2.3.1 Spektralphotometrie
Zur Bestimmung der optischen Dichte (O.D.) von Bakterienkulturen, zur Messung von Enzymaktivitäten in kontinuierlichen Testverfahren und für colorimetrische analytische Methoden wurde ein Einstrahl-Spektralphotometer (Modell 100-40; Hitachi, Tokyo, Japan oder Spectronic 70; Bausch-Lomb) verwendet. Die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit bei Enzymtests wurde mit einem SE-120 Metrawatt-Schreiber (ABB-Goerz, Wien, Österreich) aufgezeichnet. Aus der Steigung des Graphen und dem Lambert-Beer´schen Gesetz konnte die Volumenaktivität des Enzyms im Testansatz berechnet werden. Die Messungen erfolgten je nach Meßwellenlänge in Halbmikroküvetten aus Quarzglas oder optischem Spezialglas mit jeweils 1 cm Schichtdicke. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden in einem Uvikon 930 Zweistrahl-Photometer (Kontron, Zürich, Schweiz) aufgenommen.
2.3.2 Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)
Die Konzentration an Natriumionen in Ansätzen zur Bestimmung der Glutaconyl-CoA Decarboxylase wurde mit einem Atomabsorptionsspektrometer (3030B, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) bei 589 nm Detektionswellenlänge in einer Acetylenflamme bestimmt.
Die Na+-Konzentration wurde durch Verdünnung mit 2 mM CsCl2-Lösung auf 5 - 200 µM in den Proben eingestellt.
2.3.3 Gaschromatographie (GC)
Die Quantifizierung von molekularem Wasserstoff erfolgte nach Trennung des Inhalts der Gasprobe auf einer gepackten Molekularsiebsäule [1m Länge, 2mm Durchmesser, Molekularsieb 5 Å, 60/80 (Serva, Heidelberg, Deutschland)] und N2 als Trägergas (30 ml/min) bei Raumtemperatur mit dem Spurengasdetektor RGD-2 (Wolters, Düsseldorf, Deutschland). Das Detektionsprinzip beruht auf einer Bildung von Quecksilberdampf aus erwärmten Quecksilberoxid durch reduzierende Gase. Die Bildung des Quecksilberdampfes wird bei 254 nm photometrisch verfolgt. Die Aufzeichnung und Auswertung der Chromatogramme erfolgte mit einem D-2000 Integrator (Merck-Hitachi, Darmstadt,
Deutschland). Die Wasserstoffkonzentration in Proben wurde durch Vergleich der korrespondierenden Peakflächen mit externen Standards bekannter Konzentration bestimmt.
2.3.4 Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektroskopie (GC/MS) Probenvorbereitung
3-Hydroxybenzylsuccinat wurde in m-Kresol-gewachsenen D. cetonicum Kulturen über GC/MS nachgewiesen. Aus ausgewachsenen Kulturen (60 ml) wurden die Zellen durch Zentrifugation (8000 x g, 30 min, 4°C) entfernt und der Überstand durch Zugabe von konzentrierter HCl (35 %) auf pH < 2 angesäuert sowie dreimal mit Diethylether extrahiert.
Die Etherfraktion wurde bei Raumtemperatur auf ein kleines Restvolumen eingedampft und mit etherischem Diazomethan derivatisiert (Schwetlick 1970). Überschüssiges Diazomethan wurde durch Zugabe etherischer Essigsäure entfernt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur eingedampft und der Rückstand in Heptan gelöst. 3-Methoxybenzylsuccinatdimethylester als Referenz wurde gleichfalls durch Derivatisierung von chemisch synthetisiertem 3-Hydroxybenzylsuccinat (Kapitel 2.4.2.) mit Diazomethan hergestellt.
GC/MS Analyse
Das GC/MS Gerät bestand aus einem Gaschromatographen Modell HP 6890 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Deutschland) mit einer DB-5 MS fused-silica Säule (30 m Länge, 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 µm Filmdicke; J&W Scientific, Köln) und einem HP 5973 Mass Selective Detector (Packard). Die erhaltenen Daten wurden mittels der Hewlett-Packard Software G1034C analysiert. Ein Temperaturprogramm beginnend mit 50°C (gehalten für 1 min) und ansteigend bis 280°C (10°C min-1; gehalten für 2 min) wurde zur Trennung der injizierten Verbindungen ausgeführt. Die Temperatur des Injektions-Ports betrug 250°C und der Gasfluß war 3 ml/min. Injektionen waren splitless, wobei der split nach 0,5 min eingesetzt wurde. Spektren wurden zwischen 50 und 350 Masseneinheiten (Da) mit einer Rate von 2 Hz aufgenommen.
2.3.5 Dünnschichtchromatographie (DC)
Der Verlauf der 3-Hydroxybenzylbernsteinsäure-Synthese wurde dünnschichtchromato-graphisch auf Kieselgel 60 F254-Aluminiumplatten mit 0,2 mm Schichtdicke (Merck,
Darmstadt, Deutschland) verfolgt. Das Laufmittel bestand aus Toluol, Essigsäureethylester und Essigsäure im Verhältnis 4:1:0,05.
2.3.6 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Die verwendete HPLC-Anlage System Gold® (Beckman Coulter) bestand aus zwei Hochdruck-Pumpen, Modell 116 bzw. 126 und einem UV/VIS-Detektor Modell 166 bzw. 168 oder einem Refraktionsindexdetektor (Modell ERC-7512, Erma, Tokyo, Japan). Die Proben wurden entweder über ein manuelles Injektionsventil (Beckman 210A Valve) oder über einen automatischen Probengeber (Beckman Autosampler Modell 502 oder Abimed-Gilson Modell 234, Langenfeld, Deutschland) aufgegeben. Die Auswertung der Chromatogramme und UV/VIS-Absorptionsspektren erfolgte durch die Software des System Gold®,) Version 3.1.
Eluierende Verbindungen wurden durch Vergleich mit internen und externen Standards identifiziert und quantifiziert. Aromatische CoA-Ester wurden zusätzlich durch Analyse der Säure nach alkalischer Hydrolyse [KOH (pH 12), 80°C, 20 min] bestimmt.
Mononukleare aromatische Verbindungen
Alle phenolischen und alle carboxylierten einkernigen aromatischen Verbindungen wurden isokratisch über eine reversed-phase Säule (GROM-SIL 120, ODS-5 ST, 5 µm, 150 x 5 mm, GROM, Herrenberg, Deutschland) getrennt. Der Anteil der organischen Phase (in der Regel MeOH) variierte je nach Hydrophobizität der zu trennenden Substanzen zwischen 16 % und 60 %. Als wässrige Phase wurden Ammoniumphosphatpuffer (100 mM, pH 2,6) oder KPP (10 mM, pH 2,2) eingesetzt. Detektiert wurde jeweils bei einem UV-Absorptionsmaximum der jeweiligen Verbindung, welches zuvor durch Aufnahme eines Absorptionsspektrums ermittelt oder der Literatur entnommen wurde.
Coenzym A und Coenzym A-Ester
Die Trennung von CoA und CoA-Estern erfolgte ebenfalls über eine reversed-phase Säule.
Die organische Phase war entweder MeOH oder Acetonitril und für die wässrige Phase wurden Ammoniumphosphatpuffer (100 mM, pH 2,6) oder 0.01 % Trifluoressigsäure (pH 2,2) verwendet. Letztere wurde insbesondere zur Reinigung von CoA-Estern mittels HPLC benutzt. Für CoA-Ester mit aromatischen Säureresten oder mit cyclischen aliphatischen Resten wurde in der Regel ein Gradientenprogramm beginnend mit 10 % organischer Phase
und innerhalb 7 min auf 70 % organischer Phase ansteigend ausgeführt. Nach weiteren 4 min wurde die Säule mit 10 % organischer Phase äquilibriert. Für CoA-Ester mit Fettsäureresten wurde ein Gradient beginnend mit 5 % organischer Phase und innerhalb 30 min auf 25 % ansteigend verwendet.
Corrinoide
Zur Corrinoid-Bestimmung in S. hydroxybenzoicum wurde zellfreier Extrakt (144-172 mg Protein) zweimal in jeweils 10 ml Methanol mit 1 % KCN (w/v) bei 80°C für 30 min inkubiert (modifiziert nach Kengen et al. 1988). Die Methanolfraktionen wurden vereint und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in 250 µl Methanol aufgenommen und zentrifugiert (15 800 x g, 5 min). Der Überstand hieraus wurde auf ca. 80 µl durch Verdampfung eingeengt und in die HPLC (reversed-phase Säule) injiziert. Die Elution der aufgetragenen Substanzen erfolgte über einen KPP (10 mM, pH 2,2) / Acetonitril Gradienten (10% Acetonitril auf 60 % Acetonitril in 25 min). Die UV/VIS Absorptionsspektren der eluierenden Verbindungen wurden mit einem Beckman 168 Photodiodendetektor im Bereich von 200 - 600 nm aufgenommen. Als Standard wurde CN-Cobalamin verwendet.
Fettsäuren und Dicarbonsäuren
Die Trennung von flüchtigen Fettsäuren sowie von Succinat, Fumarat und Malat erfolgte über eine Aminex® HPX-87H Säule (300 x 7.8 mm; BioRad, Hercules, CA, USA) mit 5 mM H2SO4 als mobiler Phase und einer Flußrate von 0.6 ml/min bei 40°C. Für die Detektion der eluierenden Verbindungen wurde ein Refraktionsdetektor eingesetzt. Die Datenübertragung und Umwandlung vom Detektor zur Software des System Gold® wurde über ein Analog-Digital-Interface AI 402 (Beckman Coulter) vermittelt.
2.3.7 Colorimetrische Bestimmungen Bestimmung des Proteingehalts
Der Proteingehalt in Proben wurde nach Bradford (1976) mit Rinderserum-Albumin als Standard bestimmt.
Bestimmung von Sulfid nach Cline
Sulfid bildet in saurer Lösung in Gegenwart von Fe3+-Ionen als Oxidationsmittel mit dem Reagens 4-Amino-N,N-Dimethylamin den Farbstoff Methylenblau. In Proben wurde die
Konzentration des gebildeten Farbstoffs durch Messung der Absorption bei 670 nm bestimmt (Cline 1969).