Tierärztliche Hochschule Hannover
Verschleppung subtherapeutischer antibakterieller Konzentrationen von Enrofloxacin und ihr Einfluss auf die
Resistenzentwicklung kommensaler Escherichia coli im Darm beim Huhn
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Gesine Scherz
Köln
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Manfred Kietzmann 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Gerhard Glünder
Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2013
Diese Arbeit wurde durch das Bundesministerium für Bildung und
Forschung im Rahmen des RESET-Projektes gefördert.
Meinen Eltern und Burkhard
in Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ... 3
2.1 Fluorchinolone ... 3
2.1.1 Funktion der Topoisomerasen Typ 2 in der Bakterienzelle ... 7
2.1.2 Wirkungsmechanismus der Fluorchinolone ... 8
2.1.3 Das SOS-Regulon ... 10
2.2 Mechanismen der Resistenzentwicklung gegen Fluorchinolone ... 11
2.2.1 Chromosomal-vermittelte Resistenz: Veränderung der Zielenzyme DNA-Gyrase und Topoisomerase IV ... 11
2.2.2 Reduzierte Aufnahme von Fluorchinolonen in die Bakterienzelle ... 13
2.2.3 Plasmid-vermittelte Resistenz ... 16
2.2.4 Mutant Prevention Concentration-/Mutant Selection Window-Hypothese ... 18
2.3 Enrofloxacin... 21
2.3.1 Pharmakokinetik von Enrofloxacin in Broilern ... 22
2.3.1.1 Absorption nach oraler Applikation ... 22
2.3.1.2 Metabolismus ... 23
2.3.1.3 Exkretion ... 23
2.3.1.4 Plasmaproteinbindung und Verteilung ... 24
2.3.2 Pharmakodynamik/Pharmakokinetik von Enrofloxacin ... 24
2.3.3 Resistenzvorkommen kommensaler E. coli im Wirtschaftsgeflügel ... 25
2.4 Verschleppungsproblematiken in der Tierhaltung... 27
2.4.1 Verschleppung subtherapeutischer Konzentrationen über das Tränkwasser ... 27
2.4.2 Verschleppung über Einstreu, Staub und Aerosole ... 28
3 MATERIAL UND METHODEN ... 31
3.1 Material ... 31
3.2 Chemikalien, Nährmedien und Arzneimittel ... 32
3.3 Analytik ... 33
3.3.1 Puffer ... 34
3.4 Methoden ... 34
3.4.1 Versuchsübersicht ... 34
3.4.2 Plasmakonzentrationen von Enro- und Ciprofloxacin und die Verteilung der Analyten in der Umgebung ... 35
3.4.2.1 Versuchstiere ... 35
3.4.2.2 Versuchsdurchführung ... 35
3.4.2.3 Probenaufbereitung ... 41
3.4.2.4 Analytik ... 41
3.4.2.5 Validierung der HPLC für die untersuchten Testsubstanzen ... 42
3.4.3 Mikrobiologische Untersuchungen zur Resistenzentwicklung ... 46
3.4.3.1 Versuchstiere ... 46
3.4.3.2 Durchführung Tierversuche ... 46
3.4.3.3 Quantitative Untersuchung zur Resistenzentwicklung mittels MHK-Bestimmung ... 47
3.4.3.4 Qualitative Untersuchung der E. coli auf klinische Resistenz mittels Anreicherung ... 52
4 ERGEBNISSE ... 54
4.1 Durchführung der bestimmungsgemäßen Behandlung ... 54
4.1.1 Plasmaverlaufskurven ... 54
4.1.2 Konzentrationen von Enro- und Ciprofloxacin in Sedimentationsstäuben ... 58
4.1.3 Konzentrationen von Enro- und Ciprofloxacin in Stallaerosolen ... 59
4.2 Verschleppungsszenarien ... 60
4.2.1 Applikation subtherapeutischer Dosierungen über das Tränkwasser ... 60
Inhaltsverzeichnis
4.2.1.1 Plasmaverlaufskurven ... 60
4.2.2 Applikation subtherapeutischer Dosierungen über das Futter ... 62
4.2.2.1 Plasmaverlaufskurven ... 62
4.2.2.2 Konzentrationen von Enro- und Ciprofloxacin in Sedimentationsstäuben ... 65
4.2.2.3 Konzentrationen von Enro- und Ciprofloxacin in Stallaerosolen ... 68
4.3 Resistenzentwicklung von E. coli im Darm vom Huhn unter Einwirkung von Enrofloxacin... 70
4.3.1 Kontrollgruppe ... 71
4.3.2 Einfluss der therapeutischen Behandlung mit Enrofloxacin auf kommensale E. coli ... 73
4.3.3 Simulation einer Verschleppung von 3% der therapeutischen Dosierung über Tränkwasser und ihr Einfluss auf kommensale E. coli. ... 75
4.3.4 Simulation einer Verschleppung von 10% der therapeutischen Dosierung über Tränkwasser und ihr Einfluss auf kommensale E. coli ... 77
4.3.5 Gesamtüberblick aller Gruppen ... 80
4.3.6 Statistische Auswertung ... 82
5 DISKUSSION ... 84
5.1 Antimikrobielle Behandlung von Geflügel über Tränkwasser und der Eintrag von Rückständen in die direkte Umgebung ... 86
5.2 Einwirkung von Enrofloxacin auf die Resistenzentwicklung kommensaler E. coli im Darm beim Huhn ... 88
5.3 Schlussfolgerung und Ausblick ... 100
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 101
7 SUMMARY ... 103
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 105
9 TABELLENVERZEICHNIS ... 108
10 LITERATURVERZEICHNIS ... 110
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
ATP AUC BTK CFU Cipro CLSI C. koseri
Cmax
DCM DSB
E. amnigenus E. cloacae
ECOFF E. coli
Enro
E. sakazakii
EUCAST Flc HPLC HQS Int. Std.
kBp KG
K. pneumoniae
Adenosintriphosphat Area under the curve Bundestierärztekammer Colony-forming unit Ciprofloxacin
Clinical and Laboratory Standards Institute Citrobacter koseri
Maximale Plasmakonzentration Dichlormethan
Doppelstrangbruch Enterobacter amnigenus Enterobacter cloacae
Epidemiologischer Cut-Off Escherichia coli
Enrofloxacin
Enterobacter sakazakii
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Fluorchinolone
High Performance Liquid Chromatography
High quality control standard Interner Standard
Klinischer Breakpoint Körpergewicht
Klebsiella pneumoniae
Abkürzungsverzeichnis
LM-liefernde Tiere LOD
LOQ LQS
MAR-Mutanten M. bovis
MHK MIC MPC MUG MSW NRL QRDR RND S. aureus S. pneumoniae
SoxRS-Regulon ssDNA
Sst TolC VTEC
Lebensmittel-liefernde Tiere Limit of Detection
Limit of Quantification Low quality control standard
Multiple antibiotic resistance-Mutanten Mycobacterium bovis
Minimale Hemmkonzentration Minimal inhibitory concentration Mutant Prevention Concentration
4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucoronid Mutant Selection Window
Nationales Referenzlabor
Quinolone Resistance Determining Region Resistant Nodulation and Cell Division Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae Superoxide Response-Regulon
Einzelstrang-DNA Sedimentationsstaub Tolerance colicin E1 Verotoxinbildende E. coli
Einleitung
1
1 Einleitung
Fluorchinolone werden sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin eingesetzt. Ihr breites Wirkungsspektrum, die gute Bioverfügbarbeit sowohl nach oraler als auch intravenöser Gabe, ihre gute Verteilung in Geweben und ihre hohen Wirkspiegel gepaart mit einer geringen Anzahl von Nebenwirkungen, machen sie zu nahezu idealen antibakteriellen Substanzen (ANDERSSON u. MACGOWAN 2003).
Eine Studie in den Jahren 1995 bis 2002 in den USA zeigte die Bedeutung der Fluorchinolone als Substanzklasse in der Behandlung bakterieller Infektionen (LINDER et al. 2005). ACAR u. GOLDSTEIN (1997) bezeichneten das nur für die Humanmedizin vorbehaltene Ciprofloxacin, als das meistgenutzte Antibiotikum der Welt. In der Veterinärmedizin findet eine Anwendung der Fluorchinolone sowohl bei Tieren, die der Gewinnung von Lebensmitteln dienen, als auch bei Klein- und Heimtieren statt.
Parallel zur Nutzung der Fluorchinolone in Human- als auch in Veterinärmedizin erfolgte eine rapide Resistenzentwicklung sowohl in Mensch als auch Tier. 2005 wurde die Anwendung von Enrofloxacin, einem Fluorchinolon der zweiten Generation, aufgrund der hohen Entwicklung resistenter Campylobacter-Stämme, bei der Lebensmittel-Gewinnung dienendem Geflügel in den USA verboten.
Campylobacter gilt mit als die häufigste Ursache für gastrointestinale Erkrankungen aufgrund der Aufnahme tierischer Nahrungsmittel.
Als Hauptquelle für die Exposition von Menschen durch Fluorchinolon-resistente Bakterien wird Geflügelfleisch genannt (KMET u. KMETOVÁ 2009).
Enrofloxacin, ein Fluorchinolon der zweiten Generation, wird unter anderem für die Behandlung von Colibacillose, Pasteurellose und Infektionen mit Mykoplasmen in Geflügelbeständen angewendet (BAUDITZ 1988). Im Fall einer Erkrankung innerhalb eines Bestands erfolgt aufgrund der enormen Tierzahlen eine Behandlung der kompletten Gruppe mit Arzneimitteln meist über das Tränkwasser oder Futter. Das Einzeltier als solches rückt aus Gründen der Praktikabilität in den Hintergrund (KAMPHUES 1996). Mit der Behandlung über das Wasser oder Futter gehen einige Risiken einher (KAMPHUES 1996), deren wichtigster und meist diskutierter Punkt in
Einleitung
2
Verbindung mit der Resistenzentwicklung das Erscheinen von Rückständen im Tränkwasser oder Futter darstellt. Im Fall von Enrofloxacin erfolgt die Behandlung eines Geflügelbestandes in der Regel über das Tränkwasser. Die physiologische Darmflora sowohl von Mensch als auch Tier wird im Fall einer therapeutischen Behandlung mit Arzneimitteln oder aber auch bei Aufnahme von Rückständen aus der Umgebung der zu behandelnden Tiere automatisch exponiert. So steht Escherichia coli als Kommensale der Darmflora beispielsweise im Verdacht, Resistenzen auf Pathogene übertragen zu können (LOOFT et al. 2012). Zudem wird er als Indikatorkeim zur Einschätzung des Risikos der Resistenzentwicklung in Übersichtsstudien verwendet (KÄSBOHRER et al. 2012).
Ziel dieser Dissertation war es, die Auswirkungen der Aufnahme von geringen Wirkstoffmengen (Verschleppungen) von Enrofloxacin als Modellsubstanz auf Resistenzentwicklungen in E. coli als Indikatorkeim der physiologischen Darmflora im Huhn zu testen.
Literaturübersicht
3
2 Literaturübersicht
2.1 Fluorchinolone
Fluorchinolone stellen vollsynthetische, antimikrobiell wirksame Substanzen aus der Gruppe der Chinolone dar und sind durch ihre bakterizide Wirkung charakterisiert, die auf der Inhibition zweier bakterieller Enzyme, der DNA-Gyrase und der DNA- Topoisomerase IV (beide Typ II-Topoisomerasen), beruht (DRLICA u. ZHAO 1997).
1962 wurde die Nalidixinsäure als antibakterieller Wirkstoff eingeführt (LESHER et al.
1962; BALL 2000), deren Wirkungsspektrum sich auf gram-negative Keime der Gruppe der Enterobacteriaceae, zur Behandlung einfacher Infektionen des Uro- Genitaltrakts, beschränkte (WARD-MCQUAID et al. 1963; HOOPER 1998). Niedrige Serumlevel, ein begrenztes Wirkungsspektrum und unerwünschte Nebenwirkungen beschränkten ihren Einsatz (VAN BAMBEKE et al. 2005). Im Laufe der folgenden Jahrzehnte wurde die Nalidixinsäure durch strukturelle Modifikationen weiterentwickelt, sodass heute Chinolone der ersten bis vierten Generation unterschieden werden können. Insbesondere das Wirkungsspektrum wurde erweitert, es umfasst heute sowohl gram-negative als auch gram-positive Keime (OLIPHANT u. GREEN 2002).
Allen Chinolonen gemein ist der Naphthyridin-Kern, abgeleitet von der Nalidixinsäure (BALL 2000). In den achtziger Jahren erfolgte die Entwicklung der Fluorchinolone, mit einem 4-Chinolon-Gerüst als Basis, wie in Abbildung 2-1 dargestellt.
Substituenten sind die allen Chinolonen gemeine Carboxylsäure an Position 3, ein basischer Piperazinring an Position 7 und ein Fluoratom an Position 6. Differenzieren kann man die einzelnen Fluorchinolone anhand ihrer Substituenten in para-Stellung zum Piperazinring und an der Nitrogenposition 1 (WOLFSON u. HOOPER 1985;
HEEB et al. 2010).
Literaturübersicht
4
Abbildung 2-1: Strukturformeln des Grundgerüsts der 4-Chinolone und von Norfloxacin. Die Substitutionen des Fluoratoms an Position 6 und des Piperazinrings an Position 7 sind zur Kennzeichnung umkreist. Ausschnitt einer Darstellung von WOLFSON u. HOOPER (1985).
Die Einführung des Fluorions und damit der Fluorchinolone stellte eine deutliche Verbesserung der bakteriziden Eigenschaften dar. Die Gyraseinhibition wurde mindestens um einen Faktor 10 verstärkt, womit auch eine deutliche Verminderung (bis zu einhundertfach) der minimalen Hemmkonzentration (MHK) einherging (ANDERSSON u. MACGOWAN 2003). Unter anderem führte dies zu einer enormen Erweiterung des antibakteriellen Spektrums. Während zu Zeiten der Nalidixinsäure lediglich gram-negative Keime, insbesondere Enterobacteriaceae bekämpft wurden, gehören nun auch aerobe und anaerobe gram-positive Bakterien zu den Zielobjekten sowie Pathogene, die aufgrund anderweitig erworbener Resistenzen als schwer zu behandeln gelten (wie zum Beispiel Pseudomonas aeruginosa) (HEEB et al. 2010).
Dementsprechend erweiterte sich auch das Feld zu behandelnder Krankheitsbilder von einfachen Infektionen des Urogenitaltraktes zu komplexeren Infektionen zum Beispiel des Respirationstraktes (HEEB et al. 2010) bis hin zu systemischen Erkrankungen bakteriellen Ursprungs wie zum Beispiel Prostatitis, Osteomyelitis und Pyelonephritis (BALL et al. 1998). Fluorchinolone vereinen eine hohe Bioverfügbarkeit, das Erreichen hoher Serumkonzentrationen, eine gute Verteilung in Körpergeweben und eine geringere Wahrscheinlichkeit auftretender Nebenwirkungen miteinander (BUGYEI et al. 1999; ANDERSSON u. MACGOWAN 2003).
Flumequin war das erste synthetisierte Fluorchinolon (ROHLFING et al. 1976; BALL 2000) und gehört damit der ersten Generation an. Die Substitution des Piperazinrings an Position 7 des Grundgerüsts ermöglichte eine antibakterielle
Literaturübersicht
5 Wirkung gegen Pseudomonaden (BALL 2000). Darauf folgte die zweite Generation, deren bekanntestes Antibiotikum das in der Humanmedizin verwendete Ciprofloxacin darstellt. Es vereint eine hohe Wirksamkeit gegen gram-negative Bakterien inklusive Pseudomonas aeruginosa mit einer starken bakteriziden Wirkung gegen gram- positive Kokken (ELIOPOULOS et al. 1984). Laut ACAR u. GOLDSTEIN (1997) war Ciprofloxacin zu diesem Zeitpunkt eine der antibakteriellen Substanzen mit der höchsten Nutzungsrate der Welt. Analog dazu wurde Enrofloxacin in der Tiermedizin eingeführt, dessen Hauptmetabolit Ciprofloxacin ist (FLAMMER et al. 1991).
Daraufhin folgten weitere Modifikationen des Wirkungsspektrums bzw. der pharmakokinetischen und -dynamischen Eigenschaften. Nach der
„Ciprofloxacingeneration“ IIa folgte zum Beispiel die in ihrer anti-gram-positiven Wirkungsweise verbesserte Generation IIb, die Streptococcus pneumoniae in ihr Spektrum aufnahm (BALL 2000). Zum heutigen Zeitpunkt sind mittlerweile vier Generationen auf dem Markt (Tabelle 2-1).
Literaturübersicht
6
Tabelle 2-1: Auf dem Markt erhältliche Fluorchinolone, aufgeteilt nach Generationen.
Angaben nach VETIDATA (2013b). LM = Lebensmittel.
Wirkstoff Anwendung in der Veterinärmedizin
Anwendung bei LM-liefernden Tieren verboten
Flumequin - X
Norfloxacin - X
Ciprofloxacin - X
Difloxacin X -
Enrofloxacin X -
Ibafloxacin X X
Marbofloxacin X -
Ofloxacin X -
Danofloxacin X -
Orbifloxacin X X
Levofloxacin - X
Sarafloxacin X -
Sparfloxacin - X
Moxifloxacin - X
Pradofloxacin X X
Für die Veterinärmedizin sind derzeit in erster Linie die Fluorchinolone der zweiten Generation von Bedeutung (VETIDATA 2013b). Welche Fluorchinolone zu den zugelassenen Arzneimitteln der Tiermedizin gehören und welche bei Lebensmittel liefernden Tieren verboten sind, ist Tabelle 2-1 zu entnehmen.
Enrofloxacin war das erste Fluorchinolon für die Anwendung in der Veterinärmedizin und wurde Ende der achtziger Jahre des 20. Jahrhunderts eingeführt (VANCUTSEM et al. 1990). Es wirkt sowohl gegen gram-positive und gram-negative Bakterien als auch gegen Mykoplasmen (KNOLL et al. 1999). In den USA ist seine Anwendung bei Geflügel aufgrund der Resistenzsituation bei Campylobacter 2005 verboten worden (CIDRAP 2005).
Literaturübersicht
7 2.1.1 Funktion der Topoisomerasen Typ 2 in der Bakterienzelle
Nach Wang (1985) sind Topoisomerasen Enzyme, die die topologischen Stadien der DNA kontrollieren und modifizieren. Unter der Topologie der DNA versteht man die räumliche Anordnung der DNA-Doppelhelix.
Die DNA-Gyrase und die DNA-Topoisomerase IV gehören beide zu den Typ 2- Topoisomerasen (PENG u. MARIANS 1995). Die Gyrase besteht aus jeweils zwei Untereinheiten A und B, codiert durch gyrA und gyrB (FERRERO et al. 1995). Die Topoisomerase IV besteht ebenfalls aus jeweils zwei Untereinheiten: ParC und ParE.
Die genetische Codierung von ParC erfolgt durch das Gen parC, diese Untereinheit ist homolog zur Untereinheit A der Gyrase. ParE wird durch parE codiert und verhält sich homolog zur Untereinheit B der Gyrase (KATO et al. 1990; KATO et al. 1992).
Typ 2-Topoisomerasen führen durch Doppelstrangbrüche zweier komplimentärer Stränge Lücken in einem DNA-Doppelstrangsegment herbei, durch die jeweils ein anderes doppelsträngiges Segment hindurchtritt. Anschließend werden die beiden getrennten Enden, die die Lücke geformt haben, wieder verbunden (WANG 1996).
Dies trägt zur Lösung der topologischen Probleme der zirkulären Bakterien-DNA in der Bakterienzelle, insbesondere bei den Vorgängen der Replikation, Transkription und Rekombination bei, die aufgrund ihrer Länge und des geringen Platzangebots als DNA-Doppelhelix organisiert ist (GELLERT 1981; STECK u. DRLICA 1985;
ROCA 1995). Die DNA-Gyrase und die Topoisomerase IV sind ausschlaggebend an der Replikation und Transkription der DNA (DRLICA u. ZHAO 1997; GROSS et al.
2003) bzw. an Zellwachstum und -teilung beteiligt (DRLICA u. ZHAO 1997). Die Gyrase ist als Einzige fähig, eine negative Überspiralisierung der vorher entwundenen und damit relaxierten DNA nach der Replikation durchzuführen (GELLERT 1981; PENG u. MARIANS 1995; ROCA 1995; CHAMPOUX 2001), während die Topoisomerase IV für die Entwindung der Stränge zuständig ist und allein die Dekatenierung (Trennung) der Tochterchromosomen nach der Replikation katalysiert (PENG u. MARIANS 1993).
Die negative Überspiralisierung der DNA-Doppelhelix durch die Gyrase ist ATP- abhängig (GELLERT et al. 1976). Wenn kein ATP vorhanden ist, wird die Überspiralisierung der DNA gelöst und die DNA relaxiert (GELLERT et al. 1977). Die
Literaturübersicht
8
Tatsache, dass die Gyrase als Einzige fähig ist, negative Überspiralisierungen herbeizuführen, ist der Eigenschaft der DNA geschuldet, an die Carboxylendung der Untereinheit A der Gyrase zu binden (KAMPRANIS u. MAXWELL 1996). Diese negativen Überspiralisierungen ermöglichen die Anlagerung der Startproteine der Replikation an die DNA (HOOPER 2001) und sind daher unverzichtbar.
2.1.2 Wirkungsmechanismus der Fluorchinolone
Fluorchinolone wirken über die Inhibition der Typ 2-Topoisomerasen DNA-Gyrase und Topoisomerase IV (DRLICA u. ZHAO 1997). Welches der beiden Enzyme das primäre Ziel des jeweiligen Fluorchinolons darstellt, hängt von der jeweiligen Sensibilität der Enzyme ab. Das Enzym mit der höheren Sensibilität stellt laut HOOPER 2001 das primäre Ziel der Fluorchinolone dar.
Zwischen den einzelnen Generationen der Fluorchinolone gibt es Unterschiede bezüglich der Zielenzyme. Während (in den älteren Generationen) die DNA-Gyrase in den gram-negativen Bakterien das bevorzugte Ziel darstellt, ist das Ziel in den gram-positiven Keimen die Topoisomerase IV (HOOPER 2001, 2002; INTORRE et al. 2007).
Bei den neueren Fluorchinolonen ist der Bindungsmechanismus ausgeweitet auf ein duales Bindungssystem, das für die Inhibition beider Enzyme zuständig ist. Zu diesen Substanzen gehören Gatifloxacin, Moxifloxacin, Pradofloxacin und Trovafloxacin (LU et al. 1999; PETERSON 2001; INTORRE et al. 2007). Letztendlich jedoch hängt das primäre Zielenzym der Inhibition durch Fluorchinolone von der jeweiligen Bakterienspezies ab (INTORRE et al. 2007).
Das jeweilige Zielenzym (DNA-Gyrase/DNA-Topoisomerase IV) lagert sich an die DNA an und es bildet sich ein Enzym-DNA-Komplex. Bindet das Antibiotikum an diesen Komplex, wird dieser stabilisiert und dadurch inhibiert. Die jeweilige Topoisomerase und die DNA sind über eine kovalente Bindung der 5‘-Enden miteinander verbunden. Die Topoisomerasen führen Doppelstrangbrüche herbei, das heißt, in diesem stabilisierten Antibiotikum-Enzym-DNA-Komplex befindet sich eine Lücke im Doppelstrang, die durch eine „Topoisomerasebrücke“ stabilisiert wird. Die
Literaturübersicht
9 Antibiotikum-Enzym-DNA-Komplexe, sogenannte ternäre Komplexe, gelten als reversibel (HIASA u. SHEA 2000; DRLICA et al. 2009). Diese Reversibilität bleibt solange bestehen, bis Enzyme der Replikation versuchen diese Komplexe zu überschreiten und damit die kovalenten Proteinverbindungen aufheben, sodass vorübergehend angelegte Doppelstrangbrüche zu dauerhaften Unterbrechungen der DNA werden (HSIANG et al. 1989; CHEN u. LIU 1994; M. T. HOWARD et al. 1994;
FROELICH-AMMON u. OSHEROFF 1995). Diese permanenten Doppelstrangbrüche entstehen durch die Verschiebung der Enden der unterbrochenen DNA-Stränge, sodass eine Wiedervereinigung nicht möglich ist (HIASA et al. 1996), bzw. durch die Auflösung der kovalenten Bindung zwischen DNA-Enden und Enzym. Die DNA ist fragmentiert (DRLICA et al. 2009). Insgesamt machen diese Vorgänge den cytotoxischen Effekt aus. Je größer die Anzahl der an der DNA arbeitenden Topoisomerase-DNA-Komplexe ist, desto mehr Angriffspunkte werden den antibakteriellen Substanzen geboten. Die Stärke des cytotoxischen Effekts hängt demnach von der Anzahl der Topoisomerase-DNA-Komplexe ab (FROELICH- AMMON u. OSHEROFF 1995). Dies verhindert die Spaltung der DNA und den Fortschritt der Replikationsgabel (GELLERT et al. 1977; HOOPER 2001). Da diese Vorgänge aber für Zellwachstum und -teilung unentbehrlich sind, erklärt ihr Ausbleiben die bakterizide Wirkung der Fluorchinolone (DRLICA u. ZHAO 1997).
Abbildung 2-2 verdeutlicht noch einmal schematisch die Funktionsweise der Fluorchinolone.
Literaturübersicht
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Abbildung 2-2: Schematische Darstellung der Wirkung der Fluorchinolone auf die Topoisomerasen. Darstellung nach CHEN u. LIU (1994).
2.1.3 Das SOS-Regulon
Fluorchinolone entfalten ihre bakterizide Wirkung über die Inhibition der DNA-Gyrase und der DNA-Topoisomerase IV (DRLICA u. ZHAO 1997). Die daraus entstehenden Doppelstrangbrüche lösen eine Antwort der Zelle aus, die einen letalen Ausgang verhindern soll. Es erfolgt eine Induktion des SOS-Regulons, das letztendlich eine Reparatur der Doppelstrangbrüche durch Rekombination hervorruft (HOWARD et al.
1993). Das SOS-Regulon besteht aus mehr als 40 beteiligten Genen (FERNANDEZ DE HENESTROSA et al. 2000). Jede Zelle verfügt über eine Low-Level-Expression dieser Gene, jede darüber hinausgehende Expression wird durch das Protein LexA unterbunden. Das Vorhandensein von ssDNA (Einzelstrang-DNA) - zum Beispiel
Literaturübersicht
11 durch DNA-Doppelstrangbrüche - verursacht durch Fluorchinolone induziert ein SOS-Signal. RecA bindet an die ssDNA und löst damit eine autoproteolytische Reaktion des LexA-Proteins aus, es degeneriert und wird wirkungslos. Da es als Repressor des SOS-Regulons fungiert, wird dieses hochreguliert, sodass eine Reparatur der beschädigten DNA-Stränge durch Rekombination stattfindet (WITKIN 1991; HOWARD et al. 1993; DRLICA u. ZHAO 1997). Durch diese Reparaturen werden sogenannte „gezielte Mutationen“ hervorgerufen (KIM et al. 1997). Nachdem die Stränge wiederverbunden wurden, findet keine Signalinduktion mehr statt, LexA zeigt keine autoproteolytische Wirkung mehr und nimmt seine Funktion als Repressor des SOS-Regulons wieder auf (WITKIN 1991).
Durch die Induktion des SOS-Regulons verfügen die Bakterien über natürliche Überlebensmechanismen, die den Ausgang einer Fluorchinolontherapie in vivo beeinflussen könnten. DÖRR et al. (2009) zeigten, dass die, durch eine Ciprofloxacinbehandlung hervorgerufenen SOS-Regulationsmechanismen beteiligt waren an einer Persistenz einer kleinen Anzahl von E. coli.
2.2 Mechanismen der Resistenzentwicklung gegen Fluorchinolone Es lassen sich 3 Arten der Resistenzmechanismen unterscheiden:
1. Die Veränderung der Zielenzyme.
2. Die Reduktion der Fluorchinolonaufnahme in die Bakterienzelle.
3. Die Plasmid-vermittelte Resistenz.
2.2.1 Chromosomal-vermittelte Resistenz: Veränderung der Zielenzyme DNA- Gyrase und Topoisomerase IV
Zielenzyme der Fluorchinolone sind die zuvor schon beschriebenen und aus jeweils zwei Untereinheiten bestehenden Enzyme DNA-Gyrase und die Topoisomerase IV.
Die Chinolonresistenz der Bakterien tritt meist in Verbindung mit Mutationen in der Quinolone Resistance Determining Region (QRDR) der jeweiligen Untereinheiten der Topoisomerasen auf. Diese Lokalisation ist von entscheidender Bedeutung, da sie sich auf der DNA-bindenden Seite der Enzyme befindet. In der QRDR der
Literaturübersicht
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Untereinheit A der Gyrase sind die Aminosäuren der Positionen 67-106 betroffen, die in dieser Region erfolgenden Mutationen führen zur Chinolonresistenz (YOSHIDA et al. 1990; CABRAL et al. 1997). Wie CULLEN et al. (1989) zeigen konnten, war eine Einzelmutation, die Substitution der Aminosäure Serin an Position 83 durch die Aminosäure Tryptophan in der A-Untereinheit der Gyrase von Escherichia coli, zuständig für das Auftreten einer sogenannten High-Level-Resistenz der 4- Chinolone, nicht jedoch für die Fluorchinolone, wo sie aber auch eine Rolle spielt.
JACOBY (2005) benannte die Aminosäurepositionen 83 (Serin) und zusätzlich 87 (Asparagin) der QRDR in E. coli als sogenannte „Hot spots“ der Mutationen, die zur Chinolonresistenz führen.
Die Mutationen in der Untereinheit A der Gyrase befinden sich rund um die aktive Stelle des Enzyms, die für die DNA-Doppelstrangbrüche zuständig ist (DRLICA u.
ZHAO 1997). Laut DRLICA u. ZHAO (1997) bildet diese die Mutationen beinhaltende Region eine Tasche, in der die Chinolonbindung stattfindet. Die Mutationen sind verantwortlich für eine niedrigere Bindungsaffinität der Chinolone oder Fluorchinolone zum Enzym (BLONDEAU 2004).
Wie schon erwähnt und am Beispiel von E. coli aufgezeigt, ist das primäre Ziel der Fluorchinolone bei gram-negativen Bakterien die DNA-Gyrase, bei gram-positiven Keimen die Topoisomerase IV. Dementsprechend treten Mutationen, die zu Resistenzen führen, bei gram-negativen Bakterien in gyrA und homolog zur höheren Empfindlichkeit der Topoisomerase IV in Gram-positiven in parC auf (HOOPER 2001, 2002; JACOBY 2005).
Es gilt zwei Arten von Resistenzen bei Fluorchinolonen in E. coli zu unterscheiden, eine Low-Level-Resistenz mit MHK-Werten < 2 µg/ml und eine High-Level-Resistenz mit MHK > 4 µg/ml (BAGEL et al. 1999). Die Low-Level-Resistenz wird meist hervorgerufen durch die Substitution der Aminosäure Serin durch Leucin an Position 83 der Gyrase-Untereinheit A, also durch eine Punktmutation. Die High-Level- Resistenz wird verursacht durch mindestens zwei Mutationen, die die Aminosäurepositionen 80 und 87 betreffen (CULLEN et al. 1989; EVERETT et al.
1996; LEHN et al. 1996; BAGEL et al. 1999) und zusätzlich mindestens eine Mutation in parC der Topoisomerase IV an Aminosäureposition 80 und/oder 87
Literaturübersicht
13 (HEISIG 1996). Mutationen in der GyrB-Untereinheit sind von untergeordneter Bedeutung und rufen in erster Linie Low-Level-Resistenzen hervor (HOOPER 1999).
Laut FERRERO et al. (1995) sind mindestens 10 Punktmutationen nötig, bevor es in E. coli zu einer High-Level-Resistenz kommt.
Die Topoisomerase IV stellt dabei in gram-positiven Bakterien das primäre Ziel da.
Mutationen in gyrA und gyrB kommen zwar vor, spielen aber eine untergeordnete Rolle, da die Gyrase hier nicht Hauptangriffspunkt der Fluorchinolone ist. Die in diesem Gebiet am meisten untersuchten Stämme stellen S. aureus und S.
pneumoniae dar (HOOPER 1999).
ParC der Topoisomerase IV ist homolog zu GyrA der Gyrase, dementsprechend verhält sich auch die QRDR von ParC ähnlich zu GyrA. Diese Untereinheit ist in erster Linie beteiligt an Resistenzen gegen Fluorchinolone aufgrund der höheren Häufigkeit vorkommender Mutationen als in ParE. Betroffen ist hier hauptsächlich die Aminosäure Serin an Position 80 des Aminoterminus (NG et al. 1996; HOOPER 1999). Substitutionen der Glutaminsäure an Position 84 kommen ebenfalls häufig vor und führen gemeinsam mit Veränderung der Position 80 zu einem erhöhten Resistenzlevel (HOOPER 1999).
2.2.2 Reduzierte Aufnahme von Fluorchinolonen in die Bakterienzelle
Um die Zielenzyme in Bakterienzellen zu inhibieren, müssen Fluorchinolone erst einmal in die Zelle gelangen. Dazu müssen bei gram-positiven Bakterien die äußere Zellwand und die Plasmamembran überwunden werden; bei gram-negativen Keimen kommt die äußere Membran hinzu.
Eine reduzierte Aufnahme von Fluorchinolonen bei gram-negativen Bakterien kann zwei Vorgängen geschuldet sein, einer Minderung der Permeabilität der Bakterien oder einer Überexpression von Multidrug-Efflux-Pumpen (RUIZ 2003).
Es gibt zwei Wege, wie die Fluorchinolone die äußere Membran der Gram-negativen überwinden können, über Diffusion oder die Nutzung von Kanälen, sogenannten Porinen. Diese ermöglichen im natürlichen Zustand hydrophilen Nährstoffen, Metaboliten oder auch Medikamenten den Übergang in die Zelle oder aus ihr hinaus.
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In diesem Fall sind sie von gesteigertem Interesse für die Resistenzentwicklung (COHEN et al. 1988; RUIZ 2003).
OmpA, OmpC und OmpF sind drei Porine von E. coli mit der größten Bedeutung für die Überwindung der äußeren Membranbarriere (RUIZ 2003). Die Expression der Porine wird so koordiniert, dass sie in einer konstanten Anzahl in der Zelle vorhanden sind. Die Anteile der einzelnen Kanäle an der Gesamtzahl wird durch äußere Einflüsse wie Osmolarität und Temperatur beeinflusst (ALPHEN u.
LUGTENBERG 1977; COHEN et al. 1988). COHEN et al. (1988) konnten eine starke Reduktion der Anzahl von OmpF bei Mar (multiple antibiotic resistance)-Mutanten in der äußeren Membran detektieren. TAVIO et al. (1999) wies einen Mangel an OmpF in chinolonresistenten Stämmen von E. coli nach.
Mar-Mutanten von E. coli zeigen eine erhöhte Resistenz gegen verschiedene Antibiotika wie Tetrazykline, Penicilline, Cephalosporine, Chloramphenicol, Rifampicin, Puromycin, Nalidixinsäure und mittlerweile auch Fluorchinolone, die auf eine erhöhte Effluxaktivität zurück zu führen ist (GEORGE u. LEVY 1983; OKUSU et al. 1996). Es erfolgt eine konstitutive Expression des MarRAB-Operons, das, wie der Name schon sagt, aus den Genen marR, A und B besteht (SEOANE u. LEVY 1995).
Die positive Regulation der Antibiotikaresistenz findet durch das Produkt des Gens marA statt, die Supression durch MarR, welches durch marR kodiert wird (COHEN et al. 1988). OKUSU et al. (1996) konnten jedoch zeigen, dass eine Mutation in marR, das für den Repressor des MarRAB-Operons kodiert, nicht allein für das Entstehen von Resistenzen zuständig war, sondern das Acr(Acriflavine resistant)AB-Efflux- System eine entscheidende Rolle spielt.
Das AcrAB-Efflux-System ist ein durch das acrAB-Operon gesteuertes Multidrug- Transporter-System von E. coli, es besteht aus dem AcrB-Transporter der RND- Familie, dem periplasmatischen Protein AcrA und dem Protein TolC aus der äußeren Membran (NIKAIDO 1996; NIKAIDO u. ZGURSKAYA 2001). Transporter der RND (Resistant-Nodulation-Cell-Division)-Familie kommen lediglich bei gram-negativen Bakterien vor und transportieren die Antibiotika über die äußere Membran und die Plasmamembran (HUGUET et al. 2013).
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15 Die Überexpression des Transkriptionsaktivators MarA durch die Mutation im Gen des Repressors MarR führt aufgrund reduzierter Translation des Gens ompF eine reduzierte Anzahl des Porins OmpF herbei, das für die Durchgängigkeit der Membran zuständig ist. Gleichzeitig findet eine enorme Steigerung der AcrAB/TolC- Effluxpumpen aufgrund der Aktivierung ihrer kodierenden Gene durch MarA statt, sodass letztendlich aufgrund der reduzierten Anzahl der Porine nur wenig Antibiotika hineinkommen, aber gleichzeitig eine erhöhte Ausschleusung eben jener Substanzen aus der Bakterienzelle stattfindet (COHEN et al. 1988; COHEN et al. 1989; OKUSU et al. 1996; ALEKSHUN u. LEVY 1997; JACOBY 2005).
Das Regulon marRAB verfügt über Gene, die gleichzeitig zum soxRS (superoxide response)-Regulon gehören (CHIANG u. SCHELLHORN 2012). Dabei handelt es sich um einen Regulator der Reaktion auf oxidativen Stress, der bei Stoffwechselvorgängen unter aeroben Bedingungen unvermeidbar ist. Beide Operons tragen also ihren Teil zur multiplen Antibiotikaresistenz bei (TAVIO et al.
2010).
Sowohl gram-negative als auch gram-positive Bakterien verfügen über diverse Effluxsysteme, bei Ps. aeruginosa sind vier bekannt. Die Effluxpumpen von S.
aureus werden über das Gen norA gesteuert (UBUKATA et al. 1989). Sie sind nicht spezifisch und transportieren demnach also nicht nur Fluorchinolone (JACOBY 2005).
Eine High-Level-Resistenz kann nur über die Kombinationen chromosomaler Mutation in gyrA und parC erreicht werden oder über die Kombination chromosomaler Mutationen mit Non-Target-Mutationen wie verminderten Porinen, Effluxpumpen oder Plasmiden (HEISIG u. TSCHORNY 1994; DEGUCHI et al. 1997).
HUGUET et al. (2013) konnten anhand von fluorchinolonresistenten E. coli-Stämmen tierischen Ursprungs mit High-Level-Resistenzen gegen Enrofloxacin (MHK: 8 - 64 µg/ml) zeigen, dass eine Inhibition der Effluxpumpen ein rapides Absinken der MHK-Werte auf 1-4 µg/ml bewirken konnte. Die resultierenden Werte unterlagen zum großen Teil jedoch immer noch einer klinischen Resistenz. Ebenfalls wurde in dieser Studie nach Inhibition der Effluxpumpen ein stärkerer Abfall der MHK gegen Enrofloxacin, einem hydrophoben Fluorchinolon, detektiert als gegenüber weniger
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hydrophoben Fluorchinolonen. Dies lässt darauf schließen, dass die Effluxpumpen der RND-Familie eine höhere Affinität zu eher hydrophoben Substanzen wie Enrofloxacin haben (HUGUET et al. 2013).
2.2.3 Plasmid-vermittelte Resistenz
MARTINEZ-MARTINEZ et al. (1998) teilten 1998 die Entdeckung der auf dem konjugativen multiresistenten Plasmid pMG252, das aus einem klinischen Isolat von einem gegen Ciprofloxacin resistenten K. pneumoniae-Stamm isoliert wurde, kodierten Fluorchinolonresistenz mit. Sie führten eine Studie an einem porindefizienten K. pneumoniae Stamm durch, um die Ausprägung der β- Lactamresistenz, die auf diesem Plasmid ebenfalls kodiert wird, zu überprüfen. Die Chinolonresistenz wurde in dem Versuch als Kontrolle verwendet, mit dem Zufallsergebnis, dass die Resistenz der Teststämme bei Anwesenheit des Plasmids um das 4 bis 16fache auf einen MHK-Wert von 256 µg/ml erhöht war. Als man pMG252 auf sensible Stämme übertrug, stieg der MHK-Wert ebenfalls um das 8 – 64fache an, erreichte aber aufgrund des niedrigen MHK-Ausgangswerts keine klinische Resistenz bei Fluorchinolonen, bei Nalidixinsäure jedoch schon (MARTINEZ-MARTINEZ et al. 1998).
Verursacht wurde die von MARTINEZ-MARTINEZ et al. (1998) entdeckte Chinolon- bzw. Fluorchinolonresistenz durch das vom Plasmid kodierte Protein Qnr(quinoloneresistance)A. QnrA besteht aus 218 Aminosäuren und ist Teil einer über 500 Mitglieder umfassenden Proteinfamilie, deren Pentapeptidwiederholungen ihr als Erkennungsmerkmal dienen (TRAN u. JACOBY 2002; VETTING et al. 2006).
QnrA kann an die Gyrase als ganzes Enzym aber auch an die jeweilige Untereinheit binden, ein ternärer Antibiotikum-Enzym-DNA-Komplex ist dafür nicht notwendig.
Das heißt, Qnr bindet unabhängig vom Antibiotikum sowohl an die Gyrase als auch an die Topoisomerase IV. Es vermindert die Bindung der Chinolone an die DNA- Enzymkomplexe, sodass Transkription, Replikation und Rekombination der Bakterienzelle nicht durch die Anwesenheit von Chinolonen gestört oder unterbrochen werden können. Bindet QnrA an die Gyrase, verändert sich die
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17 Konformation der Tasche des Enzyms, in die das Antibiotikum bindet. Dadurch
„erkennt“ das Antibiotikum die Bindungsstelle nicht mehr. Ebenso wird durch die Bindung des Proteins die durch die Chinolone inhibierte Supercoiling-Aktivität der Gyrase wieder rückgängig gemacht. Die Bereitstellung von Energie in Form von ATP ist für die Aktivität von QnrA nicht notwendig (TRAN et al. 2005b, a).
Konjugative Plasmide, die für QnrA kodieren, tragen sowohl Transposons als auch Integrons. Außer für Fluorchinolone kodieren sie auch für weitere Antibiotikaresistenzen. Zu den betroffenen antibakteriellen Substanzen gehören Aminoglykoside, β-Lactame, Chloramphenicol und Sulfonamide (NORDMANN u.
POIREL 2005). Zudem verfügen die Plasmide über ein sehr großes Wirtsspektrum vor allem innerhalb der Familie der Enterobacteriaceae. Zu den identifizierten Trägern gehören: Citrobacter freundii, C. koseri, Enterobacter aerogenes, E.
amnigenus, E. cloacae, E. sakazakii, E. coli, Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, Salmonella enterica und Shigella dysenteria um nur einige betroffene Stämme zu nennen (DRLICA et al. 2009). Die Qnr-tragenden Isolate stammen von mehreren Kontinenten, Europa, Asien und Amerika (NORDMANN u. POIREL 2005).
Abgesehen von der Resistenz, die über die Funktion von QnrA vermittelt wird, gibt es zwei weitere Formen der plasmid-vermittelten Resistenz.
Das Chinolon-acetylierende Aac-Ib-cr-Enzym führt eine Inaktivierung von Ciprofloxacin herbei, indem eine Substitution des Nitrogenatoms des C7- Piperazinrings durch einen Acetylrest erfolgt. Norfloxacin, das ebenfalls über einen unsubstituierten Piperazinring verfügt, wird ebenfalls inhibiert. Fluorchinolone wie Enrofloxacin, das über einen substituierten Piperazinring verfügt, sind demnach nicht betroffen (ROBICSEK et al. 2006a; ROBICSEK et al. 2006b).
YAMANE et al. (2008) entdeckten ein neues Effluxpumpenprotein genannt QepA, das ebenfalls Fluorchinolonresistenzen fördert. Zu den betroffenen Fluorchinolonen gehören die hydrophilen antibakteriellen Substanzen Nor- und Ciprofloxacin (PERICHON et al. 2007).
Von den vorgestellten plasmidvermittelten Resistenzursachen bewirkt das Protein Qnr die höchste Steigerung der MHK-Werte (bis zu 250fach), danach folgt das QepA-Protein mit einer bis zu 10fachen Steigerung (PERICHON et al. 2007), aber
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mit einer niedrigen Prävalenz von unter 1 % aus humanen Isolaten zwischen 2002 und 2006 in Japan (YAMANE et al. 2008) und 2007 in Frankreich (CATTOIR et al.
2008). Die geringste Auswirkung auf eine Resistenzausbildung hat das Enzym Aac- Ib-cr, das lediglich eine bis zu vierfache Erhöhung des MHK-Werts erwirken kann (ROBICSEK et al. 2006b).
2.2.4 Mutant Prevention Concentration-/Mutant Selection Window-Hypothese Die minimale Hemmkonzentration (MHK) beschreibt die niedrigste Konzentration einer antimikrobiellen Substanz, die eine Erregervermehrung in vitro gerade noch verhindert.
Die Sensibilität oder Resistenz eines Bakteriums im Hinblick auf die Behandelbarkeit einer Infektion wird festgestellt, indem das Ergebnis der MHK-Testung mit einem zuvor zentral etablierten klinischen Breakpoint verglichen wird. Dieser entsteht durch die Vereinigung pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Daten der jeweiligen antimikrobiellen Substanz mit dem betroffenen Bakterium (BLONDEAU 2009). Einbezogen werden „(i) die in-vitro-Aktivität einer Substanz; (ii) die erreichbaren und verträglichen Konzentrationen im Wirt; (iii) Daten über Verteilung und Elimination; und (iv) die Toxizität des Medikaments“ (BLONDEAU 2009).
Erreicht der MHK-Wert eine dem klinischen Breakpoint entsprechende oder höhere Konzentration, gelten die Bakterien als klinisch resistent und die Therapie hat mit hoher Wahrscheinlichkeit unter Anwendung des Antibiotikums keinen Erfolg (EUCAST 2013). Der MHK-Wert des jeweiligen Bakterienstammes wird unter Laborbedingungen festgestellt. Dabei werden 105 Bakterien bzw. Kolonie bildende Einheiten (CFU) pro ml getestet.
ZHOU et al. (2000) untersuchten an Wildtypstämmen von Mycobacterium smegmatis und Mycobacterium tuberculosis die Entstehung von Resistenzen gegen Fluorchinolone. Dazu wurden die sensiblen Bakterien auf fluorchinolonhaltigen Agarplatten ausgestrichen und Nucleotidsequenzen der darauf gewachsenen Kolonien analysiert. Bei gering konzentrierten Fluorchinolonstufen wurden nur Low- Level-Resistenzen gefunden, die meisten Bakterien enthielten sogenannte Non-
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19 Target-Resistenzen. Dabei handelt es sich um Resistenzen, die sich nicht in den Zielenzymen Gyrase oder Topoisomerase IV entwickeln, mehr als die Hälfte dieser Low-Level-Isolate waren multiresistent. Mit ansteigenden Fluorchinolon- konzentrationen wurde eine zunehmende Anzahl von Resistenzen, verursacht durch Mutationen in gyrA, sogenannten Target-Resistenzen detektiert. Noch höhere Konzentrationen des Antibiotikums im Agar reduzierten die Anzahl der Kolonien auf diejenigen mit höheren Resistenzen.
Auf den Agarplatten mit niedrigen Antibiotikastufen entwickelten sich nur Low-Level- Resistenzen. Es wurden keine High-Level-Resistenzen detektiert, die, wie im vorherigen Unterpunkt des Kapitels erläutert, durch Mehrfachmutationen in Gyrase und Topoisomerase IV verursacht werden.
PAN et al. (1996) erläutert ähnliche Vorgänge bei der Entstehung Ciprofloxacin- resistenter Stämme von Streptococcus pneumoniae, die ebenfalls durch Anzucht auf Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen Ciprofloxacin hergestellt wurden.
Die Sequenzierung der QRDR aus isolierten Kolonien erfolgte mittels PCR. Auch hier wurden auf den Platten mit den niedrigeren Konzentrationen Low-Level-Resistenzen ohne Mutationen in einem der beiden Enzyme gefunden. Erst bei Second-Step- Mutationen wurden genetische Veränderungen in parC der Topoisomerase IV gefunden, was auch darauf schließen lässt, dass es sich bei der Topoisomerase um das primäre Ziel der Fluorchinolone in Streptococcus pneumoniae handelt. Auch hier trat keine High-Level Resistenz auf. Diese wurde erst im dritten und vierten Schritt durch zusätzliche Mutationen in gyrA und gyrB erreicht.
Fazit aus den beiden Studien ist, dass bei initialen niedrigen Konzentrationen auf Non-Target-Resistenzen selektiert wird, während erst bei nachfolgenden höheren Antibiotikamengen eine Selektion auf Target-Resistenzen erfolgt (PAN et al. 1996;
ZHOU et al. 2000; DRLICA et al. 2009). Sowohl PAN et al. (1996) als auch ZHOU et al. (2000) nutzten höhere Bakterienzahlen als bei den MHK-Bestimmungen unter Standardbedingungen vorgegeben, was die These von DONG et al. (1999) bestätigt, dass die Wahrscheinlichkeit auftretender mutierter Subpopulationen mit der Bakterienzahl steigt. Sowohl DONG et al. (1999) als auch ZHOU et al. (2000) beobachteten den Effekt, dass bei einer Bakterienanzahl von mehr als 105 CFU, die
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steigenden Fluorchinolonkonzentrationen ausgesetzt war, zwei starke Gefälle (rapide Reduktionen) in der Bakterienanzahl bei unterschiedlichen Konzentrationen auftraten. Das erste trat im Bereich der MHK auf, die DONG et al. (1999) dem Wildtyp zusprachen. Es wurde eine Konzentration erreicht, unter deren Anwesenheit der Stamm ohne Mutation nicht mehr lebensfähig war. Unter den nächst höheren ansteigenden Fluorchinolonkonzentrationen trat eine graduierte Abnahme der Kolonie bildenden Einheiten auf und bildete dann eine Art Plateau. Dieses wies Mutanten auf, die nach Untersuchung ihrer Sequenzen je nach Bakterienart und primärem Zielenzym Mutationen in GyrA (M. bovis) oder ParC (S. aureus) zeigten.
Bei S. aureus wurden aber auch lebensfähige Kolonien ohne Veränderungen in der QRDR isoliert.
Das zweite Gefälle trat im Bereich derjenigen Fluorchinolonkonzentrationen auf, die fähig waren, die sogenannten First-Step-Mutanten zu inhibieren. Diese Konzentration stellt die Mutant Prevention Concentration (MPC) dar (DONG et al. 1999).
Wenn Konzentrationen darüber hinausgehen, erfordert die Lebensfähigkeit der resistenten Kolonien weitere Mutationen, was laut DRLICA et al. (2009) selten vorkommt. Bei niedrigeren Konzentrationen, die unter der MHK der jeweiligen Bakterienstämme liegen, entwickeln sich sensible und mutierte Kolonien nebeneinander, da kein Selektionsvorteil besteht. Erhöhen sich die Antibiotikamengen aber soweit, dass sie über der MHK aber unter dem MPC liegen, haben die mutierten Kolonien einen Vorteil und können sich vermehren. Der Bereich zwischen MHK und MPC, in dem Kolonien mit First-Step-Mutationen überleben können bzw. selektiert werden, wird das Mutant Selection Window (MSW) genannt (DRLICA et al. 2009) (Abbildung 2-3).
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Abbildung 2-3: Schematische Darstellung des Mutant Selection Windows nach Gabe eines Fluorchinolons. Cmax =Maximalkonzentration im Gewebe, MIC=Minimale Hemmkonzentration (MHK), MPC=Mutant Prevention Concentration. Abbildung aus DRLICA u. ZHAO (2007).
2.3 Enrofloxacin
Enrofloxacin wurde ausschließlich für die Veterinärmedizin entwickelt (ANADON et al. 1995); es handelt sich um ein Chinolon der zweiten Generation (PAPICH u.
RIVIERE 2009).
Es handelt sich um ein Breitbandantibiotikum, sein Wirkungsspektrum umfasst gram- negative sowie gram-positive Bakterien und Mykoplasmen (SCHEER 1987).
Enrofloxacin ist in der EU-Verordnung 37/2010 in Tabelle 1 gelistet und damit zur Anwendung bei Tieren, die der Lebensmittelgewinnung dienen zugelassen, nicht jedoch bei Tieren, deren Eier für den menschlichen Verzehr bestimmt sind.
Aufgrund seiner guten Wasserlöslichkeit hat sich die Anwendung von Enrofloxacin über Tränkwasser bewährt und es sind Formulierungen zur Gabe über das Tränkwasser im Handel erhältlich (KNOLL et al. 1999). Aufgrund dessen eignet es sich für die Behandlung von Beständen und findet beim Wirtschaftsgeflügel vor allem Anwendung bei der Behandlung von Colibacillose, Pasteurellose und Infektionen mit Mykoplasmen (BAUDITZ 1987). Es wird ebenso bei Schweinen, Rindern, Haus- und
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Heimtieren eingesetzt (BAUDITZ 1988). Sind Resistenzen gegen andere Chinolone vorhanden, darf Enrofloxacin nicht appliziert werden, da unter den Chinolonen „…
eine nahezu vollständige, gegenüber anderen Fluorchinolonen eine komplette Kreuzresistenz besteht.“ (BAYTRIL® 10 % ORALE LÖSUNG 2013).
Enrofloxacin wird teilweise zu Ciprofloxacin metabolisiert; dies erfolgt über eine N- Deethylierung in der Leber (TYCZKOWSKA et al. 1989) (Abbildung 2-4). Bei Ciprofloxacin handelt es sich ebenfalls um ein Fluorchinolon der zweiten Generation, das nur in der Humanmedizin verwendet wird.
Abbildung 2-4: Enrofloxacin und sein aktiver Metabolit Ciprofloxacin nach TON et al. (2012).
2.3.1 Pharmakokinetik von Enrofloxacin in Broilern
2.3.1.1 Absorption nach oraler Applikation
Enrofloxacin wird sowohl nach parenteraler als auch nach oraler Applikation schnell absorbiert (SCHEER 1987).
KNOLL et al. (1999) detektierten mittels HPLC nach einmaliger oraler Applikation mittels Kropfsonde an Broiler innerhalb von 1,5 Stunden einen Konzentrationspeak von 1,9 µg/ml Plasma. Die orale Bioverfügbarkeit lag bei 89,2 %. Im Vergleich dazu haben ANADON et al. (1995) nach 1,6 Stunden eine Maximalkonzentration von 2,44 µg/ml Plasma gemessen mit einer oralen Bioverfügbarkeit von nur 64 %.
ANADON et al. (1995) selbst nannten als eine mögliche Ursache für die niedrige
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23 Bioverfügbarbeit die Determinierung der Plasmakonzentrationen über einen mikrobiologischen Assay.
Der Metabolit Ciprofloxacin war nur in geringem Umfang verfügbar und wurde bis maximal 0,07 µg/ml Plasma detektiert. Der aktive Metabolit zeigte zum Teil so niedrige Konzentrationen, dass er nicht mehr quantifiziert werden konnte (LOQ = 0,02 µg/ml) (KNOLL et al. 1999). Dies deckt sich mit den Ergebnissen von GARNIÈRE et al. (1997).
Nach kontinuierlicher Applikation über das Tränkwasser wurden durchschnittliche Konzentrationen von 0,5 µg Enrofloxacin/ml am dritten Tag der Behandlung erreicht.
Auch hier war die Konzentration von Ciprofloxacin sehr niedrig und nicht durchgängig quantifizierbar (KNOLL et al. 1999).
Die Mean Residence Time betrug bei KNOLL et al. (1999) 7,6 Stunden, die Eliminationshalbwertszeit 5,8 Stunden. Erfolgte die Applikation von Enrofloxacin mit dem Futter, verlängerte sich die Eliminationshalbwertszeit, beeinflusste die Verfügbarkeit aber nicht wesentlich (ANADON et al. 1995).
2.3.1.2 Metabolismus
Enrofloxacin wird durch eine Deethylierung der Ethylgruppe am Piperazinring in Ciprofloxacin umgewandelt. Abgesehen von Ciprofloxacin entstehen noch andere Metaboliten, die aber nicht über antibakterielle Eigenschaften verfügen (TYCZKOWSKA et al. 1989; PAPICH u. RIVIERE 2009). In Hühnern wird nur ein geringer Anteil zu Ciprofloxacin umgewandelt (ANADON et al. 1995, KNOLL et al.
1999), ausgeschieden wird Enrofloxacin über die Faeces hauptsächlich als unmetabolisiertes Enrofloxacin und seinen Metaboliten Ciprofloxacin (WU et al.
2005).
2.3.1.3 Exkretion
Die Exkretion der Fluorchinolone erfolgt in erster Linie über die Niere durch glomeruläre Filtration und tubuläre Sekretion, dadurch werden hohe
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Fluorchinolonkonzentrationen im Urin erreicht. Die Ausscheidung über die Galle erfolgt lediglich sekundär (SÁRKÖZY 2001). Die Exkretion ist jedoch speziesabhängig und variiert in ihren prozentualen Anteilen. Über die Exkretion bei den aviären Spezies ist bisher in der Literatur wenig zu finden.
2.3.1.4 Plasmaproteinbindung und Verteilung
Die Plasmaproteinbindung von Enrofloxacin im Serum von Broilern ist mit 20 – 25%
gering (BUGYEI et al. 1999; ABD EL-AZIZ et al. 1997).
Fluorchinolone verfügen über eine gute Gewebepenetration und gehen aufgrund ihrer Fettlöslichkeit in den Intrazellularraum über (PAPICH u. RIVIERE 2009). Dies gilt ebenfalls für Makrophagen und neutrophile Granulozyten, wo sie im Cytosol sehr hohe Konzentrationen erreichen und damit fähig sind, intrazelluläre Krankheitserreger zu erreichen und zu eliminieren (CARLIER et al. 1990; HAWKINS et al. 1998).
Aufgrund dieser Fähigkeit sind Fluorchinolone in höheren Konzentrationen in entzündeten Geweben zu detektieren als in gesunden Geweben (PAPICH u.
RIVIERE 2009).
Die höchsten Konzentrationen von Enrofloxacin in Geflügel wurden nach fünf Tagen oraler Behandlung in Lunge, Leber und Nieren, die niedrigste Konzentration im Gehirn nachgewiesen. Drei Tage nach Behandlungsende konnten in den Geweben kein Cipro- und Enrofloxacin mehr detektiert werden (ABD EL-AZIZ et al. 1997).
2.3.2 Pharmakodynamik/Pharmakokinetik von Enrofloxacin
Fluorchinolone sind bakterizid und in ihrer Wirkung abhängig von der jeweiligen Konzentration des Antibiotikums. Aufgrund dessen sind sie fähig über einen weiträumigen Konzentrationsbereich Bakterien in ausgedehntem und konzentrationsabhängig ansteigenden Maß abzutöten, was auch einen verlängerten postantibiotischen Effekt (antibakterielle Wirkung dauert nach Elimination des
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25 Antibiotikums aus der Umgebung des Erregers weiter an) nach sich zieht (WRIGHT et al. 2000).
Um sicherzustellen, dass ein Antibiotikum erfolgreich eingesetzt werden kann, werden mehrere Parameter herangezogen, die sowohl pharmakokinetischer als auch mikrobiologischer Natur sind. Dazu gehören die maximale Konzentration (Cmax) im Serum, die Area Under the Curve (AUC) bezogen auf die Serumkonzentration, die nach Dosierung im 24 Stunden-Intervall auftritt und die minimale Hemmkonzentration des jeweiligen Erregers. Um eine Dosis zu bestimmen, die Erfolg verspricht, kann entweder das Verhältnis Cmax/MHK oder AUC24/MHK eingestellt werden (LODE et al.
1998; WRIGHT et al. 2000). Um auch mutierte Bakterien abzutöten, sollten Cmax/MHK-Verhältnisse von mehr als 10:1 erreicht werden (BLASER et al. 1987;
DRUSANO et al. 1993; LODE et al. 1998). Für gram-negative Bakterien wird ein AUC24/MHK-Verhältnis von mehr als 125 bei Menschen und Tieren benötigt, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen (MEINEN et al. 1995). Welches Verhältnis letztendlich verwendet wird, ist abhängig von der jeweiligen Situation, vom jeweilig eingesetzten Fluorchinolon und dem betroffenen Pathogen (WRIGHT et al. 2000), Gram-negative Enterobacteriaceae haben niedrige MHK-Werte, sind also sehr sensibel für Fluorchinolone.
2.3.3 Resistenzvorkommen kommensaler E. coli im Wirtschaftsgeflügel
Die Antibiotikaleitlinien der Bundestierärztekammer (BTK) führen aus, dass jeder Einsatz von Antibiotika z. B. in der Humanmedizin und Veterinärmedizin zur Entwicklung von Resistenzen führen kann. Die Risiken steigen mit ungezielten Einsätzen, subtherapeutischen Dosierungen sowie verlängerten, wiederholten und bestandsweisen Anwendungen (BTK 2010). Ebenso wird zu bedenken gegeben, dass bei jedem Antibiotikaeinsatz nicht nur die entsprechenden pathogenen Keime exponiert werden, sondern auch die physiologische Bakterienflora einem Selektionsdruck ausgesetzt wird (BTK 2010). Liegen Konzentrationen unter der MHK des jeweilig zu bekämpfenden Keims (subtherapeutische Konzentration), können sich aufgrund des mangelnden Selektionsvorteils mutierte Keime neben Bakterien
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mit unveränderter Sensibilität entwickeln. Werden dann antimikrobiell wirksame Konzentrationen erreicht, die über der MHK liegen, werden die mutierten Keime heraus selektiert (DRLICA et al. 2009).
Das Bundesinstitut für Risikobewertung hat 2012 eine Übersicht über die Resistenzsituation eingesandter und selbst beschaffter Isolate aus dem Jahr 2009 erstellt. Zum einen stammten die Isolate aus einem Zoonosen-Monitoring und wurden gemäß der AVV Zoonosen Lebensmittelkette und der Bekämpfungsprogramme (VO (EG) Nr. 2160/2003) gewonnen. Zu den getesteten Bakterien gehörten Campylobacter, kommensale E. coli und verotoxinbildende E. coli (VTEC), Salmonellen und der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus. Zum anderen wurden Isolate miteinbezogen, die dem Nationalen Referenzlabor (NRL) zu diagnostischen Zwecken zur Verfügung gestellt wurden. Die Proben stammten sowohl aus Tieren, als auch aus Lebens- und Futtermitteln sowie aus der Umwelt.
Die Isolate der kommensalen E. coli stammten aus vier verschiedenen wirtschaftlichen Tierhaltungen. Beprobt wurden Legehennen, Masthähnchen, Milchrinder und Mastkälber.
Die Isolate der Legehennen wiesen zu 40 % Resistenzen gegen verschiedene Antibiotika auf, angeführt von Ampicillin, Sulfamethoxazol und Tetrazyklin. Auch Resistenzen gegen Nalidixinsäure und Ciprofloxacin im Bereich von 8-12 % wurden detektiert, obwohl keinerlei Chinolone zur Behandlung von Legehennen zugelassen sind.
Beim Masthähnchen wurden 84,7 % der Keime als resistent eingestuft, 72,8 % davon gegen mehrere Antibiotika. 41-43 % der Isolate zeigten Resistenzen gegen Chinolone (SCHROETER et al. 2012).
KMET u. KMETOVA (2009) untersuchten von 2006 bis 2008 gesammelte E. coli- Isolate, die von klinisch gesunden Broilern unterschiedlicher Betriebe in der Slowakei stammten, auf Chinolon- und Fluorchinolonresistenzen. 2006 sahen die Prozentzahlen der resistenten Isolate folgendermaßen aus: 85 % waren resistent gegen Nalidixinsäure, 54 % gegen Ciprofloxacin und 42 % gegen Enrofloxacin. 2007 zeigten sich etwas geringere Prozentzahlen, 2008 stiegen sie wieder etwas an: 86 %
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27 Resistenzen gegen Nalidixinsäure, 41 % gegen Ciprofloxacin und 31 % gegen Enrofloxacin (KMET u. KMETOVA 2009).
Außer bei E. coli konnten auch in anderen gram-negativen Spezies u.a. auch in der Humanmedizin starke Zunahmen der Fluorchinolonresistenzen zum Beispiel bei Campylobacter jejuni und Campylobacter coli detektiert werden (GOLDSTEIN u.
ACAR 1995), sowie unter anderem bei Pseudomonas aeruginosa (NEUHAUSER et al. 2003).
2.4 Verschleppungsproblematiken in der Tierhaltung
Wie in den Antibiotikaleitlinien erläutert, besteht das Risiko der Resistenzbildung bei jedem Einsatz von Antibiotika. Auch wird die Steigerung der Gefahr der Resistenzbildung unter anderem durch subtherapeutische Konzentrationen, Bestandsbehandlungen und verlängerte oder wiederholte Behandlungen erhöht (BTK 2010). Subtherapeutische Konzentrationen lassen sich aufgrund mehrerer Faktoren nicht immer verhindern, einer der Gründe stellt die Verschleppung dar, die mehrere Ursachen haben kann.
2.4.1 Verschleppung subtherapeutischer Konzentrationen über das Tränkwasser
Infolge der arbeitsteiligen Tierproduktion unter Verwendung großer Tierzahlen spielt die medikamentöse Behandlung der Bestände über Futter und Wasser mittlerweile eine tragende Rolle (KAMPHUES 1996).
In einer Dissertation aus dem Institut für Lebensmitteltoxikologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden Tränkanlagen in Broiler- und Putenmastbetrieben auf Rückstände von Arzneimitteln untersucht. Insgesamt wurde die Studie in 23 Betrieben durchgeführt, in 2 Putenmastbetrieben fielen die Proben positiv aus, es wurden subtherapeutische Mengen von Oxytetrazyklin und Enrofloxacin im Tränkwasser nachgewiesen (KOGELHEIDE 2007).
Im Jahr 2012 führte das Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen eine Untersuchung durch, die sich mit Antibiotikarückständen
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im Tränkwasser aus Hühner- und Putenmastställen befasste. Eingebunden wurden 42 Ställe aus 40 Betrieben. Es wurden 1 bis 3 Wasserproben an „einmischnahen“
und „-fernen“ Lokalisationen des Tränksystems entnommen. In 62 % der Betriebe wurden Antibiotikarückstände detektiert, in vielen Fällen wurden verschiedene Wirkstoffe gleichzeitig nachgewiesen. Darunter war auch Enrofloxacin in minimalen Dosen (LANUV 2012). Laut diesem Bericht besteht zusätzlich aufgrund der Beschaffenheit der Tränksysteme die Gefahr eines Arzneimittelübertrags aus dem medikierten Tränkwasser in die Umgebung z. B. in die Einstreu, sodass die Möglichkeit einer Aufnahme subtherapeutischer Antibiotikakonzentrationen durch die Tiere vom Boden erfolgen kann (LANUV 2012). Laut KAMPHUES (1996) können zwischen dem gemessenen Tränkwasserverbrauch und der tatsächlichen Wasseraufnahme durch ein Tier Differenzen von 20 bis 30 % liegen. Diese Aussage bezieht sich auf die Medikation von Schweinen, nicht von Masthähnchen, sodass sich die Prozentzahlen voneinander unterscheiden können. Die Differenz ist immens und wirft Fragen nach dem Verbleib des Wassers auf. Es liegt nah, dass unter diesen Umständen eine Verteilung in den Stall stattfinden kann, die wiederum eine Aufnahme subtherapeutischer Dosen aus der Umgebung ermöglichen kann.
Zusätzlich führt die geringere Aufnahme von medikiertem Wasser durch das Tier zu einer Unterschreitung der gewünschten Konzentration im Körper.
WANNER (1993) wiederum zeigte auf, dass die allgemeine Annahme, dass durch kranke Tiere zwar keine regelmäßige Futteraufnahme erfolgt, dafür aber die Aufnahme von Tränkwasser im normalen Bereich liegt, nicht allgemein gültig ist. Das heißt, trinken erkrankte Tiere in einem Bestand nicht mehr ausreichend, nehmen sie geringere Konzentrationen des Arzneimittels in den Körper auf.
2.4.2 Verschleppung über Einstreu, Staub und Aerosole
Ein Jungmasthuhn scheidet in 40 Tagen ca. 4,5 kg Kot aus (SIEGMANN u.
NEUMANN 2012a). Abhängig von der Anzahl der eingestallten Tiere und der Länge des jeweiligen Mastdurchganges sammelt sich eine erhebliche Menge Kot im Stall an. Wird also eine Behandlung über Tränkwasser im Geflügelbetrieb durchgeführt,
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29 gelangen Wirkstoffe und ihre Metaboliten über die Fäkalien in die Einstreu.
SIEGMANN u. NEUMANN (2012b) beschreiben, dass am Beispiel des Fluorchinolons Enrofloxacin gezeigt werden konnte, dass Hühner in Bodenhaltung, im Vergleich zu Tieren in Käfigen höhere Wirkstoffmengen aus der Einstreu wieder aufnehmen können.
Bioaerosole sind in großen Anteilen in Geflügelställen vertreten. Sie bestehen aus Agglomeraten belebter und unbelebter Partikel in der Luft, Mikroorganismen stellen den belebten und Staub den unbelebten Anteil dar. 80% der Mikroorganismen, die über die Luft übertragen werden, nutzen unbelebte Partikel als Vehikel und bilden ein sogenanntes Konglomerat (MÜLLER et al. 1977; SEEDORF u. HARTUNG 2002).
Aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzungen weisen Bioaerosole unterschiedliche Eigenschaften auf, abgesehen von Infektiosität und Toxizität können sie je nach Inhaltsstoff auch pharmakologische Wirkungen entfalten (SEEDORF u.
HARTUNG 2002).
Staub, der aus Geflügelstallungen stammt, ist aus Bestandteilen von Hautschuppen, Federpartikel, Fäkalien, Futter und Einstreu zusammengesetzt (HARTUNG u.
SPINDLER 2012) und dementspreched organischer Natur. Der Proteingehalt im Stallstaub aus Geflügelbetrieben kann auf einen Wert von bis zu 50 % steigen (HARTUNG 1995). FEDDES et al. (1992) detektierten Fäkalien als Hauptanteil luftgetragener Stäube in Putenställen, bestehend aus Harnsäurekristallen und unverdautem Futter.
Geraten Fäkalien in Form von Staub in die Luft, gilt dies ebenfalls auch für die in ihnen enthaltenen Wirkstoffe.
HAMSCHER et al. (2003) führten über zwei Jahrzehnte hinweg eine Studie in einem Schweinemastbetrieb durch, indem Staubproben gesammelt und anschließend auf Antibiotikarückstände untersucht wurden. In einigen Proben wurden bis zu fünf verschiedene antimikrobielle Substanzen im Milligrammbereich detektiert. Darunter waren verschiedene Tetrazykline, Sulfamethazin und andere.
Nachweisbare Antibiotika im Stallstaub weisen auf eine Verteilung subtherapeutischer Konzentrationen in der direkten Umgebung der Tiere hin. ELLIOT et al. (1994), KIETZMANN et al. (1995) und ZESSEL (2012) konnten zeigen, dass
Literaturübersicht
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unbehandelte Schweine, die in einen Stall verbracht wurden, der nach vorheriger Medikation einer Tiergruppe mit Sulfonamiden trocken gereinigt wurde, Rückstände der Antibiotika in Plasma und Urin aufwiesen. Damit wurde aufgezeigt, dass Tiere in der Umgebung verteilte Kontaminationen und damit subtherapeutische Konzentrationen aufnehmen.
Um zu überprüfen, inwiefern aufgenommene Rückstände Auswirkungen auf die E. coli der physiologischen Darmflora haben, wurden in dieser Dissertation Verschleppungsszenarien mit Enrofloxacin als Testsubstanz am Modell des Huhns simuliert.
