Versuchsdurchführung

In-vivo-Versuch I: Von den beiden 6-er Gruppen wurde eine (Gruppe 1) ausschließlich mit Enrofloxacin in therapeutischer Dosierung von 10 mg/ Enrofloxacin pro kg Körpergewicht pro Tag über 2 mal drei Tage mit einem Abstand von 11 Tagen behandelt. Die zweite 6-er Gruppe (Gruppe 2) wurde zunächst ebenfalls über drei Tage mit Enrofloxacin in therapeutischer Dosierung und nach einer Pause von 11 Tagen mit Enrofloxacin (10 mg/kg pro Tag) in Kombination mit Neomycin (30 mg/kg pro Tag) über 3 Tage behandelt (Abb. 10).

In-vivo-Versuch II: Gruppe 1 wurde analog zum ersten Versuch behandelt, während Gruppe 2 zunächst ebenfalls über drei Tage mit Enrofloxacin in therapeutischer Dosierung und nach einer Pause von 11 Tagen mit Enrofloxacin (10 mg/kg pro Tag) über 3 Tage kombiniert mit Colistin (6 mg/kg pro Tag) über 5 Tage behandelt wurde.

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Die Behandlung erfolgte jeweils über das Tränkwasser. Die verabreichte Menge an Antibiotikum wurde anhand der täglich gemessenen Trinkwassermenge des Vortags berechnet. Neben der behandelten Gruppe wurden unmittelbar durch ein Metallgitter getrennt jeweils vier Tiere aufgestallt, die nicht behandelt wurden. Jeweils vor und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Behandlung, wurden Kloakentupfer von den Tieren entnommen (Abb. 11).

In-vivo-Versuch I Gruppe 1

Gruppe 2

Abb. 10: Übersicht In-vivo-Versuch I Monotherapie mit Enrofloxacin (Gruppe 1) im Vergleich zu einer Kombinationstherapie von Enrofloxacin und Neomycin (Gruppe 2); Probenentnahmetag (P), Behandlung mit Enrofloxacin (B1), Behandlung mit Neomycin (B2)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

P P P P P P P B1 B1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

P P P P P P P B1 B1 B2

46 In-vivo-Versuch II

Gruppe 1

Gruppe 2

Abb. 11: Übersicht In-vivo-Versuch II Monotherapie mit Enrofloxacin (Gruppe 1) im Vergleich zu einer Kombinationstherapie von Enrofloxacin und Colistin (Gruppe 2); Probenentnahmetag (P), Behandlung mit Enrofloxacin (B1), Behandlung mit Colistin (B2)

Mikrobiologische Untersuchungen

Am jeweiligen Probenentnahmetag wurden von den sechs Tieren der behandelten Gruppe sowie den vier Tieren der unbehandelten Gruppe zwei mit steriler isotoner Kochsalz-Lösung angefeuchtete Kloakentupfer entnommen. Einer der Tupfer wurde direkt auf Endoagar ohne Zusatz von Enrofloxacin ausgestrichen und bei 37° C für 18 - 24 Stunden im Brutschrank bebrütet.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

P P P P P P P B1 B1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

P P P P P P P B1 B1 B2

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Abb. 12: Endoagar mit Escherichia coli-Kolonien

E. coli kann Laktose unter Bildung von Aldehyd und Säure fermentieren. Aldehyd reagiert mit dem Fuchsin-Sulfit-Komplex, der sich in dem Endoagar befindet, und setzt dabei Fuchsin frei. Dies führt zu einer tiefroten Färbung der Kolonien und des sie umgebenden Agars. Diese Reaktion ist bei E. coli so stark ausgeprägt, dass Fuchsin auskristallisiert und es zu einem grünlich-metallischen Glanz der Kolonien (Fuchsinglanz) kommt (Abb. 12) (MERCK 2010c). Von den so makroskopisch als E. coli identifizierten Kolonien wurden zehn Einzelkolonien je Tier mit Hilfe eines sterilen Wattetupfers abgenommen. Anschließend wurde in 3 ml steriler isotoner Kochsalz-Lösung mit Hilfe eines Densimeters durch Rühren des Tupfers und Schütteln des Röhrchens mit einem Reagenzglasschüttler eine optische Dichte von 0,08 - 0,1 durch Messung der Adsorption bei 625 nm eingestellt. Dies entspricht einem McFarland Standard von 0,5 und somit einer Zelldichte von 1 - 2 x 10⁸ KBE/ml (CLSI 2006a).

Ein steriler Wattetupfer wurde anschließend in die Suspension getaucht und beim Herausnehmen gegen die Wand des Röhrchens gedrückt, um überschüssige Flüssigkeit abzustreifen. Der Tupfer wurde nun dreimal in unterschiedlichen Richtungen über die Oberfläche eines Mueller-Hinton-Agars gestrichen, um ein gleichmäßiges Wachstum des Keimes über die gesamte Agaroberfläche zu erreichen. Bevor der MHK-Teststreifen aufgelegt werden konnte, musste noch gewartet werden, bis die Oberfläche des Agars getrocknet war. Dann konnte der Streifen mit Hilfe einer sterilen Pinzette aufgelegt und leicht an den Agar angedrückt werden. Nach einer Bebrütungszeit von 18 - 20 Stunden bei einer Temperatur von

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37° C, wurde die MHK in µg/ml abgelesen. Dazu wurde die höchste Konzentration auf dem MHK-Teststreifen abgelesen, an der die Hemmellipse diesen schnitt (Abb. 13) (LIOFILCHEM 2013).

Um eine gleichbleibende Qualität und die Richtigkeit der Ergebnisse sicher zu stellen, wurden Qualitätskontrollen mit Hilfe der Referenzstämme Staphylococcus aureus ATCC® 29213 (MHK 0,03-0,12 µg/ml Enrofloxacin) für den niedrigen MHK- Bereich sowie Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853 (MHK 1-4 µg/ml Enrofloxacin) für den hohen MHK-Bereich durchgeführt.

Abb. 13: MHK-Teststreifen Enrofloxacin mit Escherichia coli auf Mueller-Hinton-Agar

Um zu überprüfen, ob es sich bei den getesteten Kolonien tatsächlich um E. coli handelte, wurde mit einer Impföse Koloniematerial neben dem Schnittpunkt mit dem Streifen abgenommen und in 2 ml LMX-Bouillon überführt. Diese Lösung wurde dann bei 37° C für 24 Stunden inkubiert. LMX-Bouillon modifiziert nach Manafi und Ossmer enthält unter anderem Laurylsulfat, welches das Wachstum grampositiver Bakterien hemmt und Phosphat, welches das Wachstum von Coliformen fördert (MERCK 2010a). Das chromogene 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal), welches ebenfalls enthalten ist, wird durch die β-Galactosidase der Coliformen gespalten. Dabei kommt es zu einer Blaufärbung der Bouillon (MANAFI et al. 1991; MERCK 2010a) (Abb. 11). Das Enzym β-D-Glucuronidase (GUD), welches das enthaltene 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) in 4-Methylumbelliferon

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(4-MU) spaltet (MANAFI et al. 1991), besitzen 94–96% aller E.-coli-Stämme. MU fluoresziert unter UV-Licht (Wellenlänge 366 nm) (Abb. 14) (HEIZMANN et al. 1988).

Abb. 14: LMX- Bouillon mit Escherichia coli unter UV-Licht

Anschließend wurde die Lösung mit einigen Tropfen Kovacs' Indolreagenz überschichtet, welches bei Nachweis von E. coli einen Farbumschlag von ursprünglich Gelb zu Rot durch Bildung von Indol aus L-Tryptophan durch die Tryptophanase zeigte. Diese Reaktion ist bei 99 % aller E.-coli-Stämme positiv. Das im Reagenz enthaltene 4 - Dimethylaminobenzaldehyd bildete dann mit dem Indol einen sichtbaren roten Komplex (OXOID 2003; MERCK 2010b) (Abb. 15).

Abb. 15: LMX- Bouillon und Kovacs' Indolreagenz mit Escherichia coli

Der zweite entnommene Kloakentupfer wurde direkt in 9 ml LB-Bouillon für 24 Stunden bei 37° C angereichert. Am nächsten Tag wurde mit Hilfe einer sterilen

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Impföse 10 µl dieser Bouillon auf einem Endoagar mit Zusatz von 2 µg/ml Enrofloxacin ausgebracht und für 18 - 24 Stunden bei 37° C bebrütet. Dies entspricht dem klinischen Breakpoint für Enrofloxacin beim Huhn ( ≥ 2 µg/ml) (CLSI 2013). Bei Wachstum von Kolonien fand ebenfalls eine E. coli-Bestätigung mit LMX- Bouillon und Kovacs' Indolreagenz in Anlehnung an die Durchführung der Versuche von SCHERZ (2013) statt.