Bestimmung von Enzymaktivitäten

Enzymaktivitäten wurden spektralphotometrisch entweder in kontinuierlichen Tests oder diskontinuierlich nach Trennung von Substrat(en) und Produkt(en) mittels HPLC gemessen.

Alle Aktivitäten wurden, soweit nicht anders spezifiziert, bei Raumtemperatur gemessen und

beruhen auf Messungen mit mindestens drei unabhängig voneinander hergestellten zellfreien Extrakten bzw. Extraktfraktionen. Die Ansätze enthielten, wenn nicht anders angegeben, zwischen 10 und 200 µg Protein ml^-1. Durch Kontrollen mit hitzedenaturiertem Extrakt (90°C, 20 min) wurde sichergestellt, daß die gemessenen Umsätze Protein-katalysiert waren. Soweit erforderlich wurden die einzelnen Tests unter anoxischen Bedingungen durchgeführt. In diesen Fällen erfolgte die Zugabe anoxischer Substratlösungen und die Entnahme von Proben für die HPLC-Analyse mit gasdichten Unimetrics Spritzen (Macherey&Nagel, Düren, Deutschland). Diskontinuierliche Tests wurden in 5-ml Hungate Röhrchen durchgeführt, die mit Butylgummistopfen verschlossen waren.

Enzyme des Abbaus von m-Kresol, p-Kresol und Toluol

3-Hydroxybenzylsuccinat-Synthase und Benzylsuccinat-Synthase (EC 4.1.99.) Aktivitäten wurden in reduziertem Kaliumphosphatpuffer (KPP) (50 mM, pH 7,0-7,2, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1, 2,5 mM DTE) bei 30°C bestimmt. Das Vorhandensein einer 4-Hydroxybenzylsuccinat-Synthase wurde mit dem gleichen Testsystem geprüft. Der Proteingehalt lag zwischen 1 und 3 mg Protein ml^-1. Auf strikten Ausschluß von molekularem Sauerstoff während der Durchführung des Assays mußte geachtet werden; Spritzen wurden vor Substratzugabe und Probenentnahme mit Ti³⁺-Citrat (50 mM) gespült und Substrat-Stammlösungen enthielten 2,5 mM DTE und 0,5 mM Ti³⁺-Citrat als Reduktionsmittel. Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und in eiskalte 100 mM Phosphorsäure überführt. Substrat- und Produktkonzentrationen wurden mittels HPLC-Analyse quantifiziert.

Die Sauerstoffempfindlichkeit der 3-Hydroxybenzylsuccinat Synthase wurde mit oxischem, zellfreiem Extrakt geprüft. Ein leichter Luftstrom wurde hierzu für 10 min über den Extrakt geführt. Der Test wurde durch Zugabe von m-Kresol gestartet. Nach 30 min wurde die Gasphase 5 min lang gegen N₂ ausgetauscht und nach weiteren 30 min erfolgte die Zugabe von Ti(III)NTA (Endkonzentration Ti³⁺: 5 mM) zur Reduktion des Ansatzes. In einem Kontrollansatz wurde der Extrakt mit N₂ anstatt mit Luft beblasen.

Eine mögliche Oxidation der Methyl-Gruppe des m-Kresols wurde in anoxischem KPP (50 mM, pH 7,0, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1) in einem diskontinuierlichen Testsystem überprüft. Als potentielle Elektronenakzeptoren wurden NAD(P), FAD, Phenazinemethosulfat, 2,6-Dichlorophenol-indophenol (DCPIP) und Methylenblau eingesetzt.

Der Proteingehalt lag zwischen 1 und 3 mg Protein ml^-1. Die Substratkonzentration im Verlauf der Zeit wurde über HPLC-Analyse bestimmt.

Die Anwesenheit der p-Kresol Methylhydroxylase (EC 1.17.99.1) wurde nach Hopper et al.

(1991) in anoxischem KPP (50 mM, pH 7,0, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1) geprüft.

Die Oxidation von 3-Hydroxybenzylsuccinat wurde diskontinuierlich in reduziertem KPP (50 mM, pH 7,0-7,2, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl₂ x 6 H₂O l^-1, 2,5 mM DTE) gemessen. Das Testsystem zur Bestimmung der 3-Hydroxybenzylsuccinat Synthase wurde durch Zugabe einer CoA-Quelle und/oder Elektronenakzeptoren zu verschiedenen Zeitpunkten während des Tests erweitert. Als CoA-Quelle wurden Succinyl-CoA, Acetyl-CoA (je 2 mM) sowie freies CoA (1 mM) plus ATP (5 mM) eingesetzt. Eine Mischung aus NAD, NADP und FAD (je 1 mM Endkonzentration) stellte die Elektronenakzeptoren bereit. Zusätzlich zur direkten Analyse der Proben wurden Aliquots der Ansätze nach einer alkalischen Behandlung [KOH (pH12), 80°C, 20 min] analysiert.

Enzyme des reduktiven 3-Hydroxybenzoat-Abbaus

3-Hydroxybenzoyl-CoA Ligase (EC 6.2.1.) wurde diskontinuierlich nach Schnell und Schink (1991) oder kontinuierlich in einem gekoppelten photometrischen Test (Geissler et al. 1988) gemessen.

3-Hydroxybenzoat CoA-Transferase wurde diskontinuierlich mittels HPLC-Analyse oder in einem kontinuierlichen photometrischen Test verändert nach Buckel (1986) bestimmt. Der diskontinuierliche Ansatz enthielt Acetyl-CoA oder Butyryl-CoA (0,5-1,0 mM) als CoA-Donor und 3-Hydroxybenzoat (0,5-1,0 mM) als CoA-Akzeptor in entgastem KPP (50 mM, pH 7,0). Der photometrische Ansatz enthielt 100 mM Na-Acetat, 1,0 mM 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoat) und 0,1 mM 3-Hydroxybenzoyl-CoA in KPP (50 mM, pH 7,0). CoASH wurde durch die endogene Phosphotransacetylase freigesetzt und die Absorption bei 412 nm (ε = 14 mM^-1 cm^-1) verfolgt. In Fällen geringer Phosphotransacetylase-Aktivität, z.B. bei Fraktionierungsexperimenten, wurden den Ansätzen 1,0 mM Oxalacetat und 20 µg Citrat Synthase zugesetzt.

Der Nachweis einer 3-Hydroxybenzoyl-CoA-Reduktase (dehydroxylierend) wurde in der Anaeroben-Kammer durchgeführt. Hierzu wurden die Reaktionsgefäße auf 30°C mittels eines Thermomixers temperiert. Der Reaktionsansatz enthielt 0,1-1,0 mM chemisch synthetisiertes 3-Hydroxybenzoyl-CoA und 800 µM Cob(I)alamin in TRIS/HCl-Puffer oder KPP (beide 50 mM, pH 7,2) mit Proteingehalten bis zu 4 mg ml^-1. Der Puffer war mit H2 mittels eines Pd/Aktivkohle-Katalysators [0.005% (w/v)] reduziert worden. Die Reaktion wurde diskontinuierlich über HPLC-Analyse verfolgt. Neben Cob(I)alamin wurden die folgenden

Elektronendonatoren getestet: NAD(P)H, FADH2, FMNH2, Methylviologen, Benzylviologen, Dithionit und DTE. Die Viologene und Flavine wurden durch Ti(III) Citrat oder Dithionit vorreduziert. Neben 3-Hydroxybenzoyl-CoA wurden auch 3-Hydroxybenzoat plus Acetyl-CoA oder Butyryl-Acetyl-CoA (je 5 mM) eingesetzt. Die Sauerstoffempfindlichkeit wurde wie bei der 3-Hydroxybenzylsuccinat-Synthase beschrieben geprüft.

Eine 3-Hydroxybenzoyl-CoA-Reduktase (dearomatisierend) in D. cetonicum wurde diskontinuierlich mittels HPLC-Analyse in reduziertem KPP (50 mM, pH 7,2, 10 g NaCl l^-1, 1,75 g MgCl2 x 6 H2O l^-1, 2,5 mM DTE) gemessen. Zuzüglich zur direkten Analyse der Proben wurden Aliquots der Ansätze nach einer alkalischen Behandlung [KOH (pH12), 80°C, 20 min] analysiert. Als Elektronendonatoren wurden NADH, Methylviologen, Benzylviologen und Ti(III) Citrat in Konzentrationen zwischen 0,5 und 2 mM eingesetzt. Die Viologene wurden entweder durch Ti(III) Citrat oder durch die im zellfreien Extrakt vorhandene Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.99.) reduziert. Im letzteren Fall wurde der Ansatz mit Na-Formiat (10 mM) versetzt. Die spezifische Aktivität der Na-Formiat-Dehydrogenase in D.

cetonicum mit Methylviologen als Elektronenakzeptor liegt bei 3.2 µmol min^-1 (mg Protein)^-1 (Janssen und Schink 1995a). 3-Hydroxybenzoyl-CoA wurde über die CoA-Ligase-Reaktion bereit gestellt. Hierfür enthielt der Ansatz HSCoA (0.5-1.0 mM) und ATP (5 mM) sowie in einigen Fällen Phosphoenolpyruvat (10 mM) und Pyruvatkinase (10 U). Die Reaktion wurde entweder durch Zugabe von 3-Hydroxybenzoat (1,0 mM) oder Ti(III) Citrat bzw. Formiat gestartet.

Enzyme des oxidativen 3-Hydroxybenzoat-Abbaus

Die Oxidation von 3-Hydroxybenzoat und von 2,5-Dihydroxybenzoat (jeweils 0,1-1,0 mM) wurde in anoxischem KPP (50 mM, pH 7,2) verfolgt. Als Elektronendonatoren wurden DCPIP, K3Fe(CN)6 oder NO3

eingesetzt. Die Konzentration der Elektronenakzeptoren betrug zwischen 1 und 5 mM.

Hydroxyhydrochinon-Dehydrogenase wurde nach Philipp und Schink (1998) bestimmt. Der Testansatz enthielt 1,0 mM Hydroxyhydrochinon und 2,0 mM KNO3 in anoxischem Tris/HCl Puffer (50 mM, pH 7,8).

Enzyme des Benzoyl-CoA Wegs

Benzoat CoA-Transferase und Benzoyl-CoA Ligase (EC 6.2.1.25) wurden analog den entsprechenden 3-Hydroxybenzoat-aktivierenden Enzymen gemessen.

Die Anwesenheit der Benzoyl-CoA-Reduktase (EC 1.3.99.15) wurde diskontinuierlich in 5-ml Hungate Röhrchen oder in der Anaeroben Kammer geprüft. Abweichend von dem in Koch und Fuchs (1993) beschriebenen Testsystem mit ¹⁴C-markiertem Benzoyl-CoA wurde ¹² C-Benzoyl-CoA in KPP oder Tris/HCl Puffer (beide 50 mM, pH 6,0-8,0, vorreduziert durch H₂/Pd-Katalysator) eingesetzt. Die Benzoyl-CoA Konzentration betrug 0,1-1,0 mM. Als Elektronenakzeptoren wurden NAD(P)H, FADH₂, FMNH₂, Methylviologen, Benzylviologen, Dithionit und DTE eingesetzt. Die Viologene und Flavine wurden durch Ti(III) Citrat oder Dithionit vorreduziert. In einigen Fällen wurden MgATP (5 mM), Phosphoenolpyruvat (10 mM) und Pyruvatkinase (10 U) oder Acetyl-CoA den Ansätzen zugegeben. Der Proteingehalt lag zwischen 1 und 5 mg Protein ml^-1. Proben (100 µl) wurden gezogen, mit 5 M KOH (5 µl) versetzt und erhitzt (80°C, 20 min). Sodann wurden die Proben mit 5M H₃PO₄ (5 µl) neutralisiert, zentrifugiert (15,800 × g, 10 min) und bei 233 nm Wellenlänge mit der HPLC analysiert.

Glutaryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.7) wurde nach Stams et al. (1984) bestimmt. Der Ansatz enthielt 0,5 mM Glutaryl-CoA, 1,0 mM K3Fe(CN)6 (ε420 nm = 0,9 mM^-1 cm^-1) und 0,1 mM Phenanzinmethosulfat in KPP (50 mM, pH 7,2).

Glutaconyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1.1.70) wurde in einem Testsystem modifiziert nach Buckel (1986) gemessen. Der Ansatz enthielt 1 mM K2-Glutaconat, 0,2 mM Acetylphosphat, 1 mM NAD, 0,2 mM CoASH und Hilfsenzyme aus Acidaminococcus fermentans in KPP (50 mM, pH 7,2, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM DTE). Die Reaktion wurde bei 334 nm Wellenlänge verfolgt.

Acetat CoA-Transferase (EC 2.8.3.8) wurde mit dem gleichen photometrischen Test wie 3-Hydroxybenzoate CoA-Transferase gemessen. 3-Hydroxybenzoyl-CoA wurde durch Butyryl-CoA ersetzt.

Butyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.2), Phosphotransacetylase (EC 2.3.1.8) und Acetate-Kinase (EC 2.7.2.1) wurden nach Bergmeyer (1983) bestimmt.

Sonstige Enzyme

Hydrogenase (EC 1.18.99.1) wurde nach Diekert und Thauer (1978) bestimmt. Fumarat-Reduktase (EC 1.3.1.6) wurde wie in Beh et al. (1993) beschrieben geprüft und Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37) wurde vereinfacht nach Stams et al. (1984) gemessen. Der Testansatz enthielt 0,3 mM Oxalacetat und 0,25 mM NADH in KPP (50 mM, pH 7,0).