Anaerober Abbau von Kresolen und Monohydroxybenzoaten

Anaerober Abbau von Kresolen und Monohydroxybenzoaten

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

an der Universität Konstanz

vorgelegt von

Jochen Ait Müller aus Köln

Konstanz 2000

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS 2

ABKÜRZUNGEN, SYMBOLE UND TRIVIALNAMEN 5

ZUSAMMENFASSUNG 6

SUMMARY 8

1. EINLEITUNG 10

1.1 Mikrobieller Abbau aromatischer Verbindungen 11

1.2 Reaktionen des anaeroben Abbaus 11

1.2.1 Modifikationsreaktionen - Überführung in Schlüsselintermediate 12 1.2.2 Dearomatisierungsreaktionen - Umsatz der Schlüsselintermediate 14

1.3 Kresole und Hydroxybenzoate 15

1.4 Zielsetzung 17

2. MATERIAL UND METHODEN 19

2.1 Mikrobiologische Methoden 19

2.1.1 Herkunft der verwendeten Stämme 19

2.1.2 Medien und Kultivierungstechniken 19

2.1.3 Bestimmung des G+C Gehalts der DNA und Analyse der 16S rDNA 20 2.1.4 Bestimmung von Zellerträgen und Wachstumsparametern 21

2.2 Biochemische Methoden 21

2.2.1 Zellernte 21

2.2.2 Zellsuspensionsversuche 21

2.2.3 Herstellung von zellfreien Extrakten und Fraktionierung des Extrakts 22

2.2.4 Bestimmung von Enzymaktivitäten 22

2.3 Analytische Methoden 27

2.3.1 Spektralphotometrie 27

2.3.2 Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) 27

2.3.3 Gaschromatographie (GC) 27

2.3.4 Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektroskopie (GC/MS) 28

2.3.5 Dünnschichtchromatographie (DC) 28 2.3.6 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) 29

2.3.7 Colorimetrische Bestimmungen 30

2.4 Chemikalien und Gase 31

2.4.1 Synthese von CoA-Estern 31

2.4.2 Synthese von 3-Hydroxybenzylbernsteinsäure 31

2.4.3 Cobalamin- und Titan(III) Lösungen 32

2.4.4 Sonstige Chemikalien und Gase 33

2.5 Berechnungen 33

3. ERGEBNISSE 34

3.1 Der anaerobe Abbau von Kresolen und Toluol 34

3.1.1 Wachstum von Desulfobacterium cetonicum 480 auf m-Kresol 34 3.1.2 Identifizierung von 3-Hydroxybenzylsuccinat in wachsender Kultur 34 3.1.3 Addition von Fumarat an die Methylgruppe von m-Kresol im zellfreien System 36 3.1.5 Experimente zu alternativen Reaktionen mit m-Kresol als Substat 39 3.1.6 Oxidation von 3-Hydroxybenzylsuccinat im zellfreien System 39 3.1.7 Einfluß von Carbonsäuren auf das Wachstum auf m-Kresol 41

3.1.8 Der anaerobe Abbau von Toluol 43

3.1.9 Zum anaeroben Abbau von p-Kresol 44

3.2 Der anaerobe Abbau von 3-Hydroxybenzoat durch Stamm BT 45 3.2.1 Abbau von 3-Hydroxybenzoat und Benzoat in dichter Zellsuspension 45 3.2.2 Aktivierung von 3-Hydroxybenzoat und Benzoat zu den korrespondierenden CoA-

Estern im zellfreien System 46

3.2.3 Reduktive Dehydroxylierung von 3-Hydroxybenzoyl-CoA zu Benzoyl-CoA 48 3.2.4 Inhibition des 3-Hydroxybenzoat- und Benzoat-Umsatzes 50

3.2.5 Corrinoidbestimmung in Stamm BT 52

3.2.6 Experimente zur Benzoyl-CoA Reduktion 52

3.2.7 Enzyme des Benzoyl-CoA Wegs 52

3.2.8 16S rDNA Sequenzierung und G+C-Gehalt der DNA von Stamm BT 54 3.3 Abbau von 3-Hydroxybenzoat durch Desulfobacterium cetonicum Stamm 480 55 3.3.1 Aktivierung von 3-Hydroxybenzoat zu 3-Hydroxybenzoyl-CoA 56 3.3.2 Reduktion von 3-Hydroxybenzoyl-CoA (dearomatisierend) 56 3.4 Abbau von 3-Hydroxybenzoat durch den denitrifizierenden Stamm BoNHB 57

3.4.1 Hemmung des Umsatzes von 3-Hydroxybenzoat in dichter Zellsuspension 58 3.4.2 Anaerobe Oxidation von 3-Hydroxybenzoat in zellfreiem Extrakt 58 3.4.3 Anaerobe Oxidation von Gentisat in zellfreiem Extrakt 61 3.4.4 Hydroxyhydrochinon-Dehydrogenase in Stamm BoNHB 62

4. DISKUSSION 64

4.1 Anaerober Abbau von Kresolen und Toluol in Desulfobacterium cetonicum 64

4.2 Anaerober Abbau von 3-Hydroxybenzoat 69

4.2.1 Zum 3-Hydroxybenzoat-Abbau in D. cetonicum 69

4.2.2 Zum 3-Hydroxybenzoat-Abbau in Stamm BT 70

4.2.1 Zum 3-Hydroxybenzoat-Abbau im denitrifizierenden Stamm BoNHB 79

4.3 Anregungen für weitere Untersuchungen 81

5. LITERATURVERZEICHNIS 83

PUBLIKATIONSLISTE 98

DANKSAGUNG 99

ABKÜRZUNGEN, SYMBOLE UND TRIVIALNAMEN

Abb. Abbildung

AMP, ADP, ATP Adenosinmono(-di, -tri)phosphat

CoA, CoASH Coenzym A

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

DC Dünnschichtchromatographie

DCPIP 2,6- Dichlorphenol-indophenol

DTE 1,4- Dithioerythritol

DNA Desoxyribonucleinsäure

ελ Molarer Extinktionskoeffizient bei der Wellenlänge λ E₀’ Redoxpotential unter Standardbedingungen bei pH 7,0 g Erdbeschleunigung, 9,81 m^.s^-2

∆G⁰’ Änderung der freien Enthalpie unter Standardbedingungen bei pH 7,0

GC Gaschromatographie

HPLC Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie

K_M Michaelis-Konstante

µ Wachstumsrate

Methylviologen 1,1´- Dimethyl-4,4´- Bipyridyldichlorid

NAD(P)⁺ Nicotinsäureamidadenindinukleotid-(phosphat) NAD(P)H⁺ Reduzierte Form des NAD(P)⁺

MPa Mega-Pascal

OD_λ „Optische Dichte“ einer Bakteriensuspension bei der Wellenlänge λ

PEP Phosphoenolpyruvat

PPi Pyrophosphat

rRNA ribosomale Nucleinsäure

Tab. Tabelle

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

TGW Trockengewicht

%(v/v) Volumenprozent

%(w/v) Gewichtsprozent

ZUSAMMENFASSUNG

Die vorliegende Arbeit beschreibt den anaeroben Abbau von Kresolen und Toluol in dem sulfatreduzierenden Bakterium Desulfobacterium cetonicum sowie von 3-Hydroxybenzoat in dem gärenden Bakterium Sporotomaculum hydroxybenzoicum und einem denitrizierenden Bakterium, Stamm BoNHB. In vitro Messungen oftmals erstmalig beschriebener enzymatischer Reaktionen dienten als Grundlage zur Erstellung von Abbauwegen für die angesprochenen aromatischen Verbindungen.

1. Das sulfatreduzierende Bakterium Desulfobacterium cetonicum Stamm 480 oxidierte m- Kresol vollständig zu CO2. Während des Wachstums akkumulierte 3-Hydroxybenzylsuccinat im Medium; diese Verbindung wurde durch eine GC/MS-Analyse und Vergleich der HPLC- Retentionszeiten sowie des UV-Spektrums mit einer chemisch synthetisierten Referenzsubstanz identifiziert. In zellfreiem Extrakt von D. cetonicum wurde die Bildung von 3-Hydroxybenzylsuccinat aus m-Kresol und Fumarat mit einer Aktivität von 0.5 nmol min^-1 (mg Protein)^-1 gemessen. Die Reaktion war von strikt anoxischen Bedingungen abhängig. In oxischen Ansätzen wurde keine Aktivität gemessen; nach einer Reduktion oxischer Ansätze konnte jedoch eine geringe Aktivität bestimmt werden. Der Abbau von 3- Hydroxybenzylsuccinat erfolgte durch Aktivierung zum CoA-Ester in einer CoA-Transferase- Reaktion und nachfolgender Oxidation zu 3-Hydroxybenzoyl-CoA. 3-Hydroxybenzylsuccinat wurde auch in Kulturüberständen von Desulfotomaculum gibsoniae nach Wachstum auf m- Kresol detektiert. Dieses deutet auf einen Abbau von m-Kresol durch Dt. gibsoniae wie für D.

cetonicum beschrieben hin.

2. Toluol wurde durch zellfreien Extrakt von D. cetonicum zu Benzylsuccinat umgesetzt.

Benzylsuccinat wurde auch in Kulturüberständen beim Wachstum auf Toluol detektiert. Die Bildung von Benzylsuccinat aus Toluol und Fumarat sowie von 3-Hydroxybenzylsuccinat aus m-Kresol und Fumarat wurde durch zwei verschiedene Enzyme katalysiert. In Extrakten von p-Kresol-gewachsenen Zellen wurde eine Aktivität gemessen, die p-Kresol in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Fumarat zu einem noch nicht identifizierten Produkt umsetzte. Eine Oxidation von p-Kresol zu 4-Hydroxybenzylalkohol wurde nicht beobachtet.

3. Das anaerobe Bakterium Sporotomaculum hydroxybenzoicum Stamm BT vergärt 3- Hydroxybenzoat zu Acetat, Butyrat und CO2. 3-Hydroxybenzoat wurde in einer CoA- Transferase-Reaktion zu 3-Hydroxybenzoyl-CoA aktiviert. Als physiologische CoA- Donatoren können Acetyl-CoA und/oder Butyryl-CoA angenommen werden. Als nächster Schritt im Abbauweg erfolgt die reduktive Dehydroxylierung von 3-Hydroxybenzoyl-CoA zu Benzoyl-CoA. Diese Reaktion wurde in zellfreiem Extrakt mit Cob(I)alamin als Elektronendonor gemessen. Für Cob(I)alamin als physiologischen Elektronedonor wurden keine Hinweise erhalten, jedoch deuteten Studien mit Inhibitoren auf die Beteiligung eines starken Nukleophils an der Reaktion hin. Dichte Suspensionen 3-Hydroxybenzoat- gewachsener Zellen verstoffwechselten Benzoat ohne Verzögerung zu Acetat, Butyrat, CO2

und H2. Die Benzoyl-CoA Reduktase wurde nicht detektiert. Die Glutaconyl-CoA Decarboxylase-Reaktion dient wahrscheinlich zum Aufbau eines Na⁺-Gradienten in Stamm BT. Die Ergebnisse sprechen für einen 3-Hydroxybenzoat-Abbau über Benzoyl-CoA in diesem Bakterium.

4. In dem denitrifizierenden Bakterium Stamm BoNHB wird 3-Hydroxybenzoat wahrscheinlich über Gentisat (2,5-Dihydroxybenzoat) abgebaut. Gentisat wurde nach Zugabe von Propyljodid zu dichten Suspensionen 3-Hydroxybenzoat-umsetzender Zellen detektiert.

Nitrat diente in diesen Experimenten als Elektronenakzeptor. In zellfreiem Extrakt konnte eine Abnahme der 3-Hydroxybenzoat-Konzentration in Anwesenheit von Elektronenakzeptoren (DCPIP, K3Fe(CN)6 oder NO3-

) beobachtet werden. In oxischen Ansätzen wurde ein geringere Aktivität als in anoxischen Ansätzen gemessen. Produkte einer 3-Hydroxybenzoat-Oxidation, z.B. Gentisat, wurden nicht detektiert. Außerdem konnte in zellfreiem Extrakt eine Abnahme von zugesetztem Gentisat in Anwesenheit der selben Elektronenakzeptoren gemessen werden. Auch hier wurden keine Produkte der Gentisat- Oxidation detektiert. Hydroxyhydrochinon, ein hypothetisches Intermediat des anaeroben 3- Hydroxybenzoat-Abbaus in diesem Stamm, wurde durch eine membranständige Enzymaktivität zu 2-Hydroxybenzochinon oxidiert. Die Hydroxyhydrochinon-oxidierende Aktivität war in Extrakten Benzoat-gewachsener Zellen etwa gleich hoch wie in Extrakten 3- Hydroxybenzoat-gewachsener Zellen.

SUMMARY

The anaerobic degradation of cresols and toluene by a sulfate-reducing bacterium, Desulfobacterium cetonicum, and the anaerobic degradation of 3-hydroxybenzoate by either a fermenting bacterium, Sporotomaculum hydroxybenzoicum, or a denitrifying bacterium, strain BoNHB, are described in the present work. Degradation pathways for these aromatic substrates are postulated on the basis of in vitro measurements of key enzymes.

1. The anaerobic bacterium Desulfobacterium cetonicum strain 480 oxidized m-cresol completely with sulfate as electron acceptor. During growth, 3-hydroxybenzylsuccinate, identified by gas chromatography-mass spectroscopy and by comparison of high-performance liquid chromatography retention time and UV spectrum with a chemically synthesized reference compound, accumulated in the medium. This finding indicated that the methyl group of m-cresol is activated by addition to fumarate, similar to anaerobic toluene metabolism. In cell-free extracts of D. cetonicum, the formation of 3-hydroxybenzylsuccinate from m-cresol and fumarate was detected at an activity of 0.5 nmol min^-1 (mg protein)^-1. This reaction depended strictly on anoxic assay conditions. Treatment with air resulted in complete loss of activity; however, some activity could be recovered after restoring anoxic conditions.

3-Hydroxybenzylsuccinate was degraded via CoA thioesterification and further oxidation to 3- hydroxybenzoyl-CoA as subsequent steps in the degradation pathway. 3- Hydroxybenzylsucciante was found as well in culture supernatants of Desulfotomaculum gibsoniae grown on m-cresol. These results indicated that m-cresol is degraded in Dt.

gibsoniae through a pathway similar to that used by D. cetonicum.

2. In cell-free extracts of D. cetonicum, toluene was converted to benzylsuccinate by addition to fumarate. Benzylsuccinate was found in culture-supernatants after growth on toluene. The formation of benzylsuccinate and of 3-hydroxybenzylsucinate were catalyzed by two different enzymes. In cell-free extracts of p-cresol-grown cells, an activity was detected that converted p-cresol in the presence of fumarate to so far unidentified product. No evidence was obtained for oxidation of p-cresol to 4-hydroxybenzylalcohol.

3. The anaerobic bacterium Sporotomaculum hydroxybenzoicum strain BT ferments 3- hydroxybenzoate to acetate, butyrate, and CO₂. 3-Hydroxybenzoate was activated to 3-

hydroxybenzoyl-CoA in a CoA-transferase reaction with acetyl-CoA or butyryl-CoA as CoA donors. 3-Hydroxybenzoyl-CoA was reductively dehydroxylated, forming benzoyl-CoA. This reaction was measured in cell-free extract with cob(I)alamin as low-potential electron donor.

No evidence was obtained that cob(I)alamin is the physiological electron donor; however, inhibitor studies indicated an involvement of a strong nucleophile in the reaction. Benzoate was degraded by dense cell suspensions without a lag phase to acetate, butyrate, CO₂, and H₂. Benzoyl-CoA reductase was not detected. Glutaconyl-CoA-decarboxylase is likely to act as a primary sodium ion pump. The results indicated a degradation of 3-hydroxybenzoate via benzoyl-CoA in this bacterium.

4. Evidence was obtained for anaerobic degradation of 3-hydroxybenzoate via gentisate (2,5- dihydroxybenzoate) in a denitrifying bacterium, strain BonHB. Gentisate was detected in dense cell suspensions of strain BoNHB degrading 3-hydroxybenzoate coupled to denitrification after addition of propyl iodide. In cell-free extracts, a decrease of 3- hydroxybenzoate could be measured depending on the presence of electron acceptors (DCPIP, K3Fe(CN)6, or NO3-

). The activity was lower in oxic assays than in anoxic assays. Products of 3-hydroxybenzoate-oxidation, i.e., gentisate, were not detected. Gentisate was oxidized in the presence of electron acceptors by cell-free extracts, however, products of gentisate oxidation were not observed. The presumed intermediate of 3-hydroxybenzoate-degradation, hydroxyhydroquinone, was oxidized to 2-hydroxybenzoquinone by a membrane-bound activity.

1. EINLEITUNG

In der großen Klasse der aromatischen Verbindungen werden alle organischen Stoffe zusammengefaßt, die sich formal auf den Grundkörper Benzol zurückführen lassen. Zu den ersten, aus Naturprodukten isolierten Benzolderivaten gehörten Benzoesäure aus Benzoeharz, Toluol aus Tolubalsam sowie Salicylsäure (2-Hydroxybenzoesäure) aus zahlreichen Pflanzen und Früchten (Fieser und Fieser 1983). Heutzutage sind eine Vielzahl natürlicher Quellen aromatischer Verbindungen bekannt. Hierzu zählen insbesondere Erdöl, das pflanzliche Strukturpolymer Lignin, mit etwa 25 % Gewichtsanteil an der pflanzlichen Primärproduktion ein wichtiger Teil des globalen Kohlenstoffkreislaufs (Zeikus 1981), die aromatischen Aminosäuren, sowie viele Verbindungen des Sekundärmetabolismus von Pflanzen. Zu der letzteren Gruppe, nach Zahl und Art nicht unbedeutend, zählen einfache Phenole, Phenolcarbonsäuren und Flavanderivate, die oftmals als Glykoside oder Zuckerester in der pflanzlichen Vakuole zu finden sind (Richter 1988). Auch eine Reihe von Coenzymen besitzen aromatische Gruppen, und in Flavinen und Chinonen fungieren aromatische Komponenten als Redoxmediatoren. Somit erfüllen aromatische Verbindungen mannigfaltige Aufgaben in der belebten Natur. Insbesondere in den unterschiedlichsten physiko-chemischen Eigenschaften dieser Stoffe liegt diese Vielfalt begründet. Gerade die großen Variationsmöglichkeiten in Struktur und Eigenschaft führen zur Synthese neuartiger aromatischer Verbindungen durch den Menschen. Produktion und Nutzung dieser nicht natürlich vorkommenden Verbindungen (Xenobiotika) sind als weitere Quellen aromatischer Stoffe zu nennen.

Das gemeinsame Charakteristikum aromatischer Verbindungen ist ein planarer Ring sp²- hybridisierter Kohlenstoffatome mit delokalisierten p-Elektronen (π-Elektronensystem) und infolgedessen hoher Resonanzenergie. Substituenten wie z.B. Hydroxyl-, Carboxyl- oder Alkylgruppen beeinflussen auf unterschiedliche Art und Weise die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Verbindungen und sind folglich für die vielfältigen biologischen Funktionen und biochemischen Reaktionen bestimmend. Ein wichtiger Teil der vorliegenden Arbeit befaßt sich mit Reaktionen der Substituenten aromatischer Verbindungen im Verlauf des mikrobiellen Abbaus dieser Substanzen.

Wenn nicht anders spezifiziert, so ist mit dem Terminus aromatische Verbindung im Folgenden ein mononukleares, homozyklisches Benzolderivat gemeint; Polymere,

heterozyklische und kondensierte aromatische Systeme werden in dieser Arbeit nicht besprochen.

1.1 Mikrobieller Abbau aromatischer Verbindungen

Alle aromatischen Verbindungen sind potentiell Substrate für Mikroorganismen. Für eine Vielzahl aromatischer Verbindungen konnte ein mikrobieller Abbau sowohl unter oxischen als auch unter anoxischen Bedingungen bereits gezeigt werden.

Der aerobe Abbau erfolgt zumeist über Mono- und Dioxygenase-Reaktionen als einleitende Schritte (Dagley 1971). Hieraus ersichtlich ist, daß molekularer Sauerstoff nicht nur terminaler Elektronenakzeptor sondern auch essentielles Cosubstrat bei diesen Abbauvorgängen ist. Über Hydroxylierungsreaktionen werden die unterschiedlichen aromatischen Verbindungen in eines der zweifach hydroxylierten Schlüsselintermediate Brenzkatechin, Protokatechuat oder Gentisat umgewandelt, welches dann entweder intradiolisch oder extradiolisch oxygenolytisch gespalten wird (Dagley 1971; Middelhoven 1993).

Verständlicherweise können aromatische Verbindungen beim anaeroben Abbau nicht über Oxygenasereaktionen angegriffen werden, sondern müssen über gänzlich andere Reaktionen in Intermediate des zentralen Stoffwechsels überführt werden. Hier zeigt sich im Hinblick auf die unterschiedlichen biochemischen Reaktionstypen bereits jetzt eine große Vielfalt.

1.2 Reaktionen des anaeroben Abbaus

Die Reaktionen des anaeroben Aromatenabbaus können in drei Klassen eingeteilt werden. (i) Über Modifikationsreaktionen werden die unterschiedlichsten aromatischen Verbindung in nur wenige Schlüsselintermediate überführt. Der aromatische Charakter der jeweiligen Verbindung wird dabei verändert, aber nicht aufgehoben. (ii) Diese Aufhebung erfolgt in den Dearomatisierungsreaktionen der Schlüsselintermediate. Die Schlüsselintermediate sind namensgebend für die bisher beschriebenen Abbauwege. Hierzu zählen der Benzoyl-CoA-, der Phloroglucin-, der Resorcin- und der Hydroxyhydrochinon-Weg. (iii) Im weiteren Verlauf der Abbauwege werden die Dearomatisierungsprodukte in Intermediate des zentralen Metabolismus umgesetzt. Dieses erfolgt primär über Reaktionen, die ähnlich denen der β-

Oxidation der Fettsäuren sind. Beide erstgenannten Klassen beinhalten von chemischer Seite interessante Reaktionen und werden im folgenden in einer kurzen Übersicht vorgestellt. Die einzelnen Abbauwege mit zuleitenden Modifikationsreaktionen sind auch in einer Reihe von Übersichtsartikeln ausführlich erläutert (Schink et al.1992; Heider und Fuchs 1997; Harwood et al. 1999; Schink et al. 2000).

1.2.1 Modifikationsreaktionen - Überführung in Schlüsselintermediate

Reaktionen ohne Veränderung des Redoxzustandes der Ring-C-Atome

Der Ligninabbau durch Pilze und Bakterien setzt eine Vielzahl methoxylierter Aromaten, wie z.B. Vanillat, Veratrat oder Guajacol, frei. In anoxischen Habitaten erfolgt eine Cob(I)alamin- abhänige Methylether-Spaltung unter Freisetzung der phenolischen Verbindung (Stupperich 1993).

Aliphatische Seitenketten mit drei oder einer höheren, ungeraden Anzahl C-Atomen werden analog der β-Oxidation der Fettsäuren verkürzt, so daß ein Benzoyl-CoA-Derivat gebildet wird. Phenylacetat und seine Derivate werden über eine α-Oxidation ebenfalls in ein Benzoyl- CoA-Derivat umgewandelt (Schneider et al. 1997).

Ein wichtiges Charakteristikum vieler Reaktionen des anaeroben Aromatenabbaus ist ein Ablauf auf der Stufe des Coenzym A-Esters. Hierfür scheinen in erster Linie reaktions- mechanistische Gründe (Buckel und Keese 1995), aber auch eine Rolle des Coenzyms bei der Substrataufnahme (Harwood und Gibson 1986) die Ursache zu sein. Die Veresterung des jeweiligen Substrats mit CoA wird über Ligasen katalysiert, welche dabei ATP zu PPi und AMP hydrolysieren.

Die anaerobe Hydroxylierung einer Seitenkette einer aromatischen Verbindung ist für den Abbau von p-Kresol in aeroben und denitrifizierenden Bakterien ausführlich untersucht worden (Hopper 1987; Hopper et al. 1991; Rudolphi et al. 1991). p-Kresol kann relativ leicht zu einem Chinonmethid oxidiert werden, an das gut Wasser angelagert werden kann. Für den aromatischen Kohlenwasserstoff Ethylbenzol ist eine anaerobe Oxidationsreaktion zum 1- Phenylethanol gezeigt worden, bei welcher der Sauerstoff ebenfalls letztendlich dem Wasser entstammt (Ball et al. 1996; Rabus und Heider 1998).

Die Identifizierung von Benzylsuccinat als Metabolit des Abbaus von Toluol (Evans et al.

1992) führte zu der Entdeckung einer außergewöhnlichen biochemischen Synthese. Die Methylgruppe von Toluol wird an die Doppelbindung von Fumarat addiert, wodurch

Benzylsuccinat gebildet wird (Biegert et al. 1996; Beller und Spormann 1997). Kürzlich wurde eine analoge Reaktion auch als einleitender Schritt des Abbaus von m-Xylol durch Azoarcus sp. Stamm T beschrieben (Krieger et al. 1999).

Carboxylierungen und Decarboxylierungen

Eine Reihe phenolischer Verbindungen wird zuerst carboxyliert, um eine Veresterung mit Coenzym A zu ermöglichen. Diese Reaktion ist für den anaeroben Abbau von Phenol (Tschech und Fuchs 1987, 1989), Hydrochinon (Gorny und Schink 1994a), Brenzkatechin (Gorny und Schink 1994b), o-Kresol (Rudolphi et al. 1991) und auch Anilin (Schnell und Schink 1991) gezeigt worden. Für mehrfach hydroxylierter Benzoatderivate, die über Resorcin, Phloroglucin oder Hydroxyhydrochinon abgebaut werden, ist hingegen eine Decarboxylierungsreaktion beschrieben worden (Tschech und Schink 1985; Brune und Schink 1992; Gallus und Schink 1998). Für Phthalate ist ebenfalls eine Decarboxylierung zu Benzoat bzw. Benzoyl-CoA postuliert worden (Nozawa und Maruyama 1988).

Reduktive Eliminierungen

Diese Modifikationsreaktionen spielen bei der Umwandlung einer Reihe von Benzoatderivaten in das zentrale Intermediat Benzoyl-CoA eine Schlüsselrolle. Insbesondere phenolische Verbindungen, die nicht über eines der Hydroxybenzole abgebaut werden, unterliegen diesen Reaktionen. Alle bisher beschriebenen reduktiven Dehydroxylierungen werden auf der CoA-Ester Stufe katalysiert (Glöckler et al. 1989; Bonting und Fuchs 1996;

Gibson et al. 1997; Gorny und Schink 1994a). Die reduktive Dehydroxylierung von 4- Hydroxybenzoyl-CoA in Thauera aromatica und auch Rhodopseudomonas palustris ist eingehend untersucht worden und wird in Kapitel 4.2.2 ausführlich besprochen.

Auch Amino- und Halogensubstituenten können reduktiv abgespalten werden. So wird z.B.

4-Aminobenzoyl-CoA, ein Intermediat des Abbaus von Anilin, zu Benzoyl-CoA desaminiert (Schnell und Schink 1991). Für Anthranilat (2-Aminobenzoat) ist ebenfalls eine reduktive Abspaltung der Aminogruppe postuliert worden (Lochmeyer et al. 1992). Die reduktive Dehalogenierung von Arylverbindungen wird in einer Reihe von Übersichtsartikeln detailliert erläutert (Mohn und Tiedje 1992; Wohlfarth und Diekert 1997; Fetzner 1998).

Hydroxylierungen

Der erste Hinweis auf eine anaerobe Hydroxylierung von Benzolderivaten stammt von Vogel und Grbic-Galic (1986). In methanogenen Mischkulturen, die auf Benzol oder Toluol in

Anwesenheit von H218

O wuchsen, wurden mit schwerem Sauerstoff markiertes Phenol bzw.

p-Kresol detektiert. Eine Charakterisierung der Kulturen oder eine weitergehende Untersuchung dieser interessanten Reaktionen ist leider nicht beschrieben.

Oxidationsreaktionen am aromatischen Ring wurden jüngst als einleitende Schritte des anaeroben Abbaus von α-Resorcylat (Gallus und Schink 1998) und Resorcin (Philipp und Schink 1998) in den denitrifizierenden Bakterien T. aromatica Stamm AR-1 und Azoarcus anaerobius beschrieben. In beiden Fällen wird der aromatische Ring durch Einführung einer weiteren Hydroxylgruppe zusätzlich destabilisiert. Produkte dieser Reaktionen sind Hydroxyhydrochinon aus Resorcin sowie 2,3,5-Trihydroxybenzoat aus α-Resorcylat. 2,3,5- Trihydroxybenzoat kann leicht decarboxyliert werden, wodurch ebenfalls Hydroxyhydrochinon als Produkt gebildet wird.

Als weitere Hydroxylierungs-Reaktion am aromatischen Ring sei die Pyrogallol- Phloroglucin Transhydroxylierung in Pelobacter acidigallici genannt (Brune und Schink 1990; Reichenbecher et al. 1994). Auch wenn hier keine Netto-Hydroxylierung stattfindet, so läßt sich doch die Reaktion formal als Abfolge Hydroxylierung von Pyrogallol zu Tetrahydroxybenzol - Dehydroxylierung von Tetrahydroxybenzol zu Phloroglucin beschreiben (Reichenbecher und Schink 1999).

1.2.2 Dearomatisierungsreaktionen - Umsatz der Schlüsselintermediate

Die Idee eines reduktiven Angriffs auf den aromatischen Ring des Benzoats wurde anhand von Arbeiten mit dem phototrophen Bakterium R. palustris entwickelt (Dutton und Evans 1969; Guyer und Hegemann 1969). Damals war die Beteiligung von Coenzym A noch nicht erkannt, und als Reduktionsschritt wurde ein 6-Elektronenübergang zum vollständig gesättigten Ring, dem Cyclohexancarboxylat, vermutet. Detaillierte spätere Arbeiten mit T.

aromatica und wiederum R. palustris zeigten jedoch, daß Benzoyl-CoA, nicht Benzoat, zu einem Dienderivat umgesetzt wird (Gibson und Gibson 1992; Koch et al. 1993; Boll und Fuchs 1995). Analog der Birch-Reduktion von Benzol wird für diese Reaktion eine sequentielle Abfolge ein-Elektronen-Reduktion - Protonanlagerung angenommen (Buckel und Keese 1995; Boll et al. 1997). Mit dem physiologischen Elektronendonor Ferredoxin (Boll und Fuchs 1998) ist dieses ein endergoner Prozeß, der in T. aromatica durch die Hydrolyse von wahrscheinlich 2 mol ATP pro mol Substrat getrieben wird (Boll et al. 1997).

Die drei Hydroxybenzole Phloroglucin, Hydroxyhydrochinon und Resorcin besitzen zueinander meta-ständige Hydroxylgruppen. Hierdurch wird das π-Elektronensystem derart destabilisiert, daß unter Ausbildung jeweiliger Ketotautomere eine „isolierte“ Doppelbindung im Ring bestehen kann, die relativ leicht reduziert werden kann (Whittle et al. 1976; Brune und Schink 1990; Kluge et al. 1990; Reichenbecher et al. 1999).

Ein fundamental anderer Weg der Dearomatisierung findet sich beim Abbau von Resorcin durch Azoarcus anaerobius (Philipp und Schink 1998) sowie von α-Resorcylat durch T.

aromatica AR-1 (Philipp und Schink 2000). Hier wird Hydroxyhydrochinon, Intermediat beider Abbauwege (s. Hydroxylierungen), von der Hydroxyhydrochinon-Dehydrogenase zu 2- Hydroxybenzochinon oxidiert.

Für einige Benzoat-Derivate wurde eine Ringreduktion mit anhaftenden weiteren Substituenten gezeigt. So können die CoA-Derivate von 2-Hydroxybenzoat (Bonting und Fuchs 1996), Gentisat (Gorny und Schink 1994c), Anthranilat (Schnell 1991), 3- Aminobenzoat (Schnell und Schink 1992) und 3-Methylbenzoat (Rudolphi et al. 1991) ohne vorherige Eliminierung der Substituenten dearomatisiert werden. Inwieweit diese Reduktionen spezifisch für den jeweiligen Abbauweg sind, oder Nebenreaktionen der Benzoyl-CoA Reduktase in diesen Bakterien darstellen (Boll und Fuchs 1995), bleibt zu klären.

1.3 Kresole und Hydroxybenzoate

Vorkommen und Bedeutung von Kresolen

Kresole (ortho-, meta-, and para-Methylphenol) werden für industrielle Zwecke primär durch Kohlevergasung, Destillation von Steinkohlenteer und aus Erdölrückständen gewonnen.

Zudem werden Kresole über eine Reihe synthetischer Verfahren dargestellt, z.B. durch Alkalischmelze von Toluolsulfonaten oder Chlortoluolen (Fieser und Fieser 1983). Die Anwendungsgebiete reichen von Bestandteilen in Holzschutz- und Desinfektionsmitteln, als Grundstoffe für Pestizide und einige Harze bis zum Einsatz als Antioxidantien und zur Produktion von synthetischem Vitamin E (Agency for Toxic Substances and Disease Registry 1990). Kresole besitzen eine hohe Warmblüter-Toxizität und werden von der Umweltbehörde der USA und ähnlichen Institutionen als Grundwasser verschmutzende Verbindungen aufgeführt (http://www.epa.gov 2000).

In einigen Organismen treten Kresole natürlich auf. So ist m-Kresol eine Komponente im Sekret der Giftdrüse des Mehlkäfers (Blankespoor et al. 1997) und p-Kresol im menschlichen Schweiß wird als Lockstoff für die Malariaüberträgerin Anopheles gambiae vermutet (Cork und Park 1996). Im menschlichen Darm wird p-Kresol durch Decarboxylierung von p- Hydroxyphenylacetat gebildet (Smith und Macfarlane 1996).

Der anaerobe Abbau von Kresolen

Wie erwähnt, wird der Abbau von p-Kresol in nitratreduzierenden Bakterien durch Hydroxylierung der Methylgruppe eingeleitet (Hoppper et al. 1991; Rudolphi et al. 1991). Das katalysierende Enzym, die p-Kresol-Methyl-Hydroxylase, enthält FAD und Cytochrom c als prosthetische Gruppen (Hopper et al. 1991) und bildet letztlich 4-Hydroxybenzylaldehyd als Produkt. Der weitere Abbau erfolgt über 4-Hydroxybenzoyl-CoA und Benzoyl-CoA (Rudolphi et al. 1991).

o-Kresol kann zu 4-Hydroxy-3-Methylbenzoat carboxyliert (Bissaillon et al. 1991; Rudolphi et al. 1991) und als solches weiter abgebaut werden (Rudolphi et al. 1991). Eine Hydroxylierung der Methylgruppe mit nachfolgender Oxidation zum 2-Hydroxybenzoat analog dem p-Kresol-Abbau wurde ebenfalls vorgeschlagen (Suflita et al. 1989; Schink et al.

1992), jedoch nicht experimentell nachgewiesen.

Über die Reaktionen des anaeroben Abbaus von m-Kresol ist erst wenig bekannt. Einige Evidenzen deuten auf einen Abbau über 2-Hydroxy-3-Methylbenzoat durch Carboxylierung in para-Position zur Hydroxylgruppe hin (Roberts et al. 1990; Ramanand and Suflita 1991;

Londry and Fedorak 1993). Eine Methylgruppen-Oxidation zum 3-Hydroxybenzylalkohol wurde als einleitender Schritt in einem nitratreduzierenden (Bonting et al. 1995) und einem sulfatreduzierenden Bakterium (Londry et al. 1997) vorgeschlagen. Die entsprechenden Enzymaktivitäten konnten jedoch nicht gezeigt werden.

Vorkommen und Bedeutung von Monohydroxybenzoaten

2-Hydroxybenzoat erfüllt in einer Reihe von Pflanzen regulatorische Funktionen (Raskin 1992); 4-Hydroxybenzoat ist u.a. Intermediat der Ubichinon- und Shikonin Biosynthese (Threlfall und Whistance 1970; Inouye et al. 1979) und kann als Abbauprodukt organischer Materie in freier Form in Böden detektiert werden (Whitehead 1964). Das dritte Isomer, 3- Hydroxybenzoat, besitzt im pflanzlichen Metabolismus eine vergleichsweise geringe Bedeutung. In einigen Mitgliedern der Familie Gentianaceae ist es Intermediat der Xanthonbiosynthese (Barillas und Beerhues 1997) sowie Bestandteil von verschiedenen

Bitterstoffen (van der Sluis und Labadie 1981). In einem Tropanalkaloid aus Cochlearea aretica wurde ebenfalls eine 3-Hydroxybenzoyl-Einheit gefunden (Liebisch et al. 1973). 3- Hydroxybenzoat erlangt Beachtung als Intermediat des anaeroben m-Kresol-Abbaus (Bonting et al. 1995; Londry et al. 1997) und möglicherweise des Abbaus von Protokatechuat in sulfatreduzierenden Bakterien (Gorny und Schink 1994b). In der chemischen Industrie werden alle drei Isomere zur Produktion vor allem von Farbstoffen und Pestiziden verwendet (Merck Index 1983; Oi et al. 1987).

Der anaerobe Abbau von Monohydroxybenzoaten

Tschech und Schink (1986) vermuteten für den Abbau von Monohydroxybenzoaten einen Verbleib der ortho- und para-Substituenten (Hydroxylgruppen) während der Ringreduktion, da gerade an diesen Positionen im weiteren Verlauf des Abbaus Oxidationsreaktionen stattfänden. Für 3-Hydroxybenzoat wurde hingegen eine reduktive Dehydroxylierung zum Benzoat vorgeschlagen (Tschech und Schink 1986). Durch intensive Studien mit nitratreduzierenden und anoxygen phototrophen Bakterien konnte gezeigt werden, daß 2- und 4-Hydroxybenzoat zu den korrespondierenden CoA-Estern aktiviert werden (Biegert et al.

1993; Gibson et al. 1994; Bonting und Fuchs 1996) und dann eine reduktive Abspaltung der Hydroxylgruppe unter Bildung von Benzoyl-CoA erfolgt (Brackmann und Fuchs 1993;

Bonting und Fuchs 1996; Gibson et al. 1997; Breese und Fuchs 1998). Die Veresterung mit Coenzym A wurde auch für 3-Hydroxybenzoat beschrieben (Heising et al. 1991; Biegert et al.

1993), der Nachweis einer 3-Hydroxybenzoyl-CoA-dehydroxylierenden Aktivität konnte jedoch nicht erbracht werden.

4-Hydroxybenzoat kann alternativ zum Abbau über Benzoyl-CoA zu Phenol decarboxyliert werden. Diese Reaktion erfolgt co-metabolisch in Clostridium hydroxybenzoicum während der Vergärung von Aminosäuren (Zhang und Wiegel 1990).

1.4 Zielsetzung

Ausgangspunkt der Arbeit waren Untersuchungen zur Vergärung von 3-Hydroxybenzoat durch Stamm BT. Zum ersten interessierte hier die Frage nach einer reduktiven Abspaltung der Hydroxylgruppe des 3-Hydroxybenzoats bzw. 3-Hydroxybenzoyl-CoA. Produkt dieser Dehydroxylierungsreaktion wäre Benzoat bzw. Benzoyl-CoA. Daraus folgt die Frage nach der

Natur des Benzoyl-CoA Wegs und insbesondere des Modus der Benzoyl-CoA Reduktion in Bakterien mit nur geringem Energie-Budget.

Der anaerobe Abbau des 3-Hydroxybenzoats wurde auch in Sulfat-reduzierenden und Nitrat-reduzierenden Bakterien untersucht. Als Vertreter der Sulfat-reduzierenden Bakterien wurde Desulfobacterium cetonicum verwendet. Der Abbau von 3-Hydroxybenzoat unter denitrifizierenden Bedingungen wurde mit dem Stamm BoNHB bearbeitet. Für beide Organismen wurde ebenfalls eine reduktive Abspaltung der Hydroxylgruppe als eine der einleitenden Reaktionen des Abbauweges angenommen.

Die zu Beginn dieser Arbeit vorliegenden Beschreibungen des anaeroben m-Kresol-Abbaus waren nicht überzeugend. Mit D. cetonicum bot sich ein Modellorganismus an, den Abbau dieser Verbindung zu untersuchen und beteiligte Enzymreaktionen nachzuweisen. Im Folgenden werden zuerst die Ergebnisse zum Abbau von m-Kresol und dann die Resultate zum 3-Hydroxybenzoat-Abbau besprochen.

2. MATERIAL UND METHODEN

2.1 Mikrobiologische Methoden

2.1.1 Herkunft der verwendeten Stämme

Sporotomaculum hydroxybenzoicum BT (DSM 5475) und der denitrifizierende Stamm BoNHB wurden im Rahmen meiner Diplomarbeit isoliert. Desulfobacterium cetonicum 480 (DSM 7267) wurde von Alexander S. Galushko zur Verfügung gestellt. Der Stamm Thauera aromatica K172 (DSM 6984) wurde der Stammsammlung des Lehrstuhls Prof. Schink der Universität Konstanz entnommen.

2.1.2 Medien und Kultivierungstechniken

Medien

Die Bakterienstämme wurden in Mineralmedium (Widdel und Pfennig 1981) kultiviert, welches in speziell konstruierten Kolben (Widdel 1980) hergestellt und autoklaviert wurde.

Das Medium war mit 30 mM Bicarbonat gepuffert. Für Stamm BT wurde Na2S (2 mM) oder Cystein (2 mM) als Reduktionsmittel verwendet. Für den Stamm 480 betrug die Konzentration des Reduktionsmittels Na₂S 1 mM. Oftmals wurden einige Kristalle Dithionit (Endkonzentration < 100 µM) dem Medium zugesetzt. Die denitrifizierenden Stämme BoNHB und K172 wurden in Medium ohne Reduktionsmittel oder mit 1 mM Ascorbat gezogen. Spurenelemente wurden in Form der Spurenelementlösung SL 10 bzw. SL 9 für Stamm 480 sowie der Selenit-Wolframat-Lösung (Widdel et al. 1983) zugesetzt. Als Vitaminzusatz wurde eine 7-Vitamine-Lösung (Widdel und Pfennig 1981) verwendet. Das Medium des Sulfat-reduzierenden Stammes enthielt 20 mM Na2SO4. Denitrifizierende Bakterien wurden in Gegenwart von 1 mM Na₂SO₄ als Schwefelquelle gezogen. Brackwasser- Medium wurde durch Zugabe von 10 g NaCl pro l und 1,75 g MgCl₂ x 6 H₂0 zum Grundmedium hergestellt.

Die Zubereitung der Medien erfolgte unter striktem Ausschluß von Luftsauerstoff (Widdel und Pfennig 1981). Nach Erkalten wurde das Grundmedium mit den angegebenen Zusätzen

versetzt und der pH-Wert mit steriler 1 M HCl oder 0,5 M Na2CO3 auf pH 7,2-7,6 eingestellt.

Das Medium wurde unter N2/CO2 Atmosphäre (80:20,v/v) in sterile Gefäße abgefüllt.

Kultivierungstechniken

Die Stammhaltung erfolgte in 50-ml Schraubdeckelflaschen. Für biochemische Experimente erfolgte die Kultivierung in 580- oder 1200-ml Infusionsflaschen (Müller-Krempel, Bülach, Schweiz), die mit 500 oder 1000 ml Medium gefüllt und mit Butylgummi-Septen verschlossen waren. Die Gasatmosphäre war ein Gemisch aus N2/CO2 (80:20,v/v). Alternativ wurden 5-l oder 10-l Steilbrustflaschen zur Kultivierung im größeren Maßstab verwendet. Die Aufnahme von Substratspektren wurde in 20-ml Hungate Röhrchen durchgeführt. Die Inkubation der Kulturen erfolgte bei 28°C im Dunkeln.

Substrat-Stammlösungen wurden entweder autoklaviert oder in Fällen von hitzelabilen und oxidationsempfindlichen Substanzen sterilfiltriert. In letztere Kategorie fallen alle aromatischen Verbindungen mit mindestens zwei Hydroxylgruppen. Alle Stammlösungen wurden unter N2-Atmosphäre gelagert. m-Kresol und Toluol wurden mittels steriler Spritzen aus den Vorratsgefäßen des Herstellers entnommen und direkt zu den Kulturen gegeben. Für Kultivierungen auf Toluol wurde das Medium mit sterilem Heptamethylnonan (1 %, v/v) als organischem Carrier versetzt.

2.1.3 Bestimmung des G+C Gehalts der DNA und Analyse der 16S rDNA

Die Basenzusammensetzung der DNA wurde nach Isolierung (Murray und Thompson 1980) und enzymatischem Verdau mittels HPLC bestimmt (Mesbah et al. 1989). Die Analyse wurde von Herrn Jahnke (DSMZ, Braunschweig) durchgeführt. Die phylogenetische Einordnung von Stamm BT mittels 16S rDNA-Analyse wurde von Dr. Rainey (DSMZ, Braunschweig) durchgeführt. Die Methode für die Extraktion genomischer DNA, die Amplifikation der 16S rDNA mittels PCR und die Aufreinigung der Produkte ist bei Rainey et al. (1992, 1993) beschrieben. Das phylogenetische Dendrogramm wurde nach der least square Methode (De Soete 1983) erstellt.

2.1.4 Bestimmung von Zellerträgen und Wachstumsparametern

Wachstumskurven wurden erstellt, indem die Zunahme der Trübung in den Kulturen bei 578 nm Wellenlänge (OD578nm) photometrisch verfolgt wurde (s.a. 2.3.1). Die Wachstumsrate (µ) wurde durch halblogarithmische Auftragung aus der Steigung des Graphen ermittelt. Die Verdopplungszeit (t_d) ergibt sich aus der Beziehung t_d = ln2 / µ. Zur Bestimmung der Wachstumserträge von D. cetonicum wurde die Korrelation zwischen OD und Trockenzellmasse gravimetrisch bestimmt (Brune 1990). Eine OD_578nm = 0.1 entsprach 18 mg/l (A.S. Galushko, pers. Mitt.). Aus dem Anstieg der OD578nm während der logarithmischen Wachstumsphase, der entsprechenden Zunahme der Trockenzellmasse (∆X) und dem Substratverbrauch (∆S) in diesem Zeitintervall wurden die molaren Zellerträge (Ys) über die Beziehung Ys = ∆X / ∆S berechnet. Die in vivo Umsatzraten der Substrate ergeben sich - unter der Annahme, daß Ys konstant ist - aus der Beziehung dS / dt = µ X / Ys.

2.2 Biochemische Methoden

2.2.1 Zellernte

Die Zellen aller Stämme wurden jeweils in der späten logarithmischen Phase geerntet. In einer Anaeroben-Kammer (Coy, Ann Arbor, MI, USA) wurden die Kulturen unter N₂/H₂ Atmosphäre auf Zentrifugenbecher aus Polypropylen oder Polycarbonat verteilt. Die Zellen wurden in GS-3 oder GSA Rotoren in einer Sorvall RC5-B Zentrifuge (Du Pont de Nemours, Bad Homburg, Deutschland) sedimentiert. Für die Stämme BT, BoNHB und K172 genügten 10 000 x g bei 4°C und 20 min; für den Stamm 480 wurden 15 000 x g und 30 min bei 4°C verwendet. Das jeweilige Pellet wurde in der Anaeroben-Kammer in für den beabsichtigten Versuch benötigtem Puffer resuspendiert, erneut zentrifugiert und schließlich in einem geringen Puffervolumen aufgenommen.

2.2.2 Zellsuspensionsversuche

Suspensionsversuche wurden mit frisch geernteten Zellen in 5-ml Hungate Röhrchen unter striktem Ausschluß von molekularem Sauerstoff durchgeführt. Die optische Dichte der Suspensionen wurde auf Werte zwischen 10 und 20 eingestellt.

Der Einfluß alkylierender Reagentien auf die Rate des 3-Hydroxybenzoat-Abbaus durch die Stämme BT und BoNHB wurde in dichter Zellsuspension getestet. Propyliodid wurde aus 1- 10 mM ethanolischen Stammlösungen zu Suspension in Röhrchen gegeben, die mit Aluminiumfolie umwickelt waren. Zur Beleuchtung einer mit Propyliodid versetzten Zellsupension wurde eine Kaltlichtlampe (40 W) verwendet. Methyliodid, Iodacetamid, Iodoacetat, N^α-p-Tosyl-L-Lysinchloromethylketon (TLCK) und N-Tosyl-Phenylalanin- chloromethylketon (TPCK) wurden aus 1-50 mM methanolischen Stammlösungen den Zellsuspensionen zugesetzt. Der Effekt von N₂O wurde durch Austausch der Gasatmosphäre von N₂ durch N₂O getestet. Die Inkubationszeit der alkylierenden Agentien betrug 5 min sowie 30 min für N2O. Die 3-Hydroxybenzoat-Konzentration betrug in allen Ansätzen 1 mM.

Zusätzlich wurden Kontrollansätze mit Methanol oder Ethanol durchgeführt.

2.2.3 Herstellung von zellfreien Extrakten und Fraktionierung des Extrakts

Der Zellaufschluß wurde mit einer French-Presse (Aminco, Silver Spring, MD, USA) ausgeführt. Nach bis zu 3 Passagen bei 138 MPa wurde der Aufschluß mikroskopisch kontrolliert. Zelltrümmer und intakte Zellen wurden durch zumeist zweimalige Zentrifugation (15 800 - 20 000 x g, 4°C, 10 min) entfernt.

Der zellfreie Extrakt wurde durch Ultrazentrifugation (100 000 x g, 4°C, 1 h) in lösliche und Membranfraktion getrennt. Die Zentrifugation erfolgte in einem TLA-100.4-Rotor (Beckman Coulter, München, Deutschland) in einer Optima TL-Ultrazentrifuge (Beckman Coulter). Die Membranfraktion wurde in geeignetem Puffer gewaschen, erneut zentrifugiert und anschließend in demselben Puffer resuspendiert. Im Falle von sauerstoffempfindlichen Enzymen wurden alle Schritte, bei denen Zutritt der Gasatmosphäre zum Extrakt möglich war, in der Anaeroben-Kammer durchgeführt.

2.2.4 Bestimmung von Enzymaktivitäten

Enzymaktivitäten wurden spektralphotometrisch entweder in kontinuierlichen Tests oder diskontinuierlich nach Trennung von Substrat(en) und Produkt(en) mittels HPLC gemessen.

Alle Aktivitäten wurden, soweit nicht anders spezifiziert, bei Raumtemperatur gemessen und

beruhen auf Messungen mit mindestens drei unabhängig voneinander hergestellten zellfreien Extrakten bzw. Extraktfraktionen. Die Ansätze enthielten, wenn nicht anders angegeben, zwischen 10 und 200 µg Protein ml^-1. Durch Kontrollen mit hitzedenaturiertem Extrakt (90°C, 20 min) wurde sichergestellt, daß die gemessenen Umsätze Protein-katalysiert waren. Soweit erforderlich wurden die einzelnen Tests unter anoxischen Bedingungen durchgeführt. In diesen Fällen erfolgte die Zugabe anoxischer Substratlösungen und die Entnahme von Proben für die HPLC-Analyse mit gasdichten Unimetrics Spritzen (Macherey&Nagel, Düren, Deutschland). Diskontinuierliche Tests wurden in 5-ml Hungate Röhrchen durchgeführt, die mit Butylgummistopfen verschlossen waren.

Enzyme des Abbaus von m-Kresol, p-Kresol und Toluol

3-Hydroxybenzylsuccinat-Synthase und Benzylsuccinat-Synthase (EC 4.1.99.) Aktivitäten wurden in reduziertem Kaliumphosphatpuffer (KPP) (50 mM, pH 7,0-7,2, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1, 2,5 mM DTE) bei 30°C bestimmt. Das Vorhandensein einer 4- Hydroxybenzylsuccinat-Synthase wurde mit dem gleichen Testsystem geprüft. Der Proteingehalt lag zwischen 1 und 3 mg Protein ml^-1. Auf strikten Ausschluß von molekularem Sauerstoff während der Durchführung des Assays mußte geachtet werden; Spritzen wurden vor Substratzugabe und Probenentnahme mit Ti³⁺-Citrat (50 mM) gespült und Substrat- Stammlösungen enthielten 2,5 mM DTE und 0,5 mM Ti³⁺-Citrat als Reduktionsmittel. Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und in eiskalte 100 mM Phosphorsäure überführt. Substrat- und Produktkonzentrationen wurden mittels HPLC-Analyse quantifiziert.

Die Sauerstoffempfindlichkeit der 3-Hydroxybenzylsuccinat Synthase wurde mit oxischem, zellfreiem Extrakt geprüft. Ein leichter Luftstrom wurde hierzu für 10 min über den Extrakt geführt. Der Test wurde durch Zugabe von m-Kresol gestartet. Nach 30 min wurde die Gasphase 5 min lang gegen N₂ ausgetauscht und nach weiteren 30 min erfolgte die Zugabe von Ti(III)NTA (Endkonzentration Ti³⁺: 5 mM) zur Reduktion des Ansatzes. In einem Kontrollansatz wurde der Extrakt mit N₂ anstatt mit Luft beblasen.

Eine mögliche Oxidation der Methyl-Gruppe des m-Kresols wurde in anoxischem KPP (50 mM, pH 7,0, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1) in einem diskontinuierlichen Testsystem überprüft. Als potentielle Elektronenakzeptoren wurden NAD(P), FAD, Phenazinemethosulfat, 2,6-Dichlorophenol-indophenol (DCPIP) und Methylenblau eingesetzt.

Der Proteingehalt lag zwischen 1 und 3 mg Protein ml^-1. Die Substratkonzentration im Verlauf der Zeit wurde über HPLC-Analyse bestimmt.

Die Anwesenheit der p-Kresol Methylhydroxylase (EC 1.17.99.1) wurde nach Hopper et al.

(1991) in anoxischem KPP (50 mM, pH 7,0, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1) geprüft.

Die Oxidation von 3-Hydroxybenzylsuccinat wurde diskontinuierlich in reduziertem KPP (50 mM, pH 7,0-7,2, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl₂ x 6 H₂O l^-1, 2,5 mM DTE) gemessen. Das Testsystem zur Bestimmung der 3-Hydroxybenzylsuccinat Synthase wurde durch Zugabe einer CoA-Quelle und/oder Elektronenakzeptoren zu verschiedenen Zeitpunkten während des Tests erweitert. Als CoA-Quelle wurden Succinyl-CoA, Acetyl-CoA (je 2 mM) sowie freies CoA (1 mM) plus ATP (5 mM) eingesetzt. Eine Mischung aus NAD, NADP und FAD (je 1 mM Endkonzentration) stellte die Elektronenakzeptoren bereit. Zusätzlich zur direkten Analyse der Proben wurden Aliquots der Ansätze nach einer alkalischen Behandlung [KOH (pH12), 80°C, 20 min] analysiert.

Enzyme des reduktiven 3-Hydroxybenzoat-Abbaus

3-Hydroxybenzoyl-CoA Ligase (EC 6.2.1.) wurde diskontinuierlich nach Schnell und Schink (1991) oder kontinuierlich in einem gekoppelten photometrischen Test (Geissler et al. 1988) gemessen.

3-Hydroxybenzoat CoA-Transferase wurde diskontinuierlich mittels HPLC-Analyse oder in einem kontinuierlichen photometrischen Test verändert nach Buckel (1986) bestimmt. Der diskontinuierliche Ansatz enthielt Acetyl-CoA oder Butyryl-CoA (0,5-1,0 mM) als CoA- Donor und 3-Hydroxybenzoat (0,5-1,0 mM) als CoA-Akzeptor in entgastem KPP (50 mM, pH 7,0). Der photometrische Ansatz enthielt 100 mM Na-Acetat, 1,0 mM 5,5´-Dithiobis(2- nitrobenzoat) und 0,1 mM 3-Hydroxybenzoyl-CoA in KPP (50 mM, pH 7,0). CoASH wurde durch die endogene Phosphotransacetylase freigesetzt und die Absorption bei 412 nm (ε = 14 mM^-1 cm^-1) verfolgt. In Fällen geringer Phosphotransacetylase-Aktivität, z.B. bei Fraktionierungsexperimenten, wurden den Ansätzen 1,0 mM Oxalacetat und 20 µg Citrat Synthase zugesetzt.

Der Nachweis einer 3-Hydroxybenzoyl-CoA-Reduktase (dehydroxylierend) wurde in der Anaeroben-Kammer durchgeführt. Hierzu wurden die Reaktionsgefäße auf 30°C mittels eines Thermomixers temperiert. Der Reaktionsansatz enthielt 0,1-1,0 mM chemisch synthetisiertes 3-Hydroxybenzoyl-CoA und 800 µM Cob(I)alamin in TRIS/HCl-Puffer oder KPP (beide 50 mM, pH 7,2) mit Proteingehalten bis zu 4 mg ml^-1. Der Puffer war mit H2 mittels eines Pd/Aktivkohle-Katalysators [0.005% (w/v)] reduziert worden. Die Reaktion wurde diskontinuierlich über HPLC-Analyse verfolgt. Neben Cob(I)alamin wurden die folgenden

Elektronendonatoren getestet: NAD(P)H, FADH2, FMNH2, Methylviologen, Benzylviologen, Dithionit und DTE. Die Viologene und Flavine wurden durch Ti(III) Citrat oder Dithionit vorreduziert. Neben 3-Hydroxybenzoyl-CoA wurden auch 3-Hydroxybenzoat plus Acetyl- CoA oder Butyryl-CoA (je 5 mM) eingesetzt. Die Sauerstoffempfindlichkeit wurde wie bei der 3-Hydroxybenzylsuccinat-Synthase beschrieben geprüft.

Eine 3-Hydroxybenzoyl-CoA-Reduktase (dearomatisierend) in D. cetonicum wurde diskontinuierlich mittels HPLC-Analyse in reduziertem KPP (50 mM, pH 7,2, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1, 2,5 mM DTE) gemessen. Zuzüglich zur direkten Analyse der Proben wurden Aliquots der Ansätze nach einer alkalischen Behandlung [KOH (pH12), 80°C, 20 min] analysiert. Als Elektronendonatoren wurden NADH, Methylviologen, Benzylviologen und Ti(III) Citrat in Konzentrationen zwischen 0,5 und 2 mM eingesetzt. Die Viologene wurden entweder durch Ti(III) Citrat oder durch die im zellfreien Extrakt vorhandene Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.99.) reduziert. Im letzteren Fall wurde der Ansatz mit Na- Formiat (10 mM) versetzt. Die spezifische Aktivität der Formiat-Dehydrogenase in D.

cetonicum mit Methylviologen als Elektronenakzeptor liegt bei 3.2 µmol min^-1 (mg Protein)^-1 (Janssen und Schink 1995a). 3-Hydroxybenzoyl-CoA wurde über die CoA-Ligase-Reaktion bereit gestellt. Hierfür enthielt der Ansatz HSCoA (0.5-1.0 mM) und ATP (5 mM) sowie in einigen Fällen Phosphoenolpyruvat (10 mM) und Pyruvatkinase (10 U). Die Reaktion wurde entweder durch Zugabe von 3-Hydroxybenzoat (1,0 mM) oder Ti(III) Citrat bzw. Formiat gestartet.

Enzyme des oxidativen 3-Hydroxybenzoat-Abbaus

Die Oxidation von 3-Hydroxybenzoat und von 2,5-Dihydroxybenzoat (jeweils 0,1-1,0 mM) wurde in anoxischem KPP (50 mM, pH 7,2) verfolgt. Als Elektronendonatoren wurden DCPIP, K3Fe(CN)6 oder NO3-

eingesetzt. Die Konzentration der Elektronenakzeptoren betrug zwischen 1 und 5 mM.

Hydroxyhydrochinon-Dehydrogenase wurde nach Philipp und Schink (1998) bestimmt. Der Testansatz enthielt 1,0 mM Hydroxyhydrochinon und 2,0 mM KNO3 in anoxischem Tris/HCl Puffer (50 mM, pH 7,8).

Enzyme des Benzoyl-CoA Wegs

Benzoat CoA-Transferase und Benzoyl-CoA Ligase (EC 6.2.1.25) wurden analog den entsprechenden 3-Hydroxybenzoat-aktivierenden Enzymen gemessen.

Die Anwesenheit der Benzoyl-CoA-Reduktase (EC 1.3.99.15) wurde diskontinuierlich in 5- ml Hungate Röhrchen oder in der Anaeroben Kammer geprüft. Abweichend von dem in Koch und Fuchs (1993) beschriebenen Testsystem mit ¹⁴C-markiertem Benzoyl-CoA wurde ¹²C- Benzoyl-CoA in KPP oder Tris/HCl Puffer (beide 50 mM, pH 6,0-8,0, vorreduziert durch H₂/Pd-Katalysator) eingesetzt. Die Benzoyl-CoA Konzentration betrug 0,1-1,0 mM. Als Elektronenakzeptoren wurden NAD(P)H, FADH₂, FMNH₂, Methylviologen, Benzylviologen, Dithionit und DTE eingesetzt. Die Viologene und Flavine wurden durch Ti(III) Citrat oder Dithionit vorreduziert. In einigen Fällen wurden MgATP (5 mM), Phosphoenolpyruvat (10 mM) und Pyruvatkinase (10 U) oder Acetyl-CoA den Ansätzen zugegeben. Der Proteingehalt lag zwischen 1 und 5 mg Protein ml^-1. Proben (100 µl) wurden gezogen, mit 5 M KOH (5 µl) versetzt und erhitzt (80°C, 20 min). Sodann wurden die Proben mit 5M H₃PO₄ (5 µl) neutralisiert, zentrifugiert (15,800 × g, 10 min) und bei 233 nm Wellenlänge mit der HPLC analysiert.

Glutaryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.7) wurde nach Stams et al. (1984) bestimmt. Der Ansatz enthielt 0,5 mM Glutaryl-CoA, 1,0 mM K3Fe(CN)6 (ε420 nm = 0,9 mM^-1 cm^-1) und 0,1 mM Phenanzinmethosulfat in KPP (50 mM, pH 7,2).

Glutaconyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1.1.70) wurde in einem Testsystem modifiziert nach Buckel (1986) gemessen. Der Ansatz enthielt 1 mM K2-Glutaconat, 0,2 mM Acetylphosphat, 1 mM NAD, 0,2 mM CoASH und Hilfsenzyme aus Acidaminococcus fermentans in KPP (50 mM, pH 7,2, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM DTE). Die Reaktion wurde bei 334 nm Wellenlänge verfolgt.

Acetat CoA-Transferase (EC 2.8.3.8) wurde mit dem gleichen photometrischen Test wie 3- Hydroxybenzoate CoA-Transferase gemessen. 3-Hydroxybenzoyl-CoA wurde durch Butyryl- CoA ersetzt.

Butyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.2), Phosphotransacetylase (EC 2.3.1.8) und Acetate-Kinase (EC 2.7.2.1) wurden nach Bergmeyer (1983) bestimmt.

Sonstige Enzyme

Hydrogenase (EC 1.18.99.1) wurde nach Diekert und Thauer (1978) bestimmt. Fumarat- Reduktase (EC 1.3.1.6) wurde wie in Beh et al. (1993) beschrieben geprüft und Malat- Dehydrogenase (EC 1.1.1.37) wurde vereinfacht nach Stams et al. (1984) gemessen. Der Testansatz enthielt 0,3 mM Oxalacetat und 0,25 mM NADH in KPP (50 mM, pH 7,0).

2.3 Analytische Methoden

2.3.1 Spektralphotometrie

Zur Bestimmung der optischen Dichte (O.D.) von Bakterienkulturen, zur Messung von Enzymaktivitäten in kontinuierlichen Testverfahren und für colorimetrische analytische Methoden wurde ein Einstrahl-Spektralphotometer (Modell 100-40; Hitachi, Tokyo, Japan oder Spectronic 70; Bausch-Lomb) verwendet. Die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit bei Enzymtests wurde mit einem SE-120 Metrawatt-Schreiber (ABB-Goerz, Wien, Österreich) aufgezeichnet. Aus der Steigung des Graphen und dem Lambert-Beer´schen Gesetz konnte die Volumenaktivität des Enzyms im Testansatz berechnet werden. Die Messungen erfolgten je nach Meßwellenlänge in Halbmikroküvetten aus Quarzglas oder optischem Spezialglas mit jeweils 1 cm Schichtdicke. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden in einem Uvikon 930 Zweistrahl-Photometer (Kontron, Zürich, Schweiz) aufgenommen.

2.3.2 Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)

Die Konzentration an Natriumionen in Ansätzen zur Bestimmung der Glutaconyl-CoA Decarboxylase wurde mit einem Atomabsorptionsspektrometer (3030B, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) bei 589 nm Detektionswellenlänge in einer Acetylenflamme bestimmt.

Die Na⁺-Konzentration wurde durch Verdünnung mit 2 mM CsCl2-Lösung auf 5 - 200 µM in den Proben eingestellt.

2.3.3 Gaschromatographie (GC)

Die Quantifizierung von molekularem Wasserstoff erfolgte nach Trennung des Inhalts der Gasprobe auf einer gepackten Molekularsiebsäule [1m Länge, 2mm Durchmesser, Molekularsieb 5 Å, 60/80 (Serva, Heidelberg, Deutschland)] und N2 als Trägergas (30 ml/min) bei Raumtemperatur mit dem Spurengasdetektor RGD-2 (Wolters, Düsseldorf, Deutschland). Das Detektionsprinzip beruht auf einer Bildung von Quecksilberdampf aus erwärmten Quecksilberoxid durch reduzierende Gase. Die Bildung des Quecksilberdampfes wird bei 254 nm photometrisch verfolgt. Die Aufzeichnung und Auswertung der Chromatogramme erfolgte mit einem D-2000 Integrator (Merck-Hitachi, Darmstadt,

Deutschland). Die Wasserstoffkonzentration in Proben wurde durch Vergleich der korrespondierenden Peakflächen mit externen Standards bekannter Konzentration bestimmt.

2.3.4 Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektroskopie (GC/MS) Probenvorbereitung

3-Hydroxybenzylsuccinat wurde in m-Kresol-gewachsenen D. cetonicum Kulturen über GC/MS nachgewiesen. Aus ausgewachsenen Kulturen (60 ml) wurden die Zellen durch Zentrifugation (8000 x g, 30 min, 4°C) entfernt und der Überstand durch Zugabe von konzentrierter HCl (35 %) auf pH < 2 angesäuert sowie dreimal mit Diethylether extrahiert.

Die Etherfraktion wurde bei Raumtemperatur auf ein kleines Restvolumen eingedampft und mit etherischem Diazomethan derivatisiert (Schwetlick 1970). Überschüssiges Diazomethan wurde durch Zugabe etherischer Essigsäure entfernt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur eingedampft und der Rückstand in Heptan gelöst. 3- Methoxybenzylsuccinatdimethylester als Referenz wurde gleichfalls durch Derivatisierung von chemisch synthetisiertem 3-Hydroxybenzylsuccinat (Kapitel 2.4.2.) mit Diazomethan hergestellt.

GC/MS Analyse

Das GC/MS Gerät bestand aus einem Gaschromatographen Modell HP 6890 (Hewlett- Packard, Waldbronn, Deutschland) mit einer DB-5 MS fused-silica Säule (30 m Länge, 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 µm Filmdicke; J&W Scientific, Köln) und einem HP 5973 Mass Selective Detector (Hewlett-Packard). Die erhaltenen Daten wurden mittels der Hewlett- Packard Software G1034C analysiert. Ein Temperaturprogramm beginnend mit 50°C (gehalten für 1 min) und ansteigend bis 280°C (10°C min^-1; gehalten für 2 min) wurde zur Trennung der injizierten Verbindungen ausgeführt. Die Temperatur des Injektions-Ports betrug 250°C und der Gasfluß war 3 ml/min. Injektionen waren splitless, wobei der split nach 0,5 min eingesetzt wurde. Spektren wurden zwischen 50 und 350 Masseneinheiten (Da) mit einer Rate von 2 Hz aufgenommen.

2.3.5 Dünnschichtchromatographie (DC)

Der Verlauf der 3-Hydroxybenzylbernsteinsäure-Synthese wurde dünnschichtchromato- graphisch auf Kieselgel 60 F₂₅₄-Aluminiumplatten mit 0,2 mm Schichtdicke (Merck,

Darmstadt, Deutschland) verfolgt. Das Laufmittel bestand aus Toluol, Essigsäureethylester und Essigsäure im Verhältnis 4:1:0,05.

2.3.6 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die verwendete HPLC-Anlage System Gold® (Beckman Coulter) bestand aus zwei Hochdruck-Pumpen, Modell 116 bzw. 126 und einem UV/VIS-Detektor Modell 166 bzw. 168 oder einem Refraktionsindexdetektor (Modell ERC-7512, Erma, Tokyo, Japan). Die Proben wurden entweder über ein manuelles Injektionsventil (Beckman 210A Valve) oder über einen automatischen Probengeber (Beckman Autosampler Modell 502 oder Abimed-Gilson Modell 234, Langenfeld, Deutschland) aufgegeben. Die Auswertung der Chromatogramme und UV/VIS-Absorptionsspektren erfolgte durch die Software des System Gold®,) Version 3.1.

Eluierende Verbindungen wurden durch Vergleich mit internen und externen Standards identifiziert und quantifiziert. Aromatische CoA-Ester wurden zusätzlich durch Analyse der Säure nach alkalischer Hydrolyse [KOH (pH 12), 80°C, 20 min] bestimmt.

Mononukleare aromatische Verbindungen

Alle phenolischen und alle carboxylierten einkernigen aromatischen Verbindungen wurden isokratisch über eine reversed-phase Säule (GROM-SIL 120, ODS-5 ST, 5 µm, 150 x 5 mm, GROM, Herrenberg, Deutschland) getrennt. Der Anteil der organischen Phase (in der Regel MeOH) variierte je nach Hydrophobizität der zu trennenden Substanzen zwischen 16 % und 60 %. Als wässrige Phase wurden Ammoniumphosphatpuffer (100 mM, pH 2,6) oder KPP (10 mM, pH 2,2) eingesetzt. Detektiert wurde jeweils bei einem UV-Absorptionsmaximum der jeweiligen Verbindung, welches zuvor durch Aufnahme eines Absorptionsspektrums ermittelt oder der Literatur entnommen wurde.

Coenzym A und Coenzym A-Ester

Die Trennung von CoA und CoA-Estern erfolgte ebenfalls über eine reversed-phase Säule.

Die organische Phase war entweder MeOH oder Acetonitril und für die wässrige Phase wurden Ammoniumphosphatpuffer (100 mM, pH 2,6) oder 0.01 % Trifluoressigsäure (pH 2,2) verwendet. Letztere wurde insbesondere zur Reinigung von CoA-Estern mittels HPLC benutzt. Für CoA-Ester mit aromatischen Säureresten oder mit cyclischen aliphatischen Resten wurde in der Regel ein Gradientenprogramm beginnend mit 10 % organischer Phase

und innerhalb 7 min auf 70 % organischer Phase ansteigend ausgeführt. Nach weiteren 4 min wurde die Säule mit 10 % organischer Phase äquilibriert. Für CoA-Ester mit Fettsäureresten wurde ein Gradient beginnend mit 5 % organischer Phase und innerhalb 30 min auf 25 % ansteigend verwendet.

Corrinoide

Zur Corrinoid-Bestimmung in S. hydroxybenzoicum wurde zellfreier Extrakt (144-172 mg Protein) zweimal in jeweils 10 ml Methanol mit 1 % KCN (w/v) bei 80°C für 30 min inkubiert (modifiziert nach Kengen et al. 1988). Die Methanolfraktionen wurden vereint und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in 250 µl Methanol aufgenommen und zentrifugiert (15 800 x g, 5 min). Der Überstand hieraus wurde auf ca. 80 µl durch Verdampfung eingeengt und in die HPLC (reversed-phase Säule) injiziert. Die Elution der aufgetragenen Substanzen erfolgte über einen KPP (10 mM, pH 2,2) / Acetonitril Gradienten (10% Acetonitril auf 60 % Acetonitril in 25 min). Die UV/VIS Absorptionsspektren der eluierenden Verbindungen wurden mit einem Beckman 168 Photodiodendetektor im Bereich von 200 - 600 nm aufgenommen. Als Standard wurde CN-Cobalamin verwendet.

Fettsäuren und Dicarbonsäuren

Die Trennung von flüchtigen Fettsäuren sowie von Succinat, Fumarat und Malat erfolgte über eine Aminex® HPX-87H Säule (300 x 7.8 mm; BioRad, Hercules, CA, USA) mit 5 mM H2SO4 als mobiler Phase und einer Flußrate von 0.6 ml/min bei 40°C. Für die Detektion der eluierenden Verbindungen wurde ein Refraktionsdetektor eingesetzt. Die Datenübertragung und Umwandlung vom Detektor zur Software des System Gold® wurde über ein Analog- Digital-Interface AI 402 (Beckman Coulter) vermittelt.

2.3.7 Colorimetrische Bestimmungen Bestimmung des Proteingehalts

Der Proteingehalt in Proben wurde nach Bradford (1976) mit Rinderserum-Albumin als Standard bestimmt.

Bestimmung von Sulfid nach Cline

Sulfid bildet in saurer Lösung in Gegenwart von Fe³⁺-Ionen als Oxidationsmittel mit dem Reagens 4-Amino-N,N-Dimethylamin den Farbstoff Methylenblau. In Proben wurde die

Konzentration des gebildeten Farbstoffs durch Messung der Absorption bei 670 nm bestimmt (Cline 1969).

2.4 Chemikalien und Gase

2.4.1 Synthese von CoA-Estern

3-Hydroxybenzoyl-CoA, Cyclohex-1-encarboxyl-CoA und Cyclohexancarboxyl-CoA wurden nach Wieland [siehe Decker (1959)] und Merkel et al. (1989) synthetisiert. Die Synthese wurde in 20 mM Bicarbonat-Puffer (pH 7,2) unter N₂/CO₂ Atmosphäre (80:20, v/v) durchgeführt. Die bei Merkel et al. (1989) beschriebene Alkalisierung des Reaktionsansatzes wurde nicht ausgeführt. Acetyl-CoA, Butyryl-CoA und Succinyl-CoA wurden durch Umsatz von freiem CoA mit den korrespondierenden Anhydriden nach Simon und Shemin (1953) synthetisiert. Alle CoA-Ester-Lösungen wurden über eine semipräparative HPLC-Säule (Beckman Coulter, Ultrasphere® 5 µm Spherical 80 Å Pore, Semi-Prep, 250 mm x 10 mm) gereinigt. Die CoA-Ester-enthaltenden Fraktionen wurden lyophilisiert und anschließend die kristallinen CoA-Ester in 10 mM KPP (pH 5,0-6,0) gelöst.

2.4.2 Synthese von 3-Hydroxybenzylbernsteinsäure

3-Hydroxybenzylbernsteinsäure wurde nach Stobbe (1911) durch Kondensation von 3- Benzyloxybenzaldehyd mit Bernsteinsäurediethylester zu 3-Benzyloxybenzyliden- bernsteinsäure mit nachfolgender katalytischer Hydrierung synthetisiert. Zur Synthese von 3- Benzyloxybenzylidenbernsteinsäure wurde 3-Benzyloxybenzaldehyd (15 g, 70 mmol; Rf- Wert: 0.66) in methanolischem Natrium-Methanolat (10 g Natrium in 80 ml Methanol) gelöst.

Bernsteinsäurediethylester (13.5 g, 80 mmol) wurde über einen 5-minütigen Zeitraum zugetropft. Die Lösung wurde 2 h in einem Wasserbad unter Rückfluß gekocht und dann zu 100 ml H2O gegeben. Der Methanol wurde durch Verdampfung entfernt und die wässrige Phase mit Diethylether extrahiert, um überschüssigen Aldehyd zu entfernen. Nach Ansäuern der wässrigen Phase mit konzentrierter HCl (35 %) fiel ein gelbliches Produkt aus. Dieses wurde aus Essigsäure umkristallisiert und als 3-Benzyloxybenzylidenbernsteinsäure durch ¹H- NMR in CD3SOCD3 identifiziert (Ertrag: 9.1 g, 41 %; Schmelzpunkt: 169°C; Rf-Wert: 0.13).

Die Aufnahme des Spektrums erfolgte mit einem Bruker AC250 Instrument (Bruker Aanlytik, Rheinstetten, Deutschland). Die Elementaranalyse ergab C = 69.4 % und H = 5.1 %; laut der Formel C18H16O5 wären C = 69.2 % und H = 5.1 % erwartet worden.

Zur Synthese von 3-Hydroxybenzylbernsteinsäure wurde 3-Benzyloxybenzylidenbernstein- säure (3.5 g, 11 mmol) in 40 ml 0.625 M NaOH gelöst und katalytisch hydriert, wobei ebenfalls die Benzyl-Schutzgruppe abgespalten wurde. Der Katalysator wurde durch Zugabe von festem NaOH zu einer Raney-Nickel Suspension (8 g in 50 ml) erhalten. Das Versetzen der Katalysator-Suspension mit NaOH erfolgte so lange bis eine exotherme Reaktion ausblieb.

Der Katalysator wurde zur 3-Benzyloxybenzylidenbernsteinsäure-Lösung gegeben und das Reaktionsgefäß solange mit H2 begast, bis mittels DC kein Produkt nachgewiesen werden konnte (30 h). Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat mit 2 M HCl angesäuert. Diese Lösung wurde mit NaCl gesättigt und gründlich mit Diethylether extrahiert. Nach Verdampfung des Ethers blieb eine farblose Festsubstanz zurück, welche aus Wasser umkristallisiert sowie mittels semipräparativer HPLC weiter gereinigt und durch ¹H-NMR in CD3SOCD3 als 3-Hydroxybenzylbernsteinsäure identifiziert wurde (Ertrag: 1.5 g, 68 %;

Schmelzpunkt 140°C; Rf-Wert: 0.24). Die Elementaranalyse ergab C = 59.2 % und H = 5.0

%; laut der Formel C11H12O5 wären C = 58.9 % und H = 5.4 % erwartet worden. Die angegebenen R_f-Werte beziehen sich auf das unter 2.3.5. beschriebene DC-System.

2.4.3 Cobalamin- und Titan(III) Lösungen

Cob(I)alamin und Cob(II)alamin wurden durch elektrochemische Reduktion von Aquocob(III)alamin erhalten (Kreft und Schink 1994). Die Reduktion erfolgte in einer dreiteiligen elektrochemischen Zelle über eine Goldfolie (Fläche 2 cm², Dicke 0,1 mm, Reinheit 99,998 %) als Arbeitselektrode und Silber/Silber-Chlorid in 3 M KCl als Referenz und Gegenelektrode mit einem Laborpotentiostaten (Wenking Modell LB 81 M, Bank Elektronik, Göttingen, Deutschland). Das Potential zur Reduktion von Aquo(III)cobalamin (8 mM) zu Cob(I)alamin wurde auf -810 mV eingestellt (EO´ = -610 mV; Dryhurst et al. 1982).

Cob(II)alamin (EO´ = 202 mV; Dryhurst et al. 1982) wurde erhalten, indem zuerst Aquo(III)cobalamin (2 mM) zu Cob(I)alamin reduziert wurde, und dieses dann bei einer Spannung von -205 mV oxidiert wurde. Alle Potentiale beziehen sich auf die Normal- Wasserstoff Elektrode.

Ti(III) Citrat Lösungen und Ti(III)NTA Lösungen wurden nach Zehnder und Wuhrmann (1976) respektive Moench und Zeikus (1983) in der Anaeroben-Kammer hergestellt. Die Lösungen enthielten jeweils 100 mM Ti³⁺, welches durch 150 mM Citrat oder 150 mM Tris(carboxy)methylamin (NTA) komplexiert wurde.

2.4.4 Sonstige Chemikalien und Gase

Handelsübliche Chemikalien in p.a.- und Chromatographie-Qualität wurden von den Firmen Aldrich (Steinheim), Biomol (Ilvesheim), Boehringer (Mannheim), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Riedel-de Haen (Seelze), Serva (Heidelberg) und Sigma (Desienhofen) bezogen.

N2O wurde von der Firma Linde (Unterschleißheim) bezogen. Alle anderen Gase und Gasgemische stammten von Messer Griesheim (Ludwigshafen) und entsprachen der Reinheitskategorie 5.0.

2.5 Berechnungen

Die Bestimmung der Gibbsschen Freien Reaktionsenthalpie unter Nicht-Standard- Bedingungen (∆G´) des Benzoatabbaus nach C6H5COO^– + 4H2O → CH3COO^– + CH₃(CH₂)₂COO^– + H₂ + CO₂+ H⁺ wurde über die Quantifizierung der Reaktionspartner zum Ende des Versuchs ermittelt:

∆G´ = ∆G°´+ RT ln [CH COO ] [CH (CH ) COO ] [H ] [HCO ] [C H COO ]

3 3 2 2 2 3

6 5

− − −

−

Dabei ist R die Gaskonstante, T ist die Temperatur, [H2] ist der Partialdruck in Atmosphären und die anderen Formeln in Klammern stellen die molaren Konzentrationen der entsprechenden chemischen Verbindungen dar. Die Gibbssche Freie Reaktionsenthalpie unter Standardbedingungen (∆G°´) des Benzoatabbaus nach obiger Reaktionsgleichung ist + 25.8 kJ mol^-1 (nach Thauer et al. 1977, Kaiser and Hanselmann 1982). Die pH Werte veränderten sich nicht signifikant in Verlauf des Experiments (< 0.1 Einheiten) und wurden deshalb als konstant angenommen.

3. ERGEBNISSE

3.1 Der anaerobe Abbau von Kresolen und Toluol

3.1.1 Wachstum von Desulfobacterium cetonicum 480 auf m-Kresol

D. cetonicum oxidierte m-Kresol vollständig zu CO₂ mit Sulfat als terminalem Elektronenakzeptor mit einer Verdopplungszeit von 2.8 d. Die Bildung von Sulfid ging mit Substratverbrauch sowie einem Anstieg der optischen Dichte einher. Die gemessene Sulfidkonzentration entsprach dabei 98 % des theoretischen Wertes. Der Anstieg der optischen Dichte erfolgte nicht aufgrund einer Trübung durch FeS, da das Medium mit der Spurenelementlösung SL 9 versetzt wurde, was nur zu einer sehr geringen Bildung von FeS führt. Die Zunahme der Bakterienzahl konnte auch quantitativ durch mikroskopische Beobachtungen verfolgt werden. Nach Übertragung der Kultur (max. 10 %) in frisches Medium wurde eine lag-Phase von bis zu einer Woche beobachtet. D. cetonicum konnte m- Kresol in Konzentrationen bis zu 2 mM im Medium tolerieren. Die in vivo Umsatzrate wurde zu 8 nmol min^-1 (mg Protein)^-1 bestimmt.

Neben m-Kresol konnte D. cetonicum auch 3-Hydroxybenzoat (Kapitel 3.2.2) und 3- Hydroxybenzaldehyd, nicht aber 3-Hydroxybenzylalkohol (Konzentration im Medium 100 µM) verwerten.

3.1.2 Identifizierung von 3-Hydroxybenzylsuccinat in wachsender Kultur

Während des Wachstums auf m-Kresol akkumulierte in der Kulturflüssigkeit eine Verbindung, welche während des Wachstums auf anderen aromatischen Verbindungen wie 3- Hydroxybenzoat nicht beobachtet wurde. Die Analyse der Kulturüberstände erfolgte jeweils mittels reversed-phase HPLC. Die Retentionszeit der unbekannten Verbindung war deutlich kürzer als die von m-Kresol, was ein Hinweis auf einen polareren Charakter dieser Verbindung ist. Dieser Befund deutete auf einen m-Kresol-Abbau analog dem anaeroben Toluol-Abbau hin. In Vorversuchen mit permeabilisierten Zellen zeigte sich eine Abnahme