3 MATERIAL UND METHODEN
3.4 Methoden
3.4.1 Versuchsübersicht
3.3.1 Puffer
Citratpuffer (pH 3,0) 0,01 mol/l Citronensäuremonohydrat: 1,80 g/l Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat: 0,43 g/l
3.4 Methoden
3.4.1 Versuchsübersicht
In einer Serie von In-vivo-Experimenten wurden Junghennen modellhaft verschiedene Konzentrationen von Enrofloxacin verabreicht. Dazu gehörten die therapeutische Dosierung über Tränkwasser als auch subtherapeutische Konzentrationen sowohl über Tränkwasser als auch Futter. Dies diente zur Simulation der Aufnahme von Arzneimittelrückständen aus der direkten Umgebung der Tiere (Verschleppungsszenarien). Der Gehalt von Enrofloxacin und seinem aktiven Metaboliten Ciprofloxacin wurde im Plasma der Tiere bestimmt. Zusätzlich fand eine Messung der Konzentrationen der antibakteriellen Substanzen in Stallaerosolen und Sedimentationsstäuben statt.
Im Anschluss daran wurden in einem weiteren Versuch wiederum verschiedenen Hühnergruppen sowohl therapeutische Dosierungen als auch subtherapeutiche Konzentrationen Enrofloxacin zur Simulation von Verschleppungen über das Tränkwasser verabreicht. Die Einflüsse der verabreichten Enrofloxacindosierungen auf das Resistenzgeschehen in der physiologischen Darmflora wurden im Versuchsverlauf getestet. Dazu wurden den Tieren regelmäßig Kloakentupfer entnommen, aus denen E. coli-Kolonien isoliert und deren minimale Hemmkonzentrationen bestimmt wurden.
Die In-vivo-Experimente, durchgeführt an Legehennen, waren gemäß des Aktenzeichens 33.9 – 42502-04-11/0338 genehmigt.
Material und Methoden
35 3.4.2 Plasmakonzentrationen von Enro- und Ciprofloxacin und die Verteilung
der Analyten in der Umgebung
3.4.2.1 Versuchstiere
Insgesamt wurden 64 Junghennen für die vorliegende Arbeit eingesetzt. Sie stammten aus der Geflügelzucht Zahrte aus Wrestedt und wurden im Alter von 20 Wochen eingestallt.
Die Tiere, die der Messung von Plasmakonzentrationen dienten, wurden im Tierstall des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie untergebracht. Die Hennen wurden in Gruppen à 12 Tiere in Bodenhaltung gehalten. Die Fütterung erfolgte mit handelsüblichem Legemehl ad libitum. Tränkwasser stand ebenfalls ad libitum über eine Stülptränke zur Verfügung. Alle Tiere waren zum Zeitpunkt der Versuche klinisch gesund.
Der Stall in dem die Tiere untergebracht wurden, bemaß sich auf eine Größe von 45 m². Der Bereich, in dem die Hühner gehalten wurden, besaß eine Größe von 5,6 m². Die Beleuchtungsdauer betrug 14 Stunden. Zusätzlich zur künstlichen Beleuchtung fiel Tageslicht durch die im Raum angebrachten Fenster. Der Stall wurde über ein Lüftungssystem belüftet, die Temperatur schwankte zwischen 18° C und 19,5° C.
3.4.2.2 Versuchsdurchführung Orale Medikation mittels Kropfsonde
Um die Konzentrationsverläufe von Enro- und Ciprofloxacin im Plasma zu messen, wurde jedem Tier in einer Gruppe von 12 Hühnern ein Bolus von 10 mg Enrofloxacin/kg KG über eine Kropfsonde verabreicht. Die individuelle Dosis wurde in Abhängigkeit vom jeweiligen Körpergewicht des Einzeltieres errechnet.
Material und Methoden
36
Orale Medikation über Tränkwasser
Eine Gruppe von 12 Legehennen wurde über das Tränkwasser, das in einer Stülptränke ad libitum zur Verfügung stand, mit unterschiedlichen Konzentrationen Enrofloxacin medikiert. Zum einen erfolgte eine Applikation mit der bestimmungsgemäßen Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht (KG), zum anderen mit geringeren Wirkstoffmengen von 0,3 mg/kg KG (3 % der therapeutischen Dosis), 1,0 mg/kg KG (10 %) und 3,0 mg/kg KG (30 %). Die subtherapeutischen Konzentrationen sollten der Simulation einer Wirkstoffverschleppung dienen. Die Behandlungsdauer betrug jeweils fünf Tage.
Während und nach der Behandlung erfolgten Entnahmen von Blutproben an den Tieren um die Plasmakonzentrationen von Enrofloxacin und seinem aktiven Metaboliten Ciprofloxacin zu bestimmen.
Zusätzlich wurden während der therapeutischen Behandlung Luftprobenahmepumpen betrieben, um den Gehalt von Enro- und Ciprofloxacin im Aerosol zu bestimmen. Sedimentationsstaubproben wurden ebenfalls gesammelt und analysiert.
Das Tränkwasser wurde alle 24 Stunden frisch zur Verfügung gestellt, das Einmischverhältnis von Baytril 10 % orale Lösung wurde entsprechend der jeweiligen Dosis und des aktuellen Verbrauchs täglich neu berechnet.
Orale Medikation über Futter
In diesem Teil der Versuche wurde das Futter der Legehennengruppe mit Enrofloxacin versetzt. Die Dosierungen betrugen 0,06 mg/kg (0,6 % der therapeutischen Dosierung), 0,2 mg/kg (2 %), 1,0 mg/kg (10 %) und 3,0 mg/kg KG (30 %). Die Behandlungsdauer betrug jeweils fünf Tage.
Alle 24 Stunden wurde den Tieren eine neue Ration medikiertes Futter ad libitum zur Verfügung gestellt. Die Menge richtete sich nach dem vor Versuchsbeginn errechneten durchschnittlichen Verbrauch.
Die folgenden Angaben beziehen sich sowohl auf die Medikation über Kropfsonde, als auch über Tränkwasser und Futter.
Material und Methoden
37 Plasmaproben:
Zur Bestimmung der Konzentrationsverläufe von Enrofloxacin und seinem aktiven Metaboliten Ciprofloxacin im Plasma unter der Behandlung, wurden jeweils drei Legehennen aus der medikierten Gruppe zu den folgenden Zeitpunkten Blutproben entnommen: 0, 2, 4, 8, 24, 48, 50, 52, 56, 72, 96, 98, 100 und 104 Stunden.
Die Proben zu den Zeitpunkten 0, 24, 48 und 96 Stunden wurden direkt vor Behandlungsbeginn des jeweiligen Tages entnommen, das heißt, vor Bereitstellung des frisch ad libitum zur Verfügung stehenden medikierten Tränkwassers bzw.
Futters.
Die Entnahme von 1 ml Blut erfolgte aus der Vena ulnaris superficialis. Das Blut wurde in einem EDTA-Röhrchen aufgefangen und im direkten Anschluss an die Blutentnahme für 10 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Das überständige Plasma wurde abgenommen und bei -20° C bis zur Analyse gelagert.
Filterstaubproben:
Um den Gehalt von Enrofloxacin und seinem aktiven Metaboliten Ciprofloxacin in den Stallaerosolen zu bestimmen, wurden sowohl während der jeweiligen Futterversuche als auch bei der Gabe der therapeutischen Dosierung über Tränkwasser zwei Luftprobenahmepumpen im Stall platziert.
Ihre Positionierung erfolgte direkt vor den Abtrennungen des Haltungsbereichs in circa 10 cm Höhe, sodass die Filterköpfe sich auf Höhe der Tiere befanden (Abbildung 3-2). Das Luftzugvolumen der Pumpen betrug 3,8 l/min bei einer Laufzeit von 8 Stunden. Die Messungen erfolgten vor Beginn der Behandlung (Zeitpunkt 0) und ab diesem Zeitpunkt jeden zweiten Tag bis eine Woche nach Behandlungsende (Abbildung 3-1).
Mit dem Ansaugsystem der Pumpen war jeweils ein Filterkopf verbunden, der einen Glasfaserfilter enthielt. Dieser wurde vor und nach dem Messintervall gewogen, um die Menge der herausgefilterten Aerosole zu bestimmen. Nach der Auswaage im Anschluss an die jeweilige Messung wurde der Filter mit einer Pinzette entnommen und in ein Becherglas überführt, das mit Parafilm verschlossen und mit Alufolie umwickelt bis zur Analytik bei -20° C dunkel gelagert wurde.
Material und Methoden
38
Um die Validität der Messungen zu überprüfen, wurde nach Ende der Messungen die Luftströmung im Messbereich der beiden Pumpen mit Strömungsprüfröhrchen sichtbar gemacht. Anschließend erfolgte die Messung der Luftgeschwindigkeiten im Messbereich mit einer Messsonde. Diese lagen unter 0,2 m/sec, wodurch ein Unterdruck in der Position der Messköpfe während der Probenahme gewährleistet war.
Abbildung 3-1: Probenentnahmeplan für die Filtration der Stallluft und die Sammlung von Sedimentationsstäuben.
Material und Methoden
39 Sedimentationsstaubproben
Um die Verteilung von Enro- und Ciprofloxacin in die Umgebung zu überprüfen, wurden sowohl zum Zeitpunkt der jeweiligen Verschleppungsversuche über Futter als auch während der therapeutischen Behandlung über Tränkwasser an zwei verschiedenen Positionen im Stall Sedimentationsstäube gesammelt. Dies erfolgte vor Behandlungsbeginn (Zeitpunkt 0) bis eine Woche nach Behandlungsende im Abstand von zwei Tagen, jeweils nach Ende der Laufzeit der Probenahmepumpen.
Mittels eines Kartenblatts wurde der Staub zusammengekehrt und in ein Probefläschchen überführt. Um die jeweilig gesammelte Menge festzustellen, erfolgte vor und nach dem Befüllen des Gefäßes mit der Staubprobe eine Auswaage.
Bis zur Extraktion wurden die Proben bei -20° C lichtgeschützt gelagert.
Wie in der Abbildung 3-2 dargestellt, befanden sich die Sammelstellen auf der Stallgasse hinter dem „Käfig“ nahe der Sitzstange in 1,35 m Höhe (tierfern) (1) und seitlich neben dem Käfig in Bodennähe (tiernah) (2).
Jede Probe wurde an einer noch unbeprobten Stelle der jeweiligen Position entnommen.
Material und Methoden
40
Abbildung 3-2: Stallraum aus verschiedenen Perspektiven (A, B).Die roten Pfeile zeigen die Sammelstellen des Sedimentationsstaubes tierfern hinter dem Käfig in 1,35 m Höhe (1), neben dem Käfig tiernah in Bodennähe (2). P kennzeichnet die jeweilige Luftprobenahmepumpe, T den Temperaturmesser.
Material und Methoden
41 3.4.2.3 Probenaufbereitung
Die Extraktion erfolgte in Anlehnung an KIETZMANN et al. (2011) und ist in Tabelle 3-1 dargestellt:
Tabelle 3-1: Extraktionsprotokoll der Plasma-, Filterstaub- und Sedimentationsstaubproben.
Int. Std.= Interner Standard, DCM = Dichlormethan.
3.4.2.4 Analytik
Die quantitative Bestimmung der Konzentrationen der Testsubstanzen Enro- und Ciprofloxacin als auch des als interner Standard (int. Std.) verwendeten Ofloxacins in den zuvor aufbereiteten Proben, erfolgte mittels Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie (HPLC). Von den zuvor extrahierten Proben wurden jeweils 100 µl Schritt
Nr.:
Plasma Filterstaub Sedimentationsstaub
1 Ausgangsmenge 0,30 ml Filtermembran
mit X mg
7 Eindampfen Bei 40° C im Heizblock mittels Druckluft.
8 Rekonstitution in 0,3 ml
Material und Methoden
42
mittels Autosampler in die HPLC-Anlage injiziert. Die Auftrennung der einzelnen Substanzen erfolgte über eine Trennsäule (CC 250/4 NUCLEODUR,100-5 C18ec, 25 cm) und die ihr vorgeschaltete Vorsäule (Vorsäule: LiChroCART® 4-4, LiChrospher® 100 RP-18e, 5 µm), die im Säulenofen (Säulenofen SpH 99, Spark Emmen) auf 40° C erwärmt wurden. Für die Detektion wurde ein Fluoreszenz-Detektor bei einer Detektionswellenlänge von 450 nm und einer Exzitationswellenlänge von 280 nm verwendet. Bei der eingesetzten mobilen Phase handelte es sich um ein Citratpuffer (pH 3,00)/Acetonitril-Gemisch in einem Verhältnis von 85:15 (V/V). Die Retentionszeiten der Testsubstanzen liegen bei Enrofloxacin bei 12 Minuten und Ciprofloxacin bei 8,5 Minuten.
Durch den Vergleich mit einer jeder Messreihe nachgestellten Kalibrationsreihe wurden die Testsubstanzen quantifiziert, wobei die Flächen unterhalb der Graphen (AUC) für die Auswertung herangezogen wurden. Die Kalibrationsreihe deckte einen Konzentrationsbereich von 0 bis 200 ng/ml ab.
3.4.2.5 Validierung der HPLC für die untersuchten Testsubstanzen
Zur Validierung der Analysemethode wurden die folgenden Parameter herangezogen: Selektivität, Linearität, Detektions- und Quantifizierungsgrenzen, Richtigkeit und Präzision.
Selektivität
Definition: „Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode, verschiedene, nebeneinander zu bestimmende Komponenten ohne gegenseitige Störung zu erfassen und sie damit eindeutig zu identifizieren…“ (KROMIDAS 2011), dafür muss die chromatographische Auflösung zwischen den die einzelnen Substanzen darstellenden Peaks in ausreichendem Maße gegeben sein. Es sollte zusätzlich sichergestellt werden, dass keine „Systempeaks“ oder „Störsubstanzen“ die Analytendetektion zur jeweiligen Retentionszeit beeinträchtigen (KROMIDAS 2011).
Dazu wurden Chromatogramme von Leermatrixproben erstellt, die mit Chromatogrammen von mit Analyten versetzten Proben verglichen wurden. Dieser
Material und Methoden
43 Vergleich ergab, dass die Selektivität bezüglich der Analyten Enrofloxacin und Ciprofloxacin gegeben ist. Es konnten keinerlei „Systempeaks“ oder
„Störsubstanzen“ detektiert werden.
Linearität
Dieser Terminus beschreibt das Verhältnis zwischen einem in einem bestimmten Messbereich detektierten Signal zu der jeweiligen Konzentration des entsprechenden Analyten (KROMIDAS 2011).
Die Linearität wurde in einem Konzentrationsbereich von 1 – 200 ng/ml anhand von 12 Konzentrationsstufen ermittelt.
Anhand der graphischen Darstellung der erhaltenen Messwerte in Abhängigkeit zur Konzentration wurde die Linearität visuell überprüft.
Während der Durchführung der Studie traten vereinzelt Proben auf, deren Konzentration die obere Detektionsgrenze und damit den linearen Teil der Kalibrationsgerade überstiegen. Diese wurden entsprechend verdünnt, sodass sie wieder im linearen Bereich lagen.
Die Linearität war für die Analyten Enro- und Ciprofloxacin im Bereich von 1 ng/ml bis 200 ng/ml gegeben.
Detektions- und Quantifizierungsgrenze
Die Detektionsgrenze (Limit of detection, LOD) oder Nachweisgrenze ist definiert als die kleinste nachweisbare Menge (DIN 32645 1994). In der Chromatographie handelt es sich um die niedrigste erkennbare Konzentration eines Analyten, die ein vom Leerwert unterscheidbares Detektionssignal ergibt und damit eine qualitative Identifikation ermöglicht (KROMIDAS 2011). Diese wurde gemäß der Kalibrationskurvenmethode nach DIN 32645 (1994) bestimmt (Tabelle 3-2).
Die Quantifizierungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) ist definiert als die niedrigste Konzentration einer Substanz, die mit vorausgesetzter Präzision und Richtigkeit gerade noch detektiert werden kann (KROMIDAS 2011). Die LOQ wurde hier gemäß Richtigkeit und Präzision nachgewiesen (Tabelle 3-2).
Material und Methoden
44
Tabelle 3-2: LOD und LOQ von Enro- und Ciprofloxacin in µg/ml.
Enrofloxacin Ciprofloxacin
LOD [µg/ml] 0,0002 0,0002
LOQ [µg/ml] 0,001 0,001
Richtigkeit
Die Richtigkeit einer Methode wird durch das Maß der Übereinstimmung zwischen dem ermittelten Wert und dem „wahren“ Referenzwert definiert (KROMIDAS 2011).
Diese Richtgröße wurde durch chromatographische Quantifizierung der höchsten (High quality control standard, HQS) und der niedrigsten (Low quality control standard, LQS) Kalibrationskonzentrationen an drei verschiedenen Tagen bestimmt.
Abweichungen vom HQS vom erwarteten Referenzwert von bis zu 15 %, sowie bis zu 20 % beim LQS, werden als geeignet eingestuft. Die untersuchten Konzentra-tionen von Enrofloxacin und Ciprofloxacin liegen innerhalb des zulässigen Bereichs und bestätigen somit die Richtigkeit der untersuchten Analytenkonzentrationen (Tabelle 3-3; Tabelle 3-4).
Tabelle 3-3: Relative Abweichungen der HQS und LQS von Enrofloxacin vom jeweiligen Referenzwert in % an 3 verschiedenen Tagen.
Enrofloxacin
HQS [%] LQS [%]
Tag 1 0,2 10,4
Tag 2 5,7 9,3
Tag 3 1,7 15,5
Tabelle 3-4: Relative Abweichungen der HQS und LQS von Ciprofloxacin vom jeweiligen Referenzwert in % an 3 verschiedenen Tagen.
Ciprofloxacin
HQS [%] LQS [%]
Tag 1 4,3 20,0
Tag 2 12,6 3,5
Tag 3 12,0 13,7
Material und Methoden
45 Präzision bzw. Reproduzierbarkeit
Die Präzision, oder auch Streuparameter, beschreibt das Maß der Streuung von Analysenergebnissen wiederholter Messungen identischer Proben (KROMIDAS 2011). Es wird zwischen der Wiederholpräzision (Intraday batch reproducibility) und der Zwischenpräzision (Interday batch reproducibility) unterschieden.
Um die Präzision bzw. die Reproduzierbarkeit zu überprüfen, wurden die HQS und die LQS an drei verschiedenen Tagen chromatographisch quantifiziert. Aus den erhaltenen Werten wurden die Wiederholpräzision (Intraday batch reproducibility) und die Zwischenpräzision (Interday batch reproducibility) bestimmt.
Laut LINDNER und WAINER (1998) waren Abweichungen der HQS bis 10 % und der LQS bis 20 % vom gemessenen Mittelwert erlaubt. Die Analyten Enrofloxacin und Ciprofloxacin lagen mit ihren prozentualen Abweichungen der HQS und der LQS vom Mittelwert im angegebenen erlaubten Bereich (HQS bis 10%, LQS bis 20%) (Tabelle 3-5).
Tabelle 3-5: Intraday- und Interday-Präzision in % von Enro- und Ciprofloxacin.
Enrofloxacin Ciprofloxacin
HQS [%] LQS HQS LQS
Intraday-Präzision 3,1 4,0 2,6 2,1
Interday-Präzision 2,9 12,9 10,3 13,6
Material und Methoden
46
3.4.3 Mikrobiologische Untersuchungen zur Resistenzentwicklung
3.4.3.1 Versuchstiere
Es wurden 40 Junghennen der Geflügelzucht Zahrte für diesen Teil der Dissertation eingesetzt. Ihr Alter betrug bei Einstallung 20 Wochen. Untergebracht wurden sie in den Tierställen der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Tiere wurden in vier Gruppen à 10 Tiere unterteilt, diese wurden in Bodenhaltung auf 3,6 m² in vier verschiedenen aber identisch aufgebauten abgeschlossenen Räumen gehalten. Jeder Raum verfügte über ein eigenes Lüftungssystem, und wurde auf 18 °C temperiert. Die Beleuchtungsdauer betrug 14 Stunden täglich.
Die Fütterung erfolgte ad libitum mit Alleinfutter für Legehennen in Mehlform, das Tränkwasser stand ebenfalls ad libitum über eine Stülptränke zur Verfügung.
3.4.3.2 Durchführung Tierversuche
Von den vier Gruppen fungierte eine als Kontrollgruppe ohne Medikation. Eine weitere Gruppe erhielt die therapeutische Dosierung von 10,0 mg/kg KG über fünf Tage, die anderen beiden wurden zur Simulation zweier Verschleppungsszenarien eingesetzt. Eine davon erhielt eine 3%ige Verschleppungsdosis (VD = 0,3 mg/kg KG), die andere eine 10%ige (1,0 mg/kg KG). Die Applikation erfolgte über einen Zeitraum von 21 Tagen. Ziel war es, den Einfluss subtherapeutischer Konzentrationen auf die physiologische Darmflora am Modell von E. coli zu testen.
Im Anschluss wurden beide Gruppen über fünf Tage therapeutisch behandelt (Abbildung 3-3). Damit wurde der Effekt einer therapeutischen Behandlung auf eine vorbelastete Darmflora beobachtet. Das medikierte Tränkwasser wurde nach dem gleichen Prinzip wie bei der zuvor beschriebenen oralen Medikation über Tränkwasser zur Erstellung der Plasmaverlaufskurven (siehe Kapitel 3.4.2.2) zubereitet und alle 24 Stunden frisch zur Verfügung gestellt.
Material und Methoden
47
Abbildung 3-3: Versuchsübersicht Resistenzentwicklung. Abgebildet sind die Behandlungspläne der vier Gruppen: A) zeigt die Kontrollgruppe, B) wurde mit der bestimmungsgemäßen Dosierung behandelt und C) und D) erhielten jeweils eine Kombination aus subtherapeutischen Konzentrationen und einer therapeutischen Behandlung im Anschluss.
3.4.3.3 Quantitative Untersuchung zur Resistenzentwicklung mittels MHK-Bestimmung
An jedem Probenentnahmetag wurde von jeweils sechs Tieren pro Gruppe eine Kloakentupferprobe entnommen. Diese wurde per Direktausstrich auf einen Endo-Agar ohne Zusatz verbracht, der anschließend 20 bis 24 Stunden bei 37° C im Brutschrank inkubiert wurde. Pro beprobtem Tier wurde demnach eine Endo-Agar-Platte beimpft.
Beim Endo-Agar handelt es sich um einen Selektivagar, der zum Nachweis und zur Isolation von E. coli und coliformen Keimen dient. Das Wachstum gram-positiver Bakterien wird durch Fuchsin und Natriumsulfit gehemmt. Die gram-negativen E. coli und Coliformen fermentieren Lactose unter Bildung von Aldehyd und Säure, die die charakteristische Rotfärbung der Kolonien und ihrer Umgebung bedingen. E. coli unterscheidet sich von den Coliformen durch einen deutlichen metallisch-grünen Glanz (Fuchsinglanz), der durch die außerordentlich starke Reaktion von E. coli
Material und Methoden
48
bedingt ist, sodass das Fuchsin auskristallisiert und den metallischen Glanz zeigt (SERANI 2006). Dies ermöglichte die Kultivierung und Isolation von E. coli und bewirkte die einfache Abnahme einzelner Kolonien (Abbildung 3-4).
Abbildung 3-4: Endo-Agar mit E. coli-Bewuchs. Der Pfeil zeigt auf eine E. coli-Kolonie mit deutlich ausgeprägtem Fuchsin-Glanz.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden pro beimpfte Endo-Agar-Platte zehn freistehende Kolonien ausgewählt. Jede dieser zehn Kolonien wurde oberflächlich mit einem Tupfer abgenommen, um den Kontakt zu anderen Kolonien zu vermeiden.
Daraufhin wurde ein steriles Flachbodenglas in einen Densimat überführt und mit steriler physiologischer Kochsalzlösung befüllt, bis das Gerät den Wert von 0 anzeigte. Anschließend wurde der Tupfer, mit dem eine freistehende E. coli-Kolonie abgenommen wurde, in die Kochsalzlösung überführt und solange in der physiologischen Kochsalzlösung (0,85 %) gerührt, bis eine Inokulum-Suspension mit einem McFarland-Standard von 0,5 erreicht war.
Material und Methoden
49 Als nächstes wurde ein steriler Tupfer in der Suspension eingeweicht und danach leicht gegen die Wand des Teströhrchens gedrückt, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Dann fand ein Ausstrich diesen Tupfers auf einem Mueller-Hinton Agar statt. Dieser wurde beimpft, indem die gesamte Oberfläche dreimal gründlich ausgestrichen wurde. Nach jedem Mal wurde die Platte um circa 60 Grad gedreht um eine gleichmäßige Verteilung des Inokulums und damit ein gleichmäßiges konfluentes Bakterienwachstum zu erreichen.
Nach etwa 15 bis 20 Minuten Wartezeit, nachdem die Agaroberfläche vollständig abgetrocknet war, wurde der Etest®-Gradientenstreifen Enrofloxacin mithilfe einer Pinzette zentral auf den beimpften Agar aufgelegt. Danach wurden die beimpften und mit Teststreifen versehenen Platten in den Brutschrank verbracht und zwischen 16 und 20 Stunden bei 37° C inkubiert.
Testprinzip Etest®
Beim Etest® handelt es sich um einen schmalen undurchlässigen Kunststoffstreifen, auf dessen Unterseite sich ein vordefinierter, exponentieller Gradient von getrocknetem und stabilen Antibiotikum, in diesem Fall das Fluorchinolon Enrofloxacin, befindet. Die nach oben zeigende Seite ist nicht beschichtet und besteht aus einer MHK-Messskala im Bereich von 0,002 bis 32 µg/ml.
Wird ein Teststreifen auf eine beimpfte Agaroberfläche übertragen, geht der auf der Kunststoffträgerfläche befindliche Antibiotikagradient auf die Agarmatrix über.
Nach der Inkubation ist das Bakterienwachstum entlang des Gradienten sichtbar und man erkennt eine symmetrische Hemmellipse entlang jeder Seite des Streifens. Der Punkt, an dem das spitze Ende der Ellipse den Streifen schneidet, entspricht dem jeweiligen MHK-Wert in µg/ml (Abbildung 3-5).
Material und Methoden
50
Abbildung 3-5: Etest® auf beimpfter Agaroberfläche. Die Ellipse mit Schnittpunkt des Teststreifens ist deutlich erkennbar. MHK = 0,125 µg/ml.
Nach Ablesung des Testergebnisses wurden von jeder Agarplatte am äußeren Rand der Ellipse nahe dem Schnittpunkt mit dem Teststreifen eine geringfügige Bakterienzahl abgetupft. Dies erfolgte mit dem oberen Stielende einer sterilen Öse.
Die Bakterien wurden in ein mit 2 ml Fluorocult-LMX-Bouillon (modifiziert nach Manafi und Osmer) befülltes Kulturröhrchen überführt. Die Inokulum-Suspension enthaltenden Gefäße wurden für 24 Stunden bei 37° C in den Brutschrank zur Inkubation verbracht.
Testprinzip Fluorocult LMX Bouillon
E. coli kann durch die Anwesenheit seiner Enzyme Galactosidase und β-D-Glucoronidase identifiziert werden. Der chromogene Inhaltsstoff der Bouillon, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-galactopyranosid, wird bei Anwesenheit der β-D-Galactosidase gespalten (Abbildung 3-6). Durch die Oxidation des Chromophors färbt sich die Lösung blau (X-Gal-Reaktion).
Material und Methoden
51
Abbildung 3-6: Ablauf der X-Gal-Reaktion von REISSBRODT (2005).
Das ebenfalls anwesende 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucoronid (MUG) wird durch die bei 94 – 96 % der E. coli-Stämme (REISSBRODT 2005) vorhandene β-D-Glucoronidase gespalten (MUG-Reaktion). Das daraus resultierende 4-Methylumbelliferon fluoresziert unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 364 nm blau.
Nach der Inkubationszeit wurden die Inokulum-Suspension enthaltenden Kulturröhrchen visuell auf den Farbumschlag überprüft, um anschließend unter einer UV-Lampe (364nm) auf Fluoreszenz getestet zu werden.
Danach wurde die beimpfte Bouillon der Kulturröhrchen jeweils mit 0,5 ml Kovacs‘
Indolreagenz überschichtet, um durch die nachfolgende Bildung eines roten Indol-Ringes im Fall von E. coli den endgültigen Identifikationsnachweis zu erbringen (Abbildung 3-7).
Material und Methoden
52
Abbildung 3-7: E. coli-Nachweis mittels Fluorocult LMX Bouillon (A,B). A: Fluoreszenz nach Ablauf der MUG-Reaktion, B: Blaufärbung nach X-Gal-Reaktion und roter Indol-Ring.
3.4.3.4 Qualitative Untersuchung der E. coli auf klinische Resistenz mittels Anreicherung
Nachdem am jeweiligen Probenentnahmetag quantitative Untersuchungen der Resistenzentwicklung stattgefunden haben, erfolgte in Anlehnung an das Versuchsprotokoll gemäß der persönlichen Mitteilung von Frau Dr. A. Friese und Herrn Prof. Dr. U. Rösler (Berlin, Institut für Tier- u. Umwelthygiene, 26. April 2012) eine qualitative Untersuchung auf die Anwesenheit von – gegen Enrofloxacin -
Nachdem am jeweiligen Probenentnahmetag quantitative Untersuchungen der Resistenzentwicklung stattgefunden haben, erfolgte in Anlehnung an das Versuchsprotokoll gemäß der persönlichen Mitteilung von Frau Dr. A. Friese und Herrn Prof. Dr. U. Rösler (Berlin, Institut für Tier- u. Umwelthygiene, 26. April 2012) eine qualitative Untersuchung auf die Anwesenheit von – gegen Enrofloxacin -