4 ERGEBNISSE
4.3 Resistenzentwicklung von E. coli im Darm vom Huhn unter Einwirkung von
Um zu überprüfen, wie sich aufgenommene geringe Konzentrationen Enrofloxacin auf die physiologische Darmflora auswirken, wurden vier Gruppen Junghennen (n=10) mit unterschiedlichen Dosierungen Enrofloxacin behandelt:
Gruppe A fungierte als Kontrollgruppe, Gruppe B erhielt die bestimmungsgemäße Dosierung über fünf Tage. Gruppe C und D wurden zur Simulation einer Verschleppung über die direkte Umgebung 21 Tage mit subtherapeutischen Dosierungen (C=0,3 mg/kg KG, D=1,0 mg/kg KG) behandelt. Um den Effekt einer therapeutischen Behandlung auf eine vorbelastete Darmflora zu evaluieren, wurden die Gruppen C und D im Anschluss an das jeweilige Verschleppungsszenario über fünf Tage mit 10,0 mg Enrofloxacin/kg KG behandelt.
Die mikrobiologischen Untersuchungen der E. coli-Isolate als Stellvertreter für die Darmflora, erfolgten gemäß der Methodenbeschreibung in Kapitel 3.4.3.
Zur Interpretation der Ergebnisse wurden folgende Werte herangezogen: Der epidemiologische Cut-Off (ECOFF) und der klinische Breakpoint (kBp). Isolate, deren MHK-Werte über dem Cut-Off liegen, gehören nicht mehr der Wildtyppopulaton an, sondern werden als resistent bezeichnet. Liegen sie über dem klinischen Breakpoint, gelten sie als klinisch resistent und sind damit nicht mehr behandelbar (EUCAST 2013a). Der epidemiologische Cut-Off von E. coli gegen Enrofloxacin beträgt ECOFF≤ 0,125 µg/ml (EUCAST 2013b), der klinische Breakpoint kBp ≥ 2,0 µg/ml für Hühner und Puten (CLSI 2008).
Ergebnisse
71 4.3.1 Kontrollgruppe
Die Kontrollgruppe wurde über einen Zeitraum von 76 Tagen beprobt. Der Median der MHK-Werte von 60 E. coli-Isolaten aus 6 Tieren lag während des gesamten Zeitverlaufs unter dem epidemiologischen Cut-Off. Er bewegte sich im Rahmen von 0,047 bis 0,094 µg/ml.
Jedoch traten, abgesehen von Tag 22 und Tag 76, einzelne Kolonien auf, deren MHK-Werte über dem epidemiologischen Cut-Off (ECOFF) aber unter dem klinischen Breakpoint lagen. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt in Abbildung 4-11. Zusätzlich sind dem Gesamtergebnis des MHK-Verlaufs der Kontrollgruppe (1) die Verläufe zweier Einzeltiere (1a und b) gegenüber gestellt, um einen Einblick zu ermöglichen, wie sich das Gesamtergebnis zusammensetzt.
Die Streuung der MHK-Werte pro Probenentnahmetag sind in Boxplots dargestellt, die jeweiligen Antennen stellen die Spannbreite zwischen Minimal- und Maximalwerten dar.
Über die Methode der Anreicherung konnten ebenfalls keinerlei resistente E. coli detektiert werden.
Ergebnisse (Kontrollgruppe) und die zweier Einzeltiere (jeweils n=10) am jeweiligen Probenentnahmetag als Boxplots. Der Bereich zwischen epidemiologischem Cut-Off (ECOFF<0,125 µg/ml) und dem klinischen Breakpoint (kBp ≥ 2,0 µg/ml) ist grau hinterlegt.
Ergebnisse
73 4.3.2 Einfluss der therapeutischen Behandlung mit Enrofloxacin auf
kommensale E. coli
Vor Beginn der fünftägigen Behandlung lag der Median der MHK-Werte der Gruppe unter dem ECOFF. Ein einziges Isolat zeigte einen Wert von 0,75 µg/ml.
Direkt nach Behandlungsende konnten an Tag 6 keinerlei Kolonien isoliert werden, da nach Direktausstrich der Kloakentupfer kein Wachstum von E. coli erfolgte. Am Tag darauf wurde erneut ein Kloakentupfer pro Tier entnommen und jeweils direkt auf einem Endo-Agar ausgestrichen. Die Zahl der gewachsenen Kolonien betrug insgesamt sechs, die jeweiligen MHK-Werte zeigten Werte zwischen 0,19 und 0,75 µg/ml. Der Median ist demnach in den Bereich zwischen ECOFF und klinischem Breakpoint angestiegen.
Zwei Wochen später erfolgte die nächste Tupferentnahme und es konnten insgesamt 60 E. coli-Kolonien isoliert und getestet werden. Der Median blieb unverändert bei 0,75 µg/ml, die Streuung der MHK-Werte reichte jedoch von 0,094 bis 2,0 µg/ml, also von unveränderten E. coli-Kolonien bis hin zu nach klinischem Breakpoint als resistent eingestuften Keimen. Über Anreicherung der Kloaktentupfer (siehe Kap.
3.4.3) konnten jedoch keine klinisch resistenten E. coli bestätigt werden.
Am letzten Tag der Studie, 10 Wochen nach Ende der therapeutischen Behandlung, ist der Median auf einen Wert von 0,38 µg/ml abgesunken und die Streuung umfasste Werte unterhalb des ECOFF bis 1,5 µg/ml (Abbildung 4-12).
Die von jedem Tier der Gruppe angereicherten und danach auf mit 2 µg/ml (entspricht kBp) versetztem Endo-Agar ausgestrichenen Kloakentupfer, zeigten keinerlei Wachstum von E. coli auf besagtem Agar. Das heißt, über die Methode der Anreicherung wurde keinerlei Resistenz nachgewiesen.
Ergebnisse
74
0 7 22 27 34 48 76
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
ECOFF kBp
10 mg Enro/kg Tg 1 - 6
Gruppe
Zeitpunkt der Probenentnahme [d]
MHK (µg/ml)
0 7 22 27 34 48 76
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
ECOFF kBP
Einzeltier (Nr. 4)
Zeitpunkt der Probenentnahme [d]
MHK (µg/ml)
Abbildung 4-12: MHK-Werte (n=60) von E. coli-Isolaten aller getesteten Tiere der Gruppe und die eines Einzeltieres (n=10), medikiert mit 10,0 mg Enrofloxacin (Enro)/kg KG über 5 Tage, am jeweiligen Probenentnahmetag als Boxplots. Der Bereich zwischen epidemiologischem Cut-Off (ECOFF ≤ 0,125 µg/ml) und dem klinischen Breakpoint (kBp ≥ 2,0 µg/ml) ist grau hinterlegt.
Ergebnisse
75 4.3.3 Simulation einer Verschleppung von 3% der therapeutischen Dosierung
über Tränkwasser und ihr Einfluss auf kommensale E. coli.
Es wurde ein Verschleppungsszenario mit einer Dosierung von 0,3 mg Enrofloxacin/kg KG (entspricht 3% der therapeutischen Dosierung) über 21 Tage mittels Tränkwasser simuliert (Abbildung 4-13). Danach erfolgte eine therapeutische Behandlung (10,0 mg/kg KG) über fünf Tage.
Vor Beginn der Simulation lag der Median der E. coli-Isolate der Gruppe unter dem ECOFF, nur die MHK-Werte zweier Isolate lagen im Konzentrationsbereich knapp darüber (0,19 µg/ml).
Im Lauf der subtherapeutischen Medikation stieg der Median auf 0,75 µg/ml (Tag 6).
Die Streubreite erweiterte sich auf einen Konzentrationsbereich von 0,064-2,0 µg/ml.
Am Ende des Verschleppungsszenarios bemaß sich der Median noch immer auf einen Wert von 0,75 µg/ml und das Streuungsmaß reduzierte sich auf einen Bereich von 0,38 bis 2,0 µg/ml. Demnach lagen alle getesteten Kolonien der Gruppe an diesem Tag über dem ECOFF.
Nach Abschluss der therapeutischen Behandlung blieb der Median nach wie vor bei 0,75 µg/ml, die Streuung wurde weiter auf einen Konzentrationsbereich von 0,5 -3,0 µg/ml verdichtet. Der Hauptanteil der Isolate konzentrierte sich nun auf einen Bereich von 0,75-1,0 mg/ml. An diesem Probenentnahmetag konnten nur 40 E. coli-Isolate zur MHK-Bestimmung herangezogen werden, da kein Wachstum weiterer Kolonien erfolgte.
Sieben Tage nach Abschluss der Behandlung (Tag 34), in der die Darmflora keinerlei Zufuhr von Enrofloxacin erfuhr, gelang es wieder 60 Kolonien zu isolieren. Der Median sank auf einen Wert von 0,5 µg/ml.
Am letzten Versuchstag nach sieben Wochen ohne Antibiotikaexposition lag der Median unverändert bei 0,5 µg/ml.
Die parallel durchgeführten qualitativen Resistenztests über Anreicherung erbrachten keine positiven Ergebnisse. Auch bei dieser Gruppe wurden über diesen Weg keinerlei Resistenzen nachgewiesen, obwohl einzelne MHK-Werte den kBp erreichten oder überschritten.
Ergebnisse die eines Einzeltieres (n=10) am jeweiligen Probenentnahmetag als Boxplots. Medikation:
0,3 mg Enrofloxacin (Enro)/kg KG über 21 Tage, 10,0 mg Enro/kg KG über 5 Tage im Anschluss. Der Bereich zwischen epidemiologischem Cut-Off (ECOFF≤ 0,125 µg/ml) und dem klinischen Breakpoint (kBp ≥ 2,0 µg/ml) ist grau hinterlegt.
Ergebnisse
77 4.3.4 Simulation einer Verschleppung von 10% der therapeutischen Dosierung
über Tränkwasser und ihr Einfluss auf kommensale E. coli
Die Tiere dieser Gruppe erhielten eine Verschleppungsdosis von 1,0 mg Enrofloxacin/kg KG (10% der therapeutischen Dosis) über 21 Tage, direkt im Anschluss erfolgte die therapeutische Behandlung (10 mg/kg) über fünf Tage.
Vor Beginn des Versuchs lag der Median aus 60 MHK-Werten der E. coli-Isolate unter dem ECOFF.
Nach 5 Tagen subtherapeutischer Behandlung erhöhte sich der Median auf 0,5 µg/ml, der höchste gemessene MHK-Wert lag bei 2,0 µg/ml, entsprach also dem kBp. Bis zu diesem Tag konnten jedoch über die parallel durchgeführten Anreicherungen und den anschließenden Ausstrichen auf Endo-Agar mit 2,0 µg/ml Enrofloxacin-Zusatz, keine resistenten Kolonien detektiert werden.
Am folgenden Probenentnahmetag (Tag 22), nach Abschluss der subtherapeutischen Behandlung, wurden jedoch über die Anreicherungen der entnommenen Kloakentupfer bei 8 von 10 Tieren der Gruppe klinisch resistente Kolonien auf den jeweiligen Endo-Agar-Platten nachgewiesen. Parallel dazu erhöhte sich der über Etest® erhaltene Median auf 0,75 µg/ml. Der Boxplot zeigte eine Streubreite von 0,25 bis > 32 µg/ml, wobei die mittleren 50 % sich auf den Bereich zwischen 0,5 und 1,0 µg/ml konzentrierten. Erstmals während dieser Studie traten also zu diesem Zeitpunkt gegen Enrofloxacin klinisch hochresistente E. coli-Kolonien auf.
Nach Ende der im Anschluss erfolgenden fünftägigen Applikation von 10,0 mg Enrofloxacin/kg KG jedoch zeigte der Median einen Wert von 32 µg/ml ohne Streubreite, das heißt alle 60 isolierten E. coli-Kolonien waren klinisch resistent. Im Gegensatz zu den beiden anderen behandelten Gruppen, die im Anschluss an die bestimmungsgemäße Dosierung kein oder verringertes Wachstum von E. coli-Kolonien aufwiesen, konnten hier problemlos 60 coli-Kolonien ausgewählt und isoliert werden.
An den nächsten 3 Probezeitpunkten (Tage 34, 48, 76) blieb der Median stabil bei 32 µg/ml, allerdings erhöhte sich die Anzahl der Kolonien mit MHK-Werten unter 32 µg/ml. Insgesamt streuten sie zwischen 0,38 und 32 µg/ml.
Ergebnisse
78
Die Zahl der Kolonien mit niedrigeren MHK-Werten erhöhte sich mit zunehmendem zeitlichen Abstand zum Abschluss der Behandlung.
An allen 3 Terminen waren die Resistenztests nach Anreicherung bei 10 von 10 Tieren positiv.
Am letzten Tag der vorliegenden Studie (Tag 166), 20 Wochen nach Ende der Medikation, wurde ein Median der MHK-Werte von 0,094 µg/ml detektiert. Die Anteile der resistenten Kolonien im Vergleich zu den Kolonien, deren Hemmkonzentrationen unter dem ECOFF lagen, hatten sich zugunsten der Letztgenannten entwickelt. Es konnte lediglich eine Kolonie (MHK 32 µg/ml) über dem kBp detektiert werden. Ein weiteres Isolat lag über dem ECOFF mit einer Hemmkonzentration von 0,38 µg/ml (Abbildung 4-14). Obwohl über den Epsilometertest nur ein E. coli mit MHK ≥ 32 µg/ml und damit über dem kBp detektiert wurde, zeigte jedes Tier ein Wachstum resistenter E. coli-Kolonien nach Anwendung des Anreicherungsverfahrens.
Ergebnisse die von 4 Einzeltieren (jeweils n=10) am jeweiligen Probenentnahmetag als Boxplots.
Medikation: 1,0 mg Enrofloxacin/kg KG über 21 Tage, 10,0 mg Enrofloxacin/kg KG über 5 Tage im Anschluss. Der Bereich zwischen epidemiologischem Cut-Off (ECOFF≤0,125 µg/ml) und dem klinischen Breakpoint (kBp ≥ 2,0 µg/ml) ist grau hinterlegt.
Ergebnisse
80
4.3.5 Gesamtüberblick aller Gruppen
Der Median der MHK-Werte der Kontrollgruppe zeigte durchgehend Werte unter dem epidemiologischen Cut-Off (ECOFF). In Einzelfällen konnten Kolonien detektiert werden, deren MHK-Werte den ECOFF (≤ 0,125 µg/ml) überstiegen. Damit kann die Mehrheit der Isolate als Wildtyp charakterisiert werden. Klinisch resistente Kolonien konnten weder mittels Etest® noch im Anreicherungsverfahren detektiert werden.
Die über 5 Tage therapeutisch behandelte Gruppe zeigte während und nach der Behandlung mit der bestimmungsgemäßen Dosis MHK-Shifts, die bis auf vereinzelte Kolonien, die dem kBp entsprechen, zwischen ECOFF und kBp rangierten. Das bedeutet, dass es sich bei den betreffenden E. coli zwischen ECOFF und kBp nach der Definition nach Eucast (2013a) um resistente, aber nicht um klinisch resistente Bakterien handelt. Ebenfalls nach der Definition von Eucast (2013a) handelt es sich bei den einzelnen E. coli-Kolonien, die einen MHK-Wert von 2,0 µg/ml aufwiesen und damit dem kBp entsprachen, um klinisch resistente Bakterien. Dies konnte über die Anreicherung der einzelnen Kloakentupfer aber nicht bestätigt werden.
Die Tiergruppe, der die 3%ige Verschleppungsdosis appliziert wurde, verhielt sich ähnlich. Bis auf einzelne Kolonien rangierten die MHKs der isolierten E. coli-Kolonien während des Versuchverlaufs zwischen ECOFF und kBp, womit sie als resistente Bakterien identifiziert werden können.
Bei der Gruppe, die die 10%ige Verschleppungsdosis erhielt, wurden nach Abschluss des Verschleppungsszenarios klinisch resistente Kolonien detektiert. Dies konnte über Anreicherung der Kloakentupfer bestätigt werden. Durch die im Anschluss erfolgende therapeutische Behandlung erfolgte eine Selektion der klinisch resistenten E. coli. Die Resistenzen konnten 20 Wochen nach Behandlungsende detektiert werden.
Alle medikierten Gruppen zeigten einen deutlichen Rückgang des MHK-Shifts durch Reduktion der Anzahl der E. coli mit höheren MHK-Werten in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zum Ende der Medikation.
Die schon zuvor pro Gruppe dargestellten Daten werden in Abbildung 4-15 noch einmal zum direkten Vergleich präsentiert.
Ergebnisse
81 Die schon zuvor pro Gruppe einzeln gezeigten Gesamtverläufe zum direkten Vergleich nebeneinander aufgeführt in Abbildung 4-15:
Abbildung4-15: Zusammenfassende Darstellung aller Gruppen zum direkten Vergleich.
Zusammenfassung der MHK-Werte der E. coli-Isolate pro Probenentnahmetag in Boxplots, n=60. Der Bereich zwischen epidemiologischem Cut-Off (ECOFF ≤ 0,125 µg/ml) und dem klinischen Breakpoint (kBp ≥ 2,0 µg/ml) ist grau hinterlegt.
0 6 22 27 34 48 76
Ergebnisse
82
4.3.6 Statistische Auswertung
Tabelle 4-1: Vergleich der Gruppen untereinander mit einfaktorieller Varianzanalyse für unabhängige Stichproben und anschließendem Tukey-Test, Gruppe A = Kontrollgruppe, Gruppe B = Therapeutische Behandlung über 5 Tage, Gruppe C = 3%ige Verschleppungsdosis mit anschließender therapeutischer Behandlung, Gruppe D = 10%ige Verschleppungsdosis mit anschließender therapeutischer Behandlung, P < 0,05.
Gruppe A B C
Tag 0 6 22 27 76 0 7 22 27 76 0 6 22 27 76
B 0
7 22 27 76
C 0
6 22 27 76
D 0
6 22 27 76
signifikant P < 0,05
nicht signifikant
Ergebnisse
83
Tabelle 4-2: Gruppe B = Therapeutisch behandelte Gruppe; Vergleich der MHK-Veränderungen innerhalb der Gruppe mittels T-Test für gepaarte Beobachtungen, P < 0,05
Gruppe B
Anstieg Tag X auf Tag Y Pr >|t|
07 0,2296
022 < 0,0001
722 0,3381
2276 0,1462
Tabelle 4-3: Gruppe C = 3%ige Verschleppung über 21 Tage gefolgt von therapeutischer Behandlung; Vergleich der MHK-Veränderungen innerhalb der Gruppe mittels T-Test für gepaarte Beobachtungen, P < 0,05
Gruppe C
Anstieg Tag X auf Tag Y Pr >|t|
0 22 0,0004
22 27 0,1583
27 34 0,1750
27 76 0,0144
Tabelle 4-4: Gruppe D = 10%ige Verschleppung über 21 Tage gefolgt von therapeutischer Behandlung; Vergleich der MHK-Veränderungen innerhalb der Gruppe mittels T-Test für gepaarte Beobachtungen, P < 0,05
Gruppe D
Anstieg Tag X auf Tag Y Pr > |t|
0 22 0,0002
22 27 0,0006
27 34 0,0914
27 76 0,1211
27 166 < 0,0001
76 166 0,0081
Diskussion
84