Vet-Studie 1% der untersuchten E. coli-Isolaten von Jung- bzw.
Legehennen resistent gegen Enrofloxacin (BVL 2014b), während 10% der E. coli von Masthahnküken bzw. Masthähnen mit verschiedenen Erkrankungen (z.B. Septikämie oder Dottersackentzündung) eine Resistenz gegen Enrofloxacin aufwiesen (BVL 2014b). Auch bei der Untersuchung von kommensalen E. coli zeigte sich ein ähnliches Bild. Hier waren laut Zoonosen-Monitoring Bericht 2011 5% der Isolate von Legehennen resistent gegen Nalidixinsäure und 70% der Isolate sensibel gegen alle getesteten Antibiotikaklassen (BVL 2013). Bei Masthähnen hingegen waren im gleichen Jahr 44% der untersuchten E. colis resistent gegen Nalidixinsäure und nur 9% der Isolate sensibel gegen alle getesteten Antibiotikaklassen (BVL 2013).
Nalidixinsäure dient als Indikator, um eine entstehende Resistenz gegenüber Fluorchinolonen aufzudecken (BVL 2014b).
Wichtig ist außerdem zu beachten, dass in den verschiedenen Publikationen ein unterschiedliches Maß zur Einstufung der Erreger genutzt wird. In der GERM-Vet- Studie (BVL 2012, 2014b) werden Keime als resistent eingestuft, wenn ihre MHK über dem klinischen Grenzwert (cBp) liegt, da die Prognose über den Erfolg einer möglichen antibakteriellen Therapie im Fokus steht (BYWATER et al. 2006). Die Grenzwerte werden den jeweils aktuellen CLSI Dokumenten entnommen. Im Gegensatz dazu werden im Zoonosen-Monitoring Bericht Isolate als resistent eingestuft, wenn ihre MHK über dem epidemiologischen ECOFF gemäß European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) liegt, da epidemiologische Betrachtungen im Mittelpunkt stehen (Kapitel 2.2). Diese Art der Bewertung ermöglicht es, eine Veränderung der bakteriellen Empfindlichkeit rasch zu erkennen. Aussagen zur Therapierbarkeit einer durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankung können hieraus jedoch nicht abgeleitet werden (BVL 2010, 2013, 2014a).
Auch in anderen Ländern wie (z.B. Australien) konnten resistente E. coli auf Lebensmitteln tierischen Ursprungs nachgewiesen werden. INGRAM et al. (2013) detektierten bei 30% der Geflügelproben aus dem Einzelhandel in Australien ciprofloxacinresistente E. coli, obwohl in Australien niemals Fluorchinolone im Nutztierbereich eingesetzt wurden. Ciprofloxacin wurde nur in der Humanmedizin eingesetzt und ist der Hauptmetabolit von Enrofloxacin. Außerdem waren die Isolate
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zusätzlich resistent gegenüber Amoxicillin, Gentamicin, Tetrazyklin und Trimethoprim-Sulfonamid. Diese Antibiotika wiederum wurden im Geflügelbereich eingesetzt. Wahrscheinlich spielte hier die Übertragung von Resistenzmechanismen auf Tochterzellen bzw. die Übertragung von Plasmiden auf andere Bakterien, die die Wirkung mehrerer Antibiotikaklassen beeinflussen können (wie z.B. die AcrAB- Effluxpumpe), eine Rolle.
2.4 Antibiotikaverbrauch in der Veterinärmedizin in Deutschland
Im Rahmen des Projektes VetCAb soll eine Erfassung des Antibiotikaeinsatzes in der Nutztierhaltung erfolgen. Im Rahmen dieses Projekts wurden zunächst Machbarkeitsstudien durchgeführt, um ein Konzept für das weitere Vorgehen zu erstellen. HEGGER-GRAVENHORST (2012) wertete hierfür die vom Tierarzt auszufüllenden Anwendungs- und Abgabebelege von 24 Tierarztpraxen aus fünf verschiedenen Landkreisen in Niedersachsen über ein Jahr (1. September 2006 bis 31. August 2007) aus. Hierbei konnte sie feststellen, dass beim Geflügel 37 % (1224,5 kg) der abgegeben bzw. angewendeten Antibiotika zur Gruppe der Polypeptide (hierzu gehörte in dieser Untersuchung ausschließlich Colistin), 32 % (1060,1 kg) β-Laktam-Antibiotika, 16 % (523,72 kg) Tetrazykline, sowie 1 % (37,9 kg) Fluorchinolone gehörten. Da diese Daten keine repräsentativen Aussagen für ganz Deutschland zuließen, wurde die Pilotstudie VetCAb-Pilot durchgeführt. Dabei wurden deutschlandweit Anwendungs- und Abgabebelege für das Kalenderjahr 2011 ausgewertet.
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Abb. 2: Verbrauchsmengen und Einzelabgaben eingesetzter Wirkstoffgruppen beim Broiler im Jahr 2011 nach VAN RENNINGS et al. (2014)
Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 graphisch abgebildet. Zum einen sind Einzelabgaben dargestellt, wobei eine Einzelabgabe als Anwendung eines Wirkstoffes pro Tier und Tag definiert ist, und zum anderen die Verbrauchsmengen von Antibiotika beim Broiler im Jahr 2011. Mengenmäßig betrachtet wurden auch hier am häufigsten Polypeptide (1632 kg), gefolgt von β-Laktam-Antibiotika (962 kg) eingesetzt. An dritter Stelle stehen hier Makrolide (774 kg). Gemessen an den Einzelabgaben wurden ebenfalls am häufigsten Polypeptide und β-Laktame eingesetzt, gefolgt von Trimethoprim-Sulfonamid-Präparaten (potenzierte Sulfonamide) (VAN RENNINGS et al. 2014).
Eine andere Art der Datenerfassung bezüglich Antibiotikaabgabemengen erfolgt seit 2011 über pharmazeutische Unternehmen und Großhändler, die seither verpflichtet sind die Abgabemengen von antimikrobiell wirksamen Stoffen an Tierärzte zu melden. Die Auswertung dieser Daten erfolgt im BVL.
Tabelle 2 gibt die abgegebenen Mengen für die Jahre 2011 bis 2013 wieder.
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Wirkstoffklasse Abgegebene Menge
(t) 2011
Abgegebene Menge (t) 2012
Abgegebene Menge (t) 2013
Tetracycline 564 566 454
Penicilline 527,5 498 473
Sulfonamide 185 162 152
Makrolide 173 145 126
Polypeptid-Antibiotika 127 124 125
Aminoglykoside 47 40 35
Trimethoprim 30 26 24
Pleuromutiline 14 18 15
Lincosamide 17 15 17
Fluorchinolone 8 10 12
Fenicole 6 6 5
Cephalosporine, 1.+2. Gen. 2 5 2 (nur 1. Gen.)
Cephalosporine, 3. Gen. 2 2,5 2,5
Cephalosporine, 4. Gen. 1,5 1,5 1,5
Fusidinsäure <1 <1 <1
Nitrofurane <1 <1 <1
Nitroimidazole <1 <1 <1
Summe 1706 1619 1452
Tab. 2: Antibiotikaabgabemengen in Deutschland 2011 bis 2013 nach WALLMANN et al. ( 2014a, b)
Hierbei ist keine eindeutige Zuordnung zu einzelnen Tierarten möglich, da viele Stoffe für mehr als eine Tierart zugelassen sind. Jedoch lässt sich ableiten, dass es 2012 1611 t Präparate waren, die für lebensmittelliefernde Tiere zugelassen sind.
Insgesamt ist es zu einer Reduktion der Abgabemenge um 254 Tonnen von 2011 bis 2013 gekommen. Negativ ist jedoch zu vermerken, dass die Abgabemenge von Fluorchinolonen sowie Cephalosporinen der 3. Generation, die wichtig für die Therapie beim Menschen sind, zugenommen hat (WALLMANN et al. 2014a, b).
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Laut TOUTAIN u. BOUSQUET-MELOU (2013) trägt auch die Anzahl der sich auf dem Markt befindlichen Generika von Antibiotika zu einer gesteigerten Verbrauchsmenge dieser Stoffe und somit zur Resistenzentwicklung bei. Durch die steigende Anzahl an Generika werden außerdem weniger Anstrengungen in die Forschung für neue antimikrobielle Stoffe unternommen, was die Resistenzentwicklung z.B. durch Nutzung veralteter Dosierungsschemata negativ beeinflussen kann.
2.5 Fluorchinolone
Fluorchinolone sind Antibiotika mit einem weiten Wirkspektrum (grampositiv, gramnegativ, Mykoplasmen, Anaerobier) und einer guten Bioverfügbarkeit. Sie erreichen rasch wirksame Serumkonzentrationen und haben ein großes Verteilungsvolumen (SCHEER 1987b; RIVIERE u. PAPICH 2013c). Chinolone wurden in den frühen 1960er Jahren entwickelt. Das erste Chinolon war Nalidixinsäure (LESHER et al. 1962). Das erste ausschließlich für die Veterinärmedizin entwickelte und dort eingesetzte Fluorchinolon war schließlich Enrofloxacin (SCHEER 1987a).
Das Grundgerüst der Fluorchinolone ist der Chinolinring mit einem Fluor- Substituenten an Position 6 und einer Carboxylgruppe an Position 3, sowie an Position 4 ein Keton. Es gibt zahlreiche Substituenten, die u.a. die Lipophilie, das Verteilungsvolumen und die Elimination, nicht jedoch das Spektrum der antimikrobiellen Wirkung deutlich verändern. So trägt das Vorhandensein von mehr als einem Fluor-Substituenten nicht zu einer verbesserten antibakteriellen Wirkung bei (ASUQUO u. PIDDOCK 1993).
Fluorchinolone gehören zur Gruppe der konzentrationsabhängig wirksamen Antibiotika, d.h. ihre bakterizide Wirkung nimmt mit steigender Konzentration zu (ANDERSSON u. MACGOWAN 2003). Außerdem haben sie einen postantibiotischen Effekt. Das bedeutet, dass die bakterizide Wirkung nach Ende der Antibiotikaexposition und Unterschreitung der MHK im Zielgewebe noch eine gewisse Zeit andauert, bevor das bakterielle Wachstum wieder beginnt (FILOCAMO et al. 2011). Der Grund dafür ist wahrscheinlich der intrazelluläre Wirkungsort bzw.
die Akkumulation von Fluorchinolonen im Bakterium, was zu einer verstärkten Schädigung führt (STRATTON 1996).
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Die bakterizide Wirkung der Fluorchinolone liegt in einer Hemmung der bakteriellen DNA-Replikation und -Translation begründet. Die bakterielle DNA Gyrase, die zu den bakteriellen Topoisomerasen Typ II gehört, besteht aus zwei A- und zwei B- Untereinheiten. Diese Gyrase bewirkt einen Doppelstrangbruch von ringförmig geschlossener DNA und verbindet diese anschließend wieder, wozu Adenosintriphosphat (ATP) nötig ist. Dadurch kommt es zu einer negativen Überspiralisierung (Supercoiling) der bakteriellen DNA-Doppelhelix. Durch das Aufdrehen der DNA wird die räumliche Struktur der bakteriellen DNA dichter. Dies ist für den Beginn der DNA-Replikation nötig und ermöglicht die Bindung von Initiatorproteinen. Die Aufgaben der Gyrase umfassen also die Aufrechterhaltung einer gewissen Überspiralisierung der DNA, aber sie unterstützt auch die Fortbewegung von Transkriptions- und Replikationskomplexen, sie kann DNA Verknüpfungen lösen und ist wichtig für die Faltung der DNA. Außerdem ist sie in der Lage, doppelsträngige ringförmige DNA miteinander zu verbinden und wieder voneinander zu lösen. Die Untereinheiten der DNA Gyrase werden von den Genen gyrA und gyrB kodiert. Meist binden Chinolone an gyrA und hemmen somit den Wiederverschluss der DNA nach erfolgtem Doppelstrangbruch (GELLERT et al.
1976; REECE u. MAXWELL 1991; DRLICA u. ZHAO 1997).
Ein weiterer Wirkungsort der Fluorchinolone ist die Topoisomerase IV der Bakterien mit ihren beiden Untereinheiten parC und parE (KATO et al. 1990). Diese spielt vor allem bei grampositiven Bakterien eine Rolle und ist im Gegensatz zur Gyrase während der Zellteilung wichtig für das Lösen der beiden Tochterchromosomen voneinander und für die Aufteilung der DNA in die Tochterzellen (FERRERO et al.
1995).
Das Fluorchinolon Enrofloxacin wird teilweise zu Ciprofloxacin deethyliert (KUNG et al. 1993). Die Ausscheidung erfolgt primär über die Nieren (SCHEER 1987b;
BREGANTE et al. 1999).
Da Flurochinolone bakterizid wirken, sollten sie, um z.B. das Wirkspektrum zu erweitern oder eine additive Wirkung hervorzurufen, nicht mit einem bakteriostatischen Antibiotikum kombiniert werden, da die Hemmung des Wachstums durch bakteriostatische Antibiotika die Wirkung von bakterizid wirkenden Antibiotika blockiert (UNGEMACH 1999).
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Derzeit sind zwei verschiedene Fluorchinolone (Difloxacin, Enrofloxacin) für die orale Anwendung bei Geflügel zugelassen (VETIDATA 2014).
2.5.1 Resistenz gegen Fluorchinolone
Der Hauptmechanismus der Resistenz gegenüber Fluorchinolonen besteht in der Veränderung sowie dem Schutz der Zielstruktur für das Antibiotikum, wodurch dessen Bindung vermindert wird. Veränderungen der Zielstruktur entstehen durch Mutationen in den Genen, die für die Untereinheiten der Gyrase, zumeist gyrA oder in den Genen, die für die Untereinheiten der Topoisomerase IV, meistens parC, kodieren. Mutationen der Gyrase spielen vor allem bei gramnegativen Bakterien, Mutationen der Topoisomerase IV vor allem bei grampositiven Bakterien eine Rolle bezüglich einer Resistenzentstehung. Bei Untersuchungen an fluorchinolonresistenten E. coli wurden einzelne Austausche von Aminosäuren an den Positionen 67 bis 106 der Untereinheit A festgestellt. Diese wird auch als Quinolon-resistance-determining-region (QRDR) bezeichnet. In E. coli wurde vor allem der Austausch der Aminosäure Serin an Position 83 zu Leucin oder Tryptophan und an Position 87 von Asparaginsäure zu Asparagin gefunden (ORAM u. FISHER 1991).
Außerdem führen Mutationen an Position 426 (Austausch von Asparaginsäure gegen Asparagin) und 447 (Austausch von Lysin gegen Glutaminsäure) der GyrB zu Veränderungen der Empfindlichkeit gegenüber Fluorchinolonen, die jedoch weniger starke Resistenzen hervorrufen als Mutationen in GyrA (YOSHIDA et al. 1991).
Es ist fraglich, ob einzelne Mutationen am Wirkungsort von Fluorchinolonen ausreichen, um hochresistente Bakterien zu erzeugen, denn hierfür sind mehrere Mutationen in gyrA oder eine zusätzliche Mutation in parC nötig (HEISIG u.
TSCHORNY 1994). EVERETT et al. (1996) führten Untersuchungen an E. coli- Isolaten mit unterschiedlichen Antibiotikaempfindlichkeiten durch und konnten dabei feststellen, dass hochresistente Isolate Mutationen in Bereichen aufwiesen, denen mehrere unterschiedliche Resistenzmechanismen zu Grunde lagen. Einfache Mutationen der bakteriellen Topoisomerasen, dazu gehören die DNA Gyrase und die Topoisomerase IV, reichen bei E. coli nicht aus, um klinische Resistenzen zu erreichen. Dafür ist das zusätzliche Vorhandensein von anderen Mutationen, wie in der AcrAB-Effluxpumpe nötig (OETHINGER et al. 2000).
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Auch die von DRLICA (2003) beschriebene Mutant selection window (MSW)- Hypothese beschäftigt sich mit den unterschiedlichen Mutationen von E. coli in Verbindung mit Fluorchinolonresistenzen. Demnach gibt es einen Konzentrationsbereich von Fluorchinolonen, in dem die selektive Anreicherung von Mutanten mit einer Mutation (Ein-Schritt-Mutanten) z.B. in gyrA zum Nachteil vom empfindlichen Wildtyp stattfindet, da die Mutanten im Gegensatz zum Wildtyp trotz Antibiotikum wachsen können. Diesen Bereich nennt man Mutant selection window.
Er wird von der sogenannten Mutant prevention concentration (MPC), d.h. die Konzentration, die das Wachstum der Mutanten mit einer Mutation verhindert, und der MHK des Wildtyps gebildet. Die MPC entspricht also der MHK der Ein-Schritt- Mutanten. Um oberhalb der MPC wachsen zu können, sind mindestens zwei Mutationen im Bakterium erforderlich z.B. zusätzliche Mutationen in gyrA und parC.
Die untere Grenze des MSW wird von der MHK des Wildtyps gebildet, d.h. die Konzentration, die das Wachstum der meisten sensiblen Bakterien verhindert. Dieser Konzentrationsbereich ist für jede Antibiotika-Bakterium-Kombination individuell. Um die Anreicherung von Ein-Schritt-Mutanten zu verringern, muss die Antibiotikakonzentration hoch genug sein, um den Bereich des MSW zu überwinden.
Liegt die Konzentration oberhalb der MPC, entwickeln sich Resistenzen nur selten (Abb. 3) (ZHAO u. DRLICA 2001; DRLICA 2003). Ist es nicht möglich derart hohe Konzentrationen im betroffenen Gewebe zu erreichen, z.B. wegen dem verstärkten Auftreten von unerwünschten Wirkungen bei steigender Antibiotikakonzentration oder Rückständen im Lebensmittel, sollte laut DRLICA (2003) eine Kombination von mehreren Antibiotika in Betracht gezogen werden.
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Abb. 3: Zusammenhang zwischen Mutant selection window (MSW), Mutant prevention concentration (MPC) und Minimum inhibitory concentration (MIC), modifiziert nach DRLICA (2003)
Auch LI et al. (2007) beschäftigten sich mit der MPC bei Enrofloxacin von E. coli- Isolaten aus dem Huhn und konnten zeigen, dass Isolate, die über eine einfache Mutation in gyrA verfügten, eine niedrigere MPC (0,5 - 16µg/ml) aufwiesen als Bakterien mit doppelten Mutationen in gyrA und einer Einfachmutation in parC mit einer hohen MPC (> 32 µg/ml). LI et al. (2007) kamen zu dem Schluss, dass für die letztgenannten Bakterien eine Kombinationstherapie in Betracht gezogen werden müsse, da die MPC die maximal erreichbare Plasmakonzentration von Enrofloxacin überstieg.
Da der Wirkungsort von Fluorchinolonen im Zytoplasma liegt, müssen diese zunächst die Zellwand und Zytoplasmamembran und bei E. coli als gramnegativer Keim auch die äußere Membran überwinden. Ein weiterer Resistenzmechanismus besteht in einer erhöhten Aktivität oder vermehrten Produktion membranständiger Effluxpumpen, die das Antibiotikum wieder aus dem Bakterieninneren befördern, so dass es seine Wirkung nicht mehr entfalten kann. Die wichtigste Effluxpumpe bei E. coli stellt die AcrAB-Membran-Effluxpumpe dar. Mutationen in acrR (Repressor von acrAB) führen zu einer erhöhten Aktivität dieser Pumpe (WANG et al. 2001).
Im Gegensatz zu anderen Antibiotika-Efflux-Systemen, besitzt diese Multidrug- Effluxpumpe ein sehr breites Substratspektrum und transportiert strukturell sehr unterschiedliche Antibiotika. Diese Veränderung der Effluxpumpe allein führen
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jedoch nur zu schwachen Veränderungen der bakteriellen Empfindlichkeit (HOOPER 1999; POOLE 2000).
Auch Veränderungen der Porine von Bakterien stehen mit einer Antibiotikaresistenz in Verbindung. In E. coli-Mutanten mit multiplen Resistenzen (multiply antibiotic- resistant = Mar-Mutanten) findet man Mutationen im marRAB-Regulon. Als Folge kommt es zur Hemmung von MarR (Repressor von MarA), wodurch vermehrt MarA exprimiert wird. MarA wiederum führt u.a. zu einer verstärkten Expression von u.a.
AcrAB und micF, was schließlich zu der oben beschriebenen erhöhten Aktivität der AcrAB-Effluxpumpe und einer verminderten Produktion von OmpF führt. OmpF stellt ein wichtiges Porin bei E. coli dar. Wird es weniger stark exprimiert, kommt es zu einer langsameren Diffusion von Fluorchinolonen in das Bakterium (ANDERSEN et al. 1987; COHEN et al. 1988; ARIZA et al. 1994; ALEKSHUN u. LEVY 1997).
Außerdem können Resistenzen gegen Chinolone plasmidvermittelt sein. Dafür kommen verschiedene bisher beschriebene plasmidlokalisierte Gene wie qnr (MARTINEZ-MARTINEZ et al. 1998), aac (eine Genvariante, die für die Aminoglykosid-Acetyltransferase kodiert und z.B. Ciprofloxacin inaktivieren kann) (ROBICSEK et al. 2006) sowie qepA (kodiert für eine Effluxpumpe) (YAMANE et al.
2008) in Frage. Qnr hemmt die Bindung von Fluorchinolonen an die bakterielle Gyrase und Topoisomerase IV. Außerdem hemmt es die durch Fluorchinolone verursachte Hemmung der negativen Überspiralisierung (Supercoiling) der bakteriellen DNA, so dass diese wieder ungestört stattfinden kann (TRAN u.
JACOBY 2002; TRAN et al. 2005). Durch die Übertragung eines Plasmids, das ein qnr-Gen trägt, können Multiresistenzen entstehen, da Plasmide, die qnr-Gene tragen, oft auch Resistenzengene gegen Aminoglykoside, β-Laktame, Chloramphenicol und Sulfonamide beherbergen (NORDMANN u. POIREL 2005).
2.6 Aminoglykoside
Aminoglykoside sind aus Aminozuckern aufgebaut, an die glykosidisch Hydroxylgruppen von Amino- oder Guanin-substituierten Cyclohexanen gebunden sind (COOPER et al. 1980). Die Anzahl an freien Aminogruppen ist verbunden mit der Nephrotoxizität der Aminoglykoside. Je polarer ein Aminoglykosid ist, z.B.
Neomycin mit sechs freien Aminogruppen, desto größer ist seine Toxizität (HUMES et al. 1982). Die bakterizide Wirkung der Aminoglykoside beruht auf einer
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irreversiblen Bindung an mehrere Rezeptorproteine der 30S-Untereinheit bakterieller Ribosomen (CARTER et al. 2000). Es kommt zur Entstehung von „Nonsense“- Proteinen. Über Porine von gramnegativen Bakterien diffundieren die positiv geladenen Aminoglykoside durch die äußere Membran. Im periplasmatischen Raum angelangt, transportiert ein sauerstoffabhängiger Transportprozess das Antibiotikum in das Bakterium, wo es dann an den Ribosomen binden kann (MINGEOT- LECLERCQ et al. 1999). Wie Fluorchinolone sind auch Aminoglykoside konzentrationsabhängig wirkende Antibiotika, die einen postantibiotischen Effekt auslösen können. Sie werden bei Infektionen mit aeroben gramnegativen Bakterien eingesetzt. Nach oraler Gabe werden sie nicht aus dem Magendarmtrakt resorbiert.
Die Ausscheidung erfolgt bei parenteraler Aufnahme in unmetabolisierter Form über die Niere (RIVIERE u. PAPICH 2013a).
Für Geflügel sind derzeit verschiedene Aminoglykoside (Neomycin sowie Spectinomycin in Kombination mit dem Lincosamid Lincomycin) für die orale Anwendung zugelassen (VETIDATA 2014).
2.6.1 Resistenz gegen Aminoglykoside
Resistenzen gegenüber Aminoglykosiden beruhen entweder auf Veränderungen der Zielstruktur (SIGMUND et al. 1984), auf einer verminderten Permeabilität bzw. einem vermehrten Efflux des Antibiotikums (ROSENBERG et al. 2000) oder auf einer enzymatischen Inaktivierung durch Aminoglykosid-modifizierende-Enzyme (AME) (RICE et al. 2003). Letztgenannte können durch Plasmide weitergegeben werden, die noch weitere Resistenzen tragen können (SUN et al. 2012). Durch Veränderungen des ribosomalen Wirkungsorts des Antibiotikums entstehen Bakterien mit geringen Veränderungen der antibakteriellen Empfindlichkeit (SIGMUND et al. 1984).
Wie unter Kapitel 2.6 beschrieben, gelangen Aminoglykoside über Porine von gramnegativen Bakterien durch die äußere Membran. Durch Veränderungen dieser Porine kann es zu einer verminderten Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber Aminoglykosiden kommen, obwohl dies zumindest bei E. coli nicht zu starken Veränderungen der bakteriellen Empfindlichkeit führt (RICE et al. 2003).
Das Antibiotikum kann durch Phosphotransferasen, Adenyltransferasen oder Acetyltransferasen verändert werden, so dass es nicht mehr so gut am Wirkungsort
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binden kann. Dies stellt den wichtigsten Mechanismus der Aminoglykosid-Resistenz dar (SAWAI et al. 1982; SHAW et al. 1993).
2.7 Colistin
Colistin gehört zur Gruppe der Polypeptidantibiotika. Es wird auch als Polymyxin E bezeichnet und ist ein Dekapeptid, das sieben Aminosäuren in zyklischer Form aufweist. Die Wirkung von Colistin wird durch Interaktionen mit Lipopolysaccharid- Komponenten der äußeren Membran gramnegativer Bakterien hervorgerufen.
Colistin durchdringt diese Membran und zerstört ihre Struktur, so dass es zu einer erhöhten Permeabilität kommt, in dessen Folge das Bakterium abstirbt (MESTRES et al. 1998). Somit wirkt Colistin bakterizid (FALAGAS u. KASIAKOU 2005). Das Wirkspektrum umfasst ausschließlich gramnegative Keime, da grampositive Bakterien aufgrund des Fehlens der äußeren Membran eine natürliche Resistenz aufweisen (HANCOCK u. CHAPPLE 1999).
Bei oraler Applikation wird Colistin nicht aus dem Magendarmtrakt resorbiert (RIVIERE u. PAPICH 2013b). Für Geflügel sind verschiedene Colistinsulfat- Präparate zur oralen Anwendung zugelassen (VETIDATA 2014).
2.7.1 Resistenz gegen Colistin
Resistenzen gegen Colistin beruhen unter anderem auf Veränderungen von Lipid A, einem Bestandteil von LPS. Dies führt zu veränderten Ladungen, so dass Colistin weniger gut binden kann (RAETZ u. WHITFIELD 2002). Eine weitere Möglichkeit besteht nach MOFFATT et al. (2010) in dem kompletten Verlust der LPS-Produktion, so dass die Zielstruktur für Colistin nicht mehr vorhanden ist.
2.8 Aminopenicilline
Aminopenicilline, wie Amoxicillin und Ampicillin, gehören zur Gruppe der β-Laktam- Antibiotika. Die Grundstruktur der Penicilline beruht auf dem 6-Aminopenicillan-Ring (BATCHELOR et al. 1959). Durch Substitution von Aminoresten in der Benzylseitenkette, werden Aminopenicilline mit zusätzlicher Wirkung im gramnegativen Bereich synthetisiert (DOYLE et al. 1962; NAUMANN 1963).
Ampicillin besitzt den gleichen Wirkungsbereich wie Amoxicillin (RIVIERE u. PAPICH 2013d). Durch Hemmung des Endschritts der Peptidoglykansynthese, die für den
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Aufbau von Murein, einem Zellwandbestandteil von Bakterien, wichtig ist, entfalten β-Laktame ihre bakterizide Wirkung. Bei der Synthese werden N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure durch kurze Peptidketten mittels einer Transpeptidase verbunden. β-Laktam-Antibiotika inhibieren diese Peptidase (TIPPER u.
STROMINGER 1965; WISE u. PARK 1965). Dadurch kommt es zu einer gestörten Integrität der Zellwand und anschließend zum Tod des Bakteriums. Außerdem gehen β-Laktam-Antibiotika noch weitere Verbindungen zu penicillinbindenden-Proteinen ein, wodurch u.a. Lysis oder eine Hemmung der Septumbildung bei der Zellteilung ausgelöst wird (TOMASZ 1979).
Um an ihren Wirkungsort zu gelangen, müssen β-Laktam-Antibiotika die Zellwand der Bakterien durch Porine überwinden. Grampositive Bakterien haben generell leichter passierbare Porine und keine äußere Membran im Gegensatz zu gramnegativen (VALENTIN-WEIGAND 2011). Deshalb wirken sie im Allgemeinen besser gegen grampositive Keime (SHEEHAN 1967). Die Wirkung von β-Laktam- Antibiotika ist zeitabhängig. Die Zeit, in der die Konzentration des Antibiotikums oberhalb der MHK ist, ist deshalb entscheidend (TURNIDGE 1998).
Präparate, die die Aminopenicilline Ampicillin und Amoxicillin enthalten, sind derzeit für die orale Gabe bei Geflügel zugelassen (VETIDATA 2014).
2.8.1 Resistenz gegen Aminopenicilline
β-Laktamasen spielen eine sehr wichtige Rolle, aber auch veränderte penicillinbindende-Proteine sowie verminderter Influx bzw. verstärkter Efflux des Antibiotikums kommen vor (SCHWARZ u. CHASLUS-DANCLA 2001). Es gibt verschiedene Gruppen von β-Laktamasen, die das Antibiotikum enzymatisch inaktivieren, dazu gehören auch Extended-spectrum β-lactamases (ESBL). Dies sind Enzyme, die ein erweitertes Spektrum an β-Laktam-Antibiotika spalten können (WITTE u. MIELKE 2003). Das verantwortliche Gen kann sich in der chromosomalen DNA oder einem Plasmid befinden (BUSH et al. 1995; THEURETZBACHER 1998).
Durch penicillinbindende-Proteine, die eine verminderte Sensitivität gegenüber β-Laktam-Antibiotika aufweisen, können diese nicht mehr binden und ihre Wirkung bleibt aus (RICE et al. 2003). Durch verminderte Expression oder Veränderungen von Porinen können β-Laktam-Antibiotika nicht mehr in der Konzentration in das Bakterieninnere gelangen die nötig wäre, um diese abzutöten (JAFFE et al. 1982;
