Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Medizinischen Hochschule Hannover
Neue genetische Dispositionen für das Endometriumkarzinom
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Madeleine Corssen aus
Hannover
2019
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 16.09.2019 Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. Peter Hillemanns 1. Referentin: Prof.´in Dr. med. Ruthild Weber
2. Referent: Prof. Dr. med. Micheal Brenner Tag der mündlichen Prüfung: 16.09.2019
Prüfungsausschuss:
Vorsitz: Prof. Dr. med. Alexander Kapp 1. Prüfer: PD Dr. med. Tomas Smith 2. Prüfer: PD Dr. med. Ingmar Mederacke
III
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 8
1.1 Grundlagen des Endometriumkarzinoms ... 8
1.1.1 Anatomische Grundlagen ... 8
1.1.2 Tumorgenese ... 8
1.2 Das Endometriumkarzinom aus klinischer Betrachtung ... 10
1.2.1 Epidemiologie ... 10
1.2.2 Diagnostik ... 11
1.2.3 Stadieneinteilung ... 12
1.2.4 Therapie ... 13
1.3 Beeinflussende Faktoren bei der Entstehung des Endometriumskarzinoms ... 16
1.3.1 Überblick ... 16
1.3.2 Genetische Faktoren und Faktoren des Lebensstils ... 16
1.3.3 Medikamentöse und toxische Faktoren ... 18
1.4 Chronische Inflammation und Endometriumkarzinom ... 20
1.4.1 MSR1 ... 21
1.4.2 MMP9 ... 22
1.4.3 CXCL3 ... 23
1.5 Das CHEK2-Gen und seine Funktion ... 23
1.5.1 CHEK2*1100delC ... 25
2 Material ... 26
2.1 Chemikalien ... 26
2.1.1 Allgemeine Chemikalien ... 26
2.1.2 Zusammensetzung spezieller Standardlösungen und Puffer ... 28
2.2 Biotechnische Geräte ... 29
2.3 Kleingeräte und Laborbedarf ... 31
2.4 Software ... 32
3 Methoden ... 33
3.1 Extraktion von genomischer DNA aus Vollblut ... 33
3.2 PCR-Technik zur Amplifizierung von genomischer DNA ... 35
3.2.1 Funktionsprinzip der PCR-Technik ... 35
3.2.2 Anwendung des PCR-Verfahrens ... 36
3.2.3 Besonderheiten von CHEK2 (Exon 10-14): LongRange PCR und Nested PCR ... 39
3.3 Agarose-Gelelektrophorese ... 41
3.3.1 Funktionsprinzip der Agarose-Gelelektrophorese ... 41
3.3.2 Anwendung der Agarose-Gelelektrophorese ... 41
3.4 Sequenzierung ... 43
3.4.1 Funktionsprinzip der Sequenzierung ... 43
3.4.2 Anwendung der Sequenzierung ... 43
3.5 Real-Time-PCR und Taqman®-Assays ... 48
3.5.1 Funktionsprinzip der Real-Time-PCR und Taqman®-Sonden .. 48
3.5.2 Anwendung des Real-Time-PCR-Verfahrens ... 50
3.6 MLPA® ... 53
3.6.1 Funktionsprinzip des MLPA®-Verfahrens ... 53
3.6.2 Anwendung des MLPA®-Verfahrens ... 53
4 Ergebnisse ... 57
4.1 MSR1, MMP9 und CXCL3 beim Endometriumkarzinom... 57
4.1.1 Verfahren ... 57
4.1.2 Auswertung der MSR1, MMP9 und CXCL3 Polymorphismen . 57 4.1.3 Haploview-Analyse ... 68
4.2 CHEK2-Analyse ... 69
4.2.1. c.1100delC ... 69
4.2.2 CHEK2 Sequenzierung ... 71
4.2.3 MLPA®-Analyse ... 72
Diskussion ... 82
5.1 Bedeutung der Polymorphismen in Genen der Inflammationskaskade ... 82
5.1.1 Überblick... 82
5.1.2 MSR1 ... 82
5.1.3 MMP9 ... 84
5.1.4 CXCL-3 ... 86
5.1.5 Populationsabhängige Aspekte ... 88
5.2 Bedeutung der Varianten in CHEK2... 89
5.2.1 Leserasterdeletion c.1100delC ... 89
5.2.2 p.I157T ... 91
5.2.3 Weitere genetische Variationen des CHEK2-Gens ... 93
5.2.4 MLPA Ergebnisse ... 94
5.2.5 CHEK2 in der gezielten Krebstherapie ... 95
5.3 Gesamtausblick ... 96
6. Zusammenfassung ... 98
7. Literaturverzeichnis... 101
8. Anhang ... 110
8.1 Abbildungsverzeichnis ... 110
8.2 Tabellenverzeichnis ... 111
9. Lebenslauf ... 113
10. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 7 und 8 ... 115
11. Danksagung ... 116
V
Abkürzungsverzeichnis
14-3-3σ Zellzyklus regulierendes Protein
ADP Adenosindiphosphat
ATM Ataxia telangiectasia-mutated gene bidest. Zweifach destilliert
BMI Body-Mass-Index
BRCA-1 Breast cancer type 1 susceptibility gene BRCA-2 Breast cancer type 2 susceptibility gene
bzw. beziehungsweise
CA Karzinom
ca. circa
CCND1 Cyclin D1 Gen
CCNE1 Cyclin E1 Gen
CDC25C Cell division cycle 25
Cdk2/Cyclin B1 Komplex aus Cyclin-abhängiger Kinase und Cyclin B1, auch Mitose- promoting factor
CHK2 Checkpoint kinase 2
CHK2-DN Dominant-negative Formen der CHEK-2-Kinase CIN Chromosomale Instabilität
CTNNB1 Catenin (Cadherin-Associated Protein) Beta 1 Gene CXCL3 C-X-C motif chemokine ligand 3
dH2O Destilliertes Wasser DHEA Dehydroepiandrosteron DNA Desoxytibonukleinsäure
ddNTPs 2´,3´-Desoxynucleosid-5´-triphosphate dNTPs 2´-Desoxynucleosid-5´-triphosphate E-cadherin Epithelial cadherin
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure E2F1 E2F transcription factor 1
EIC Endometriale intraepitheliale Karzinom
ERBB1 human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu) gene
FAM 6-Carboxy-Fluorescein
FGFR Fibroblast growth factor receptor FHA Gabelkopf-assoziierte-Domäne
FIGO Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique FRET Fluoreszenz-Resonanz Energie-Transfer
g Gramm
G Differenzierungsgrad
G1-Phase Erste Wachstumsphase des Zellzyklus G2-Phase Zweite Wachstumsphase des Zellzyklus GCPs Cerebellar granule neuron precursor cells
h Stunde
HCC Hepatozelluläres Karzinom
HCl Hydrochloric acid
HiDi Highly deionized
HNPCC Hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome HPLC High-performance liquid chromatography
HR Homologe Rekombination
IGFBP1 insulin-like growth factor binding protein 1
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
KHCO3 Kaliumhydrogencarbonat K-RAS Kirsten rat sarcoma LD linkage disequilibrium LDLs low density lipoproteins
LFS Li-Fraumeni Syndrom
LH Luteinisierendes Hormon
LW Leerwert
M Mol/Liter
MDM2 murine double minute 2 oncogene
min Minuten
ml Milliliter
MLH1 MutL homolog 1 gene
MLPA Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification
mM Millimolar
MMP9 Matrixmetallopeptidase 9
MSH2 MutS homolog 2 gene
MSH6 MutS homolog 6 gene
MSR1 macrophage scavenger receptor 1
µl Mikroliter
Na Natrium
NaCl Natriumchlorid
NFκB Nukleärer Faktor kappa-B NH4Cl Ammoniumchlorid
NHEJ Non-homologe Rekombination mit End-joining
P. Patientinnen
p21/cip1 cyclin-dependent kinase inhibitor 1A
PARP Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren PCB Polychlorierte Bephylene
PCO Polyzystische Ovarien PCR Polymerasekettenreaktion
PDGF-D platelet-derived growth factor-D
PEG Polyethylenglykol
pH Potentia hydrogenii
PIK3CA Phosphatdylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha
VII
PML promyelozytisches Leukämie-Protein
PMS2 PMS-1 homolog 2, mismatch repair system component RNS Reaktive Nitratspezies
ROS Reaktive Sauerstoffspezies
ROX X-Rhodamin
rpm Umdrehungen pro Minute
SERMs selektive estrogen response difiers SDS sodium dodecyl sulfate
sec Sekunden
SHBP Sexualhormon bindendes Peptid SNP Single Nucleotide Polymorphism
SQ/TQ Serin-Glutamin/Threonin-Glutamin- Gruppen-Domäne STE Sodium Chloride-TRIS-EDTA-Puffer
TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer
TE TRIS-EDTA-Puffer
TIMPs tissue inhibitors of matrix-metalloproteasen TP53 tumor protein 53 gene
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UV Ultraviolett
V Volt
VEGFR1 Vaskulärer Endothel-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1
Wnt Zusammensetzung aus den Buchstaben Wg (Wingless) und Int-Gen
z.B. Zum Beispiel
1 Einleitung
1.1 Grundlagen des Endometriumkarzinoms
1.1.1 Anatomische Grundlagen
Das Endometrium ist der Ort der Aufnahme und Ernährung der befruchteten Eizelle. Der Begriff leitet sich aus dem Lateinischen (endo = innen, metra = Gebärmutter) ab und wird im deutschen Sprachgebrauch als „Gebärmutterschleimhaut“ bezeichnet. Das Endomet- rium stellt die Innenschicht der Gebärmutter dar und besteht aus zwei Anteilen, der La- mina basalis und der Lamina functionalis. Die Lamina functionalis ist die der Höhle an- grenzende Schicht und setzt sich aus faserarmem Bindegewebe, Gefäßen sowie den kra- nialen Anteilen der Drüsen zusammen, verändert sich hormonabhängig in ihrem Aufbau und wird während der Menstruation abgestoßen. Die Regeneration erfolgt aus der Lamina basalis, einer Schicht aus faserreichem Bindegewebe, Gefäßen und den kaudalen Antei- len der Drüsen. Dem Endometrium angrenzend liegt das Myometrium (Tunica muscosa), eine dicke Muskelschicht, die für die Kontraktion des Uterus zuständig ist. Die äußerste Schicht des Uterus stellt das Perimetrium (Tunica serosa), eine Vorwölbung des parieta- len Bauchfells, dar (1).
1.1.2 Tumorgenese
Vermehren sich Zellen der einzelnen Schichten der Gebärmutter über die normale Rege- neration hinaus entstehen Tumoren. Das Endometriummyom stellt eine unkontrollierte Vermehrung der glatten Muskelzellen dar, die Endometriumhyperplasie zeichnet sich durch eine flächige, der Endometriumpolyp durch eine vorstülpende Proliferation der en- dometrialen Drüsen aus. Diese benignen Tumoren wachsen langsam und verdrängend, nicht aber destruieren sie benachbartes Gewebe. Kommen zu den proliferativen Umbau- prozessen Atypien in Zellen und Nuklei hinzu, wird dies als komplexe atypische Hyper- plasie bezeichnet, welche zu den Präkanzerosen gehört. Die zellulären und nukleären Veränderungen unterscheiden sich nicht vom Endometriumkarzinom, einzig das invasive Wachstum ist nachweisend für ein Karzinom (2,3). Dabei werden zwei histologische
Einleitung 9
Typen unterschieden: Das östrogenabhängige Typ-1-Karzinom und das östrogenunab- hängige Typ-2-Karzinom (4).
Typ-1-Karzinome
Zu den Typ-1-Karzinomen zählen das endometroide Endometriumkarzinom, das muzi- nöse Adenokarzinom und das reine Plattenepithelkarzinom (5). Gemeinsam besitzt die Gruppe der Typ-1-Karzinome einen Anteil von 70-80% aller Endometriumkarzinome.
Sie sind östrogenassoziiert und damit sensibel für viele bekannte Risikofaktoren, dadurch aber auch besser behandelbar (4). In der Regel gehen sie aus einer atypischen komplexen Hyperplasie des Endometriums hervor, welche unter anderem durch hohe Spiegel an en- dogenem oder exogenem Östrogen ohne ausreichende Kompensation durch Gestagene verursacht wird. In etwa dreißig Prozent kommt es zur malignen Entartung dieser Vor- stufen (4). Zunächst sind Typ-1-Karzinome gut differenziert. Kommen jedoch weitere Mutationen hinzu, entsteht ein entdifferenziertes Karzinom, das seine Progesteronrezep- toren verloren hat, sich somit der hemmenden Wirkung von Progesteron entzogen hat, und hormonunabhängig ist (5).
Viele der bekannten Risikofaktoren wirken letztendlich über einen erhöhten Östrogen- spiegel. Dieser verstärkt die mitotische Aktivität des Endometriums und fördert so die Häufung von DNA-Replikationsfehlern, welche zu somatischen Mutationen und somit zu einem malignen Zellbild führen kann (6). Außerdem kann es unter dem Einfluss von Östrogen zu Mutationen in Tumorsuppressor- und Onkogenen kommen. Bei Frauen in der Prämenopause wird Östrogen in den Ovarien und peripheren Gewebe gebildet. Nach der Menopause, wenn die Eierstöcke an Funktion verlieren, übernimmt vor allem das Fettgewebe die Östrogenproduktion (7). Zusätzlich ist auch karzinomatös verändertes En- dometrium in der Lage, Östrogen zu produzieren, was die Entartung noch vorantreibt.
Das Typ-1-Karzinom ist neben dem Östrogenüberschuss auch mit dem Lynch-Syndrom (Synonym: hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome (HNPCC)) und Mutati- onen in den Genen PTEN, PIK3CA, K-RAS, CTNNB1 und FGFR assoziiert (8,9).
Typ-2-Karzinom
Das Typ-2-Karzinom kann vielfältige histologische Varianten annehmen, dazu gehören das seröse Karzinom, das klarzellige Karzinom, das adenosquamöse Karzinom, das mu- zinöse Karzinom und weite seltene Tumorentitäten (4). Typ-2-Karzinome machen 20%
aller Endometriumkarzinome aus (8) und als ihre Vorstufe gilt das endometriale in- traepitheliale Karzinom (EIC) (4). Dieses ist im Gegensatz zur Vorstufe des Typ-1-
Karzinoms, der komplexen atypischen Hyperplasie, für gewöhnlich sonografisch nicht detektierbar. Gemischte Tumoren aus Typ-1- und Typ-2-Karzinom sind ebenfalls be- kannt. Bis zu 40% der Typ-2-Karzinome enthalten Typ-1-Anteile, prognosebestimmend ist allerdings der Anteil des Typ-2-Karzinoms (5). In der Regel treten Typ-2-Tumore bei deutlich älteren und schlanken Frauen auf. Sie zeigen keinerlei Östrogen- oder Progeste- ronsensitivität und wachsen sehr viel aggressiver. Meist entwickeln sie sich aus einem atrophischen Endometrium (10). Alter und eine vorangegangene Bestrahlung des Uterus (z.B. nach Zervix-, Blasen- oder Rektumkarzinom) sind die einzigen bekannten Risiko- faktoren des Typ-2-Karzinoms (5). Genetisch sind Typ-2-Karzinome mit der Inaktivie- rung von p53, p16 und E-cadherin und der Amplifikation von den Genen ERBB2, CCND1 und CCNE1 assoziiert (8,9).
1.2. Das Endometriumkarzinom aus klinischer Betrachtung
1.2.1 Epidemiologie
Bösartige Tumoren der Gebärmutter sind die häufigste Krebserkrankung der weiblichen Genitalorgane (11). Unterschieden wird dabei zwischen Erkrankungen des Gebärmutter- körpers (lateinisch „Corpus“) und des Gebärmutterhalses (lateinisch „Cervix“). Das Cor- puskarzinom hat seinen Ursprung fast immer im Endometrium. In Deutschland erkranken jährlich ca. 11.300 Frauen am Endometriumkarzinom (11). Damit steht das Endometri- umkarzinom an vierter Stelle der häufigsten Malignome der Frau, hinter Brust-, Darm- und Lungenkrebs (12). Die Prognose ist erstaunlich gut: Die Fünfjahresüberlebensrate liegt zwischen 75 und 83% (13). Dem zugrunde liegen oftmals frühzeitige Symptome und dadurch eine relativ frühe Krebserkennung. Trotzdem sterben jährlich in Deutschland etwa 2.400 Frauen an diesem Krankheitsbild (11), wodurch das Endometriumkarzinom mit einem Anteil von 2,6% an zehnter Stelle der häufigsten Krebstodesursachen der Frau steht (10). Das Lebensrisiko, an einem Endometriumkarzinom zu erkranken liegt bei 2,1% (4).
Das Krankheitsbild Endometriumkarzinom betrifft vor allem ältere Frauen, die Mehrzahl der Patientinnen erkrankt nach den Wechseljahren. Zum Vergleich erkranken unter 100.000 Frauen über 60 Jahre im Durschnitt 80, dagegen nur sechs von 100.000 Frauen, die jünger als 40 Jahre sind (14). Das mittlere Erkrankungsalter liegt laut dem Robert- Koch-Institut bei 69 Jahren (11). In der Behandlung kommen vor allem operative
Einleitung 11
Maßnahmen, sowie adjuvante Therapien, aber auch konservative, fertilitätserhaltene The- rapien zum Einsatz. Bei Patientinnen, die aufgrund ausgeprägter Komorbiditäten inope- rabel sind, besteht die Indikation zur primären Strahlentherapie (10). Eine generelle Vor- sorgeuntersuchung für das Endometriumkarzinom gibt es nicht. Allerdings sollte bei ver- dächtigen Symptomen immer eine sofortige histologische Abklärung erfolgen.
1.2.2 Diagnostik
Kardinalsymptom des Endometriumkarzinoms ist die postmenopausale Blutung (4). In der frühen Postmenopause ist bei vaginaler Blutung in ca. 5% der Fälle, in der späten Postmenopause in etwa 50% mit einem Karzinom zu rechnen. In der Prä- bzw. Peri- menopause sind zusätzliche oder verlängerte und verstärkte Blutungen (Meno-Metorrha- gie) Hinweise auf ein mögliches Endometriumkarzinom (1). Symptome fortgeschrittener Stadien können Uterusvergrößerung, wässriger oder eitriger uteriner Fluor oder unklare Unterbauchbeschwerden sein (3). Jedes 5. Endometriumkarzinom ist symptomfrei und wird durch Zufall entdeckt (1). Zur weiteren Abklärung suspekter Symptome gehört eine vaginale Untersuchung, um die Herkunft der Blutung, sowie die eventuelle makroskopi- sche Ausdehnung des Karzinoms festzustellen sowie eine digitale Tastuntersuchung, wodurch eine mögliche Ausdehnung in die Parametrien ertastet werden kann. Des Wei- teren beinhaltet die Standard-Diagnostik eine transvaginale Ultraschalluntersuchung.
Hierbei kann die Höhe und Beschaffenheit der Gebärmutterschleimhaut begutachtet wer- den, sowie mögliche Infiltration in die Muskelschicht oder benachbarte Organe sichtbar gemacht werden. Um eine genaue Aussage über Zellbeschaffenheit und eine eventuelle Entartung machen zu können, wird zudem eine histologische Probe durch eine fraktio- nierte Kürettage entnommen und diese im Labor ausgewertet. Die Kürettage kann gege- benenfalls mit einer Hysteroskopie kombiniert werden, um eine Ausdehnung in die Zer- vix und die Lokalisation des Tumors weiter zu begutachten (4). Bestätigt sich die Diag- nose eines Endometriumkarzioms, so wird ein prätherapeutisches Staging angeordnet, um mögliche Fernmetastasen zu entdecken und somit den Zustand und die erforderliche The- rapie besser eingrenzen zu können. Hierzu gehören eine Röntgenaufnahme des Thorax, sowie eine Ultraschalluntersuchung des Abdomens. Bei gegebenem Verdacht muss zu- sätzlich eine Zysto- und Rektoskopie vorgenommen werden (13).
1.2.3 Stadieneinteilung
Klinisch wird das Endometriumkarzinom nach FIGO je nach Eindringtiefe und Ausbrei- tung in vier Stadien mit Untergruppen eingeordnet. Das erste Stadium beschreibt ein auf den Corpus uteri begrenzten Tumor, wobei im Stadium 1a der Tumor weniger als 50%
der Myometriumtiefe, in Stadium 1b bereits mindestens 50% infiltriert. Im zweiten Sta- dium breitet sich der Tumor bis in die Cervix uteri aus, im Stadium 3a erreicht er die Serosa und/oder die Adnexe und im Stadium 3b besteht ein Befall der Vagina und/oder der Parametrien. In Stadium 3c ist eine Ausbreitung in regionäre, pelvine oder paraaortale Lymphknoten zu finden. Infiltriert der Tumor bereits Blase oder Rektum, so wird dies als Stadium 4a bezeichnet. Stadium 4b bedeutet, dass eine Fernmetastasierung erfolgt ist.
Die Stadieneinteilung dient vor allem der Orientierung für das operative Vorgehen und wird postoperativ präzisiert (15).
Tabelle 1 : Stadieneinteilung des Endometriumkarzinoms nach FIGO (5)
TNM FIGO Definition
T1 I Tumor begrenzt auf das Corpus uteri
T1a I A Tumor auf das Endometrium begrenzt oder weniger als 50% des Myometri- ums infiltriert
T1b I B Tumor infiltriert ≥ 50% des Myometriums T2 II Tumor befällt das Stroma der Cervix uteri T3a III A Tumor infiltriert Serosa und/oder Adnexe
T3b III B Vaginalbefall und/oder Infiltration der Parametrien N1 III C
III C1 III C2
Regionale Lymphknotenmetastasen Pelvine Lymphknotenmetastasen
Paraaortale Lymphknotenmetastasen mit/ohne pelvine LK-Metastasen T4 IV A Tumor infiltriert Blasen- und /oder Rektumschleimhaut
M1 IV B Fernmetastasen
Einleitung 13
1.2.4 Therapie
Je nach Tumorstadium, Konstitution und Wünschen der Patientin gilt es eine möglichst optimale Therapie zu finden. Bei den meisten Patientinnen ist die operative Hysterekto- mie mit bilateraler Adnexektomie die entscheidende Basistherapie (1). Bei High-Risk- Typen besteht zusätzlich die Indikation zur pelvinen und paraaortalen Lymphonodekto- mie. Ist der Tumor inoperabel oder lässt der Zustand der Patientin eine Operation nicht zu, wird zu einer primären Strahlentherapie geraten. Bei speziellen Fällen mit Infiltration der Blasen- und Rektumwand kommt eine Exenteration in Frage. Frauen mit Kinder- wunsch sind eine besondere Gruppe. Hier müssen fertilitätserhaltene Maßnahmen disku- tiert werden (4).
Hyperplasie ohne Atypien
Prämenopausalen Frauen mit einer einfachen endometrialen Hyperplasie in Kombination mit einer Neigung zu einem oligo- bzw. anovulatorischen Zyklusprofil (z.B. PCO-Syn- drom) wird eine zyklische Gestagenbehandlung bzw. die Gabe von Ovulationshemmern empfohlen (13). Deutet das Ergebnis der Kürettage auf eine komplexe endometriale Hy- perplasie hin, gilt es die Gestagentherapie zu intensivieren (3). Zusätzlich sollte nach der Ursache der Hyperplasie, z.B. einen östrogenproduzierenden Ovarialtumor, geforscht werde. Um den Erfolg der Therapie zu beurteilen, sollte nach drei bis sechs Monaten eine hysteroskopische Kontrolle mit Kürettage erfolgen (4).
Hyperplasie mit Atypien
Weist das histologische Präparat eine endometriale Hyperplasie mit Zellatypien auf, so ist die generelle Empfehlung sowohl prä- als auch postmenopausal zur operativen Hyste- rektomie mit Adnexexstirpation gegeben, da das Risiko für eine Entwicklung eines inva- siven Karzinoms bei 30% liegt (13). In 20-40% der Hyperplasien mit Atypien wird bereits zum Zeitpunkt der histologischen Aufarbeitungen der Hysterektomiepräparate ein inva- sives Karzinom nachgewiesen (4). Bei Patientinnen mit Kinderwusch oder einem zu ho- hen Operationsrisiko ist ein konservatives Vorgehen prinzipiell möglich, dies setzt jedoch eine gute Compliance der Patientin und eine sorgsame Überwachung durch den betreu- enden Gynäkologen voraus. Eine Gestagentherapie bei einer Hyperplasie mit Atypien sollte in vergleichsweise höherer Dosierung erfolgen (13).
Invasives Karzinom
Invasive Endometriumkarzinome können in Low-Risk- und High-Risk-Karzinome unter- teilt werden. Zu den Low-Risk-Karzinomen werden das endometrioide Adenokarzinom in den Stadien G1 bis G2 und einer maximalen myometrialen Eindringtiefe von 50%, sowie die Tumorbeschränkung auf den Corpus uteri, gezählt. Standardtherapie ist die operative Hysterektomie mit bilateraler Adnexektomie. Außerdem sollte zur prognosti- schen Einschätzung eine Peritonealzytologie entnommen werden. Patientinnen mit Low- Risk-Tumoren sollten, wenn möglich, laparoskopisch operiert werden. Diese Operations- technik weist zwar ein gleichwertiges Maß an intraoperativen Komplikationen gegenüber der Laparotomie auf, postoperativ zeigen sich jedoch deutlich weniger Komplikationen und ein kürzerer Krankheitsverlauf (4)
Zur der Gruppe der High-Risk-Karzinome gehören Typ-II-Karzinome und Adenokarzi- nome Grad 3. Ihre Therapie erweitert sich neben Hysterektomie mit Adnexektomie und Peritonealzytologie um eine systemische pelvine und paraaortale Lymphonodektomie.
Ziel dieser Maßnahme ist die Tumormasse zu verkleinern, indem eventuell befallene Lymphknoten entfernt werden (4). Zusätzlich sollte eine infragastrische Omentektomie sowie die Entnahme mehrere peritonealen Biopsien in Analogie zur Staging-Operation eines Ovarialkarzinoms erfolgen, um ein maximales Tumordebulking zu erreichen (4).
Ist im Abradat ein Befall des zervikalen Stromas zu erkennen, wird eine zusätzliche Ent- fernung der Parametrien im Sinnen einer radikalen Hysterektomie nach Wertheim- Meigs/Okabayashi angeraten (13). Auch High-Risk-Karzinome können laparoskopisch operiert werden, allerdings stellt sich der Schritt der Lymphonodektomie nicht selten schwierig dar und deshalb wird oftmals auf die konventionelle Laparotomie zurückge- griffen (4).
Strahlentherapie
Eine Strahlentherapie kann primär oder adjuvant eingesetzt werden. Eine primäre Strah- lentherapie ist bei Inoperabilität oder ausgeprägter Komorbidität der Patientin indiziert (4). Sie besteht aus einer kombinierten Tele-/Brachytherapie. Aufgrund der Toxizität ei- ner externen Teletherapie gibt es bei kleinen Tumoren, schwerwiegenden Erkrankungen oder sehr alten Patientinnen die Möglichkeit der alleinigen vaginalen Brachytherapie (10,13). Die adjuvante Strahlentherapie dient nach der Operation der Rezidivkontrolle.
Sie ist bei Karzinomen der High-Risk-Gruppe indiziert und kann bei tumorfreien Lymph- knoten in Form einer Brachytherapie erfolgen. Befinden sich Tumoranteile in den
Einleitung 15
entfernten Lymphknoten so muss die Bestrahlung perkutan erfolgen und es sollte über eine Kombination mit einer Chemotherapie nachgedacht werden (4).
Systemische Therapien
Bei Patientinnen mit hohem Rezidivrisiko ist eine systemische adjuvante Chemotherapie sinnvoll, da die Prognose wesentlich von den Metastasen bestimmt ist. So profitieren vor allem Patientinnen mit der Diagnose eines High-Risk-Karzinoms von dieser Therapie.
Wie eine Studie nachwies, ist die Kombination aus Radiotherapie mit Chemotherapie der alleinigen Radiotherapie in Bezug auf rezidivfreies Überleben überlegen (4,5,16). In der palliativen Situation werden Systemtherapien verwendet, wenn andere Therapieoptionen ausgeschöpft oder nicht möglich sind, der Wunsch nach weiteren Therapien jedoch be- steht (4). Zusätzlich kann die Effektivität palliativer Maßnahmen mit Hilfe der durch die Systemtherapie erzielte Zytoreduktion von großen Tumormassen erhöht werden (13).
Liegen positive Progesteronrezeptoren vor und sind die bestehenden Metastasen asymp- tomatisch, so ist auch eine hormonelle Systemtherapie mit hochdosierten Gestagenen möglich (10).
Fertilitätserhaltene Verfahren
Circa 5% der Patientinnen sind bei Diagnosestellung jünger als 40 Jahre (17). Besteht bei einer Patientin ein dringender Kinderwunsch, ist eine fertilitätserhaltene konservative Therapie grundsätzlich bei gut differenzierten Adenokarzinomen ohne myometriale In- filtration oder extrauteriner Karzinommanifestation möglich. Die Patientin muss jedoch über die hohe Rezidivwahrscheinlichkeit sowie die Möglichkeit einer Progression und die daher notwendige und engmaschige Nachsorge aufgeklärt werden (10).
Therapeutisch wird das Cavum uteri durch eine hysteroskopisch kontrollierte Kürettage vollständig entleert und eine kontinuierliche orale Gabe von Gestagenen für mindestens drei Monate angestrebt. In dreimonatigem Abstand muss eine Kontrolle mittels Transva- ginalultraschall, Hysteroskopie und Endometriumbiopsie erfolgen. Sind die Befunde un- auffällig, kann eine Schwangerschaft der Patientin angestrebt werden. Eine Studie zeigte, dass von 133 Frauen 76% auf eine konservative fertilitätserhaltene Therapie ansprachen (18). Nach erfülltem Kinderwunsch oder bei Progress der Krebserkrankung sollte eine operative Therapie erfolgen (4).
Nachsorge
Um eventuelle Lokalrezidive frühzeitig zu entdecken und kurativ behandeln zu können, ist eine sorgfältige Nachsorge von hoher Bedeutung. Daher wird in den ersten drei Jahren nach Primärtherapie zu Kontrollen im Abstand von drei bis sechs Monaten geraten. An- schließend erfolgt die Nachsorge jährlich. Die auf den Uterus begrenzten Stadien (FIGO I und II) haben eine durchschnittliche Wahrscheinlichkeit von 15% ein Lokalrezidiv zu entwickeln (4). Etwa 70% aller Rezidive zeigen eine Symptomatik und werden deshalb von den Patientinnen bemerkt (10). Außerdem sollte berücksichtigt werden, dass Patien- tinnen mit Endometriumkarzinom in 6-10% der Fälle Zweitmalignome, z.B. ein Mammakarzinom, entwickeln (10).
1.3 Beeinflussende Faktoren bei der Entstehung des Endometriumskarzinoms
1.3.1 Überblick
Das Endometriumkarzinom steht in Deutschland mit einer Erkrankungsrate von etwa 11.300 Frauen pro Jahr an vierter Stelle der häufigsten Malignome der Frau (11). Damit zeigt sich eine ähnliche Verteilung wie in anderen westlichen Industriestaaten. Die Häu- figkeit ist hier Schätzung zufolge zehnfach höher als in ländlichen Regionen Afrikas oder Asiens. In den westlichen Ländern begünstigen die mit Wohlstand assoziierten Faktoren wie Adipositas, das metabolische Syndrom, Diabetes, geringe körperliche Aktivität, die Abnahme von Schwangerschaften und die Einnahme von Östrogenpräparaten oder Tamoxifen nach Mammakarzinom das Auftreten des hormonassoziierten Typ-1-Tumors.
Daher trägt das Endometriumkarzinom die Bezeichnung als „Wohlstands-“ oder „Life- style-Erkrankung“ und die Prävention der genannten Faktoren stellt einen der wichtigsten Ansätze seiner Eindämmung dar (19).
1.3.2 Genetische Faktoren und Faktoren des Lebensstils Metabolisches Syndrom und Adipositas
Das metabolische Syndrom ist eine Kombination aus Adipositas, arterieller Hypertonie, Hypertriglyzeridämie und Insulinresistenz und wird neben dem Rauchen als Hauptverur- sacher der arteriellen Verschlusskrankheit, insbesondere der koronaren Herzerkrankung,
Einleitung 17
angesehen. Das Krankheitsbild ist vor allem in Industriestaaten sehr verbreitet und ent- wickelt sich aus einem Lebensstil, der von permanenter Überernährung und Bewegungs- armut gekennzeichnet ist (20). Die einzelnen Komponenten dieses Krankheitsbildes sind zusätzlich Risikofaktoren für eine Vielzahl anderer Erkrankungen, wie auch für das En- dometriumkarzinom. In verschiedenen Studien wurde eine drei- bis zehnfache Risikoer- höhung für das Korpuskarzinom durch Adipositas geäußert (21). Durch körperliche Ak- tivität kann das Erkrankungsrisiko gesenkt werden. Auch unabhängig vom Body-Mass- Index (BMI) ist körperliche Bewegung ein protektiver Faktor. Besteht zu dem Überge- wicht noch ein Bluthochdruck, so erhöht sich das Risiko um den Faktor drei (22). Ebenso wirkt sich eine Insulinresistenz negativ auf die Risikobilanz aus. Sie ist eine Vorstufe des Typ-2-Diabetes und entsteht oft bei adipösen Frauen durch ein Überangebot an freien Fettsäuren im Serum. Dies führt zu einer abnehmenden Glukoseaufnahme in die Leber und Muskelzellen und erhöhten Insulinwerten, die sich wiederum über die Erniedrigung des IGFBP1 (Insulin-like growth factor binding protein 1) und die Downregulation des SHBP (Sexualhormon bindendes Peptid) sowie durch direkte Stimulierung der ovariellen Androgenproduktion mitogen auswirken können. Bei einem manifesten Diabetes ist das Risiko für ein Endometriumkarzinom je nach BMI um den Faktor 1,43 bis 1,63 erhöht (19).
Lange Östrogenexposition
Eine lange Östrogenexposition durch Nullparität, eine frühe Menarche (< 12 Jahre) oder eine späte Menopause gilt als anerkannter Risikofaktor für das Endometriumkarzinom (insbesondere für Typ-1-Karzinome). Der protektive Effekt von Schwangerschaften oder später Menarche bzw. früher Menopause liegt in der Verkürzung oder Unterbrechung der Stimulation des Endometriums durch Östrogene. Studien konnten ein doppelt bis fünf- fach erhöhtes Risiko für Endometriumkarzinome bei kinderlosen Frauen feststellen (21).
Für eine frühe Menarche misst das relative Risiko 1,6-2,4, eine späte Menopause steigert das Risiko um den Faktor 2,4 (10).
PCO-Syndrom
Das Syndrom der polyzystischen Ovarien ist die häufigste endokrine Störung der prä- menopausalen Frau und betrifft etwa 4 bis 8% aller Frauen im fertilen Alter (23). Es stellt ein komplexes metabolisches Syndrom dar, das mit erhöhten Androgenspiegeln und einer Insulinresistenz einhergeht. Die erhöhten Androgenkonzentrationen führen einerseits zu einer exzessiven endometrialen Östrogenproduktion und andererseits zur Follikelatresie,
welche bei diesen Patientinnen zu niedrigen Progesteronspiegeln und dem Problem der Anovulation führt (19). Damit beginnt ein Teufelskreis, denn dieser hormonelle Regel- kreis setzt sich mit einer hypophysären LH-Hypersekretion durch Stimulation von Östro- gen und Insulin fort, welche wiederum in den Thekazellen des Ovars eine erhöhte And- rogensynthese bewirkt (21). Damit ist die Situation einer unopponierten Östrogenexposi- tion gegeben und das Risiko für Endometriumkarzinom, insbesondere für das Typ-I-Kar- zinom, etwa um den Faktor 5 erhöht (19).
Lynch-Syndrom
Das Lynch-Syndrom (Synonym; hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome (HNPCC)) ist eine autosomal-dominante Erbkrankheit, die mit dem frühzeitigen Auftre- ten von Kolonkarzinomen (mittleres Alter 45,2 Jahre) und anderen Tumorerkrankungen einhergeht. Erkrankte Frauen haben ein kumulatives Lebenszeitrisiko von 40-60% an ei- nem Endometriumkarzinom zu erkranken (12). Grund dieser Disposition gegenüber Tu- morerkrankungen ist eine Keimbahnmutation im DNA-Reparatur-System (5). Betroffen sind vor allem die DNA-Mismatch-Reparaturgene MLH1, MSH2, MSH6 und PMS2. Die meist von einem Elternteil vererbte Keimbahnmutation findet sich in allen Körperzellen.
Durch ein zufälliges Mutationsereignis wird auch das bisher intakte zweite Allel, welches für ein intaktes Reparatursystem ausreichte, geschädigt (Second hit-Hypothese nach Knudsons) (24). Durch den Funktionsverlust der DNA-Reparaturgene kommt es vor al- lem bei der Zellteilung zu Basenfehlpaarungen in der DNA. Dies äußert sich in einer Verlängerung oder Verkürzung repetitiver Sequenzen durch Veränderung der Basenzahl, welche auch als Mikrosatelliteninstabilität bezeichnet wird. Diese Mikrosatelliteninstabi- lität bewirkt eine beschleunigte Karzinogenese mit einer geringeren Adenom-Karzinom- Sequenz (1-2 Jahre statt 8-10) (25). Patientinnen mit dem Lynch-Syndrom bedürfen einer intensiven gynäkologischen Betreuung, welche ab dem 35. Lebensjahr eine jährliche transvaginale Ultraschalluntersuchung mit Endometriumbiopsie beinhaltet. Ab dem 40.
Lebensjahr oder nach abgeschlossener Familienplanung wird die prophylaktische Hyste- rektomie mit Adnexektomie empfohlen (5,12).
1.3.3 Medikamentöse und toxische Faktoren Östrogene
Ein historisches Beispiel für die Assoziation von Östrogenen und Endometriumkarzinom war die zunehmende Inzidenz Ende der 60er bis Anfang der 70er Jahre in den USA durch
Einleitung 19
hoch dosierte Östrogentherapie zur Behandlung von klimakterischen Beschwerden.
Heute ist die Risikoerhöhung für das Endometriumkarzinom durch eine perimenopausale Hormonersatztherapie mit konjugierten Östrogenen oder Östradiol ohne Gestageneinsatz bekannt und man weiß um den Einfluss von Dosis und Anwendungsdauer (21). Bereits bei dreijähriger Östrogentherapie ohne opponierende Gestagene besteht ein fünffach er- höhtes Risiko, bei über zehn Jahren Therapie kommt es zu einer zehnfach erhöhten Rate an Endometriumkarzinomen. Selbst nach Absetzen der Therapie persistiert das Risiko für mehrere Jahre (26). Durch die antiöstrogene Wirkung des Progesterons konnte durch Ver- wendung von Präparaten mit Gestagenanteil die Zahl der Erkrankungen wieder gesenkt werden (19).
SERMs (selektive estrogen response difiers)
Selektive Östrogenrezeptormodulatoren sind Arzneistoffe u.a. zur Behandlung des Mammakarzinoms und vermitteln ihre Wirkung über Östrogenrezeptoren (z.B. Tamoxi- fen). Trotz ihrer Selektivität üben sie eine proöstrogene Wirkung auf das Endometrium aus (21). Obwohl diese Substanzklasse bei der adjuvanten Therapie des hormonrezeptor- positiven Mammakarzinoms bereits durch Aromatasehemmer verdrängt wurde, wird der Wirkstoff Tamoxifen noch häufig eingesetzt, was die Wahrscheinlichkeit für ein Endo- metriumkarzinom durch eine postmenopausale Anwendung vervierfacht (19,21). Zusätz- lich wurden bei Langzeitgebrauch von Tamoxifen trotz östrogenunabhängiger Genese vermehrt Typ-2-Karzinome beschrieben, die mit einer ungünstigen Prognose einhergehen (27). Des Weiteren ist das Risiko unter Tamoxifentherapie für ein ebenfalls prognostisch ungünstiges Sarkom oder einen Müller-Mischtumor leicht erhöht (21).
Kontrazeptiva
Kombinierte einphasige Kontrazeptiva über die gesamte Zykluslänge haben aufgrund ih- rer dominanten Gestagenkomponente einen protektiven Wert für das Endometriumkarzi- nom von 0,5 (19,28). Nach kontinuierlicher Einnahme eines solchen Präparates über ein Jahr sinkt das Karzinomrisiko um etwa 40%. Dieser protektive Faktor hält nach Absetzen der Therapie für circa 15 Jahre an (29). Handelt es sich um ein sequenzielles Präparat ist auf die Dauer der Einnahme des Gestagenanteils zu achten. Bei einer Verabreichung von weniger als 10 Tagen des Zyklus ist das Risiko für ein Endometriumkarzinom leicht er- höht. Daher empfiehlt sich die Einnahme der Gestagenkomponente für mindestens 14 Tage des Zyklus (21).
Rauchen und Alkohol
Rauchen scheint einen protektiven Effekt auf die Endometriumkarzinogenese auszuüben (21). Laut einer Studie profitieren dabei vor allem Frauen, die mehr als 20 Zigaretten pro Tag rauchen und Kinder geboren haben. Der genaue biologische Mechanismus ist bislang unbekannt, eine Koinzidenz möglich (19). Der Konsum von Alkohol zeigt einen alters- abhängigen Einfluss auf die Entstehung von Endometriumkarzinomen (21). In einer gro- ßen schwedischen prospektiven Studie, bei der 37.000 Frauen mit der Diagnose Alkoho- lismus stationär behandelt wurden, fand sich in der Altersgruppe der unter 50jährigen ein um 70% erhöhtes Risiko, bei den Frauen über 50 Jahren hingegen schien Alkohol das Risiko um 40% gegenüber der Normalbevölkerung zu senken (19).
1.4 Chronische Inflammation und Endometriumkarzinom
Epidemiologie
Etwa jede fünfte Krebserkrankung wird durch chronische Entzündung hervorgerufen (30). Grund dieser chronischen Inflammation können Erbanlagen, aber auch exogene Faktoren, wie z.B. Viren, Parasiten, Bakterien oder exogene Schadstoffe sein (31). Bei- spiele für diesen Zusammenhang sind ein erhöhtes Darmkrebsrisiko durch entzündliche Darmerkrankungen wie etwa Colitis ulcerosa oder der Zusammenhang zwischen dem hepatozellulären Karzinom (HCC) und Hepatitis-B- bzw. C-Infektionen sowie die Ent- stehung von Magenkarzinomen durch die Besiedelung mit Helicobacter pylori (30). Sod- brennen erhöht das Risiko für ein Ösophaguskarzinom um das 50- bis 100-fache und das Lungenkrebsrisiko steigt durch eine Asbest-assoziierte Entzündung um mehr als das Zehnfache (30).
Definition: Chronische Entzündung
Chronische Inflammation beschreibt einen pathologischen Zustand, der durch ein konti- nuierlich aktives Entzündungsgeschehen gekennzeichnet ist und mit Infiltration von Im- munzellen (Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen) verbunden ist.
Diese Zellen geben eine Vielzahl von Entzündungsmediatoren ab. Im Gegensatz zu einer akuten Entzündung heilt das Gewebe nicht durch Reparatur oder Vernarbung aus, son- dern es kommt zur Zerstörung des betroffenen Gewebes. Die akute Entzündung ist im eigentlichen Sinne ein schützender Mechanismus, die zur Abwehr von endogenen und exogenen Antigenen dient. Die andauernde Entzündung hingegen übt ihre negativen
Einleitung 21
Effekte vor allem durch die Produktion von freien Radikalen und den Abbau von Antio- xidantien aus (32,33).
Freie Radikale
Freie Radikale sind Moleküle mit mindestens einem ungepaarten Elektron und daher sehr reaktionsfreudig. Wichtige Vertreter sind vor allem die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die reaktive Nitratspezies (RNS), wobei erstere in biologischen Systemen am häu- figsten vertreten ist. In einem funktionierenden Organismus schützt sich die Zelle vor den Angriffen durch freie Radikale mit Hilfe von Antioxidantien und Reparaturmechanismen (29). Die Zellmembran ist durch ihre mehrfach ungesättigten Fettsäuren besonders anfäl- lig für freie Radikale (31). Die dabei entstehenden Moleküle (Lipidperoxide) können zu- sammen mit den freien Radikalen die DNA im Zellkern angreifen (27) und zu Doppel- oder Einzelstrangbrüchen, Modifikationen von Basen und Intrastrang-Addukten führen (31-33). Außerdem kann es zur permanenten Beeinträchtigung von Elastizität und Fließ- fähigkeit innerhalb der Membran kommen, was bis zur Zellruptur führt. Auch Proteine werden von den Radikalen bei unzureichendem zellulären Schutz angegriffen, sodass die Funktion von Signalkaskaden, u.a. auch für die DNA-Reparatur, beeinträchtigt werden kann. Vorangegangene Untersuchungen führen zu der Vermutung, dass freie Radikale durch die Aktivierung von Proto-Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppres- sorgenen an der Karzinogenese beteiligt sind (34). Außerdem können freie Radikale die Tumorentstehung durch Zellwachstum und Angiogenese fördern (34). Die Rate an DNA- Schäden, die durch freie Radikale verursacht werden, ist erstaunlich hoch. Eine Studie fand heraus, dass es pro Tag über 10.000 solcher Angriffe gibt, die allerdings in einem balancierten System repariert werden (35).
1.4.1 MSR1
Das Gen MSR1 (macrophage scavenger receptor 1) liegt auf dem kurzen Arm von Chro- mosom 8 und kodiert oberflächliche Phagozytoserezeptoren der Klasse A. Von ihnen existieren drei verschiedene Typen, die durch unterschiedliches Splicen des Gens erzeugt werden. Diese Rezeptoren sind makrophagen-spezifische integrale Membran-Glykopro- teine. Typ 1 und 2 sind funktionale Rezeptoren und vermitteln die Endozytose von Lip- oproteinen niederer Dichte (LDLs). Sie sind an einer Vielzahl von Prozessen durch Mak- rophagen beteiligt, dazu gehören physiologische Prozesse, aber auch pathologische wie z.B. Atherosklerose, Alzheimer-Demenz und Probleme der Immunabwehr. Trotz, dass
die Isoform Typ 3 dieselbe extrazelluläre Domäne zur Endozytose vorweist, ist sie an diesem Vorgang nicht beteiligt, denn sie hat einen anderen intrazellulären Signalweg, wodurch das Endoplasmatische Retikulum an der Endozytose gehindert wird. Somit fun- giert Typ 3 also als Gegenspieler zu den ersten beiden Isoformen. Dieser negative Effekt ist dominant und so stellt die Isoform Typ 3 einen Mechanismus zur Regulation der Pha- gozytoseaktivität in Makrophagen dar (36). In einer neuen Studie wurden an Mäusen in dendritischen Zellen hochregulierte Expression von MSR1 und damit verstärkter Akku- mulation von Lipiden beobachtet. Interessanterweise betrug der MSR1-Spiegel in Mäusen mit Tumorerkrankungen das 20 bis 50-fache ihrer Kontrollgruppen ohne Krebserkran- kungen (37).
1.4.2 MMP9
Das Gen MMP9 liegt auf dem Chromosom 20 und kodiert eine 92kDa schwere Typ-IV- Kollagenase, die zur Familie der Matrix-Metalloproteasen gehört. Dies ist eine Gruppe von Proteinen, die dem Abbau von extrazellulärer Matrix dient (38). Ein Vorgang, der sich physiologisch in der embryonalen Entwicklung und der Reproduktion und Umwand- lung von Gewebe (u.a. Angiogenese, Knochenentwicklung, Wundheilung) findet. Aber auch bei Krankheitsprozessen wie Tumorentstehung, Arthritis oder kardiovaskulären Er- krankungen spielen die Matrix-Metalloproteasen eine Rolle. Die Enzyme befinden sich außerhalb der Zelle, in der extrazellulären Matrix, in die sie inaktiv sezerniert und durch Spaltung mittels extrazellulärer Proteinasen aktiviert werden. Im menschlichen Körper sind 23 Matrix-Metalloproteasen bekannt. Neben einer Peptidasedömäne, die meist ein Zink-Ion bindet, enthalten sie mehrere Hämopexin- oder Vitronectin-Domänen zur Ver- ankerung in der extrazellulären Matrix oder an der Zellmembran (39). MMP9 baut neben Kollagen-Typ-V und anderen extrazellulären Matrixproteinen vor allem Kollagen-Typ- VI ab, wodurch Basalmembranen und extrazelluläre Matrix geschwächt werden und die Tumorprogression durch Invasion, Metastasierung, Wachstum und Angiogenese ermög- licht wird (40). Studien an Mäusen lassen ein Mitwirken von MMP9 an einer tumorindu- zierten Gewebstransformation vermuten (38). Es wurden außerdem erhöhte Werte für ei- nen Komplex aus MMP9 und deren Inhibitoren in Verbindung mit gastrointestinalen und gynäkologischen (mit Ausnahme des Mammakarzinoms) Karzinomen gefunden (41).
Einleitung 23
1.4.3 CXCL3
Das Gen CXCL3 befindet sich auf dem Chromosom 4 und kodiert den Chemokin-Ligan- den 3, ein kleines Zytokin der CXC-Unterfamilie, auch bekannt als GRO3-Onkogen.
CXCL3 spielt eine wichtige Rolle bei der Entzündung, da es die Migration und Adhäsion von Monozyten kontrolliert, indem es sein Signal durch ein G-Protein gekoppelten Re- zeptor (CXC Rezeptor 2) vermittelt (42). Des Weiteren stellt es einen verborgenen Wachstumsfaktor dar (43). Eine Studie an Mäusen zeigte, dass durch vermindertes CXCL3 cerebelläre Körnerzellen (GCPs) an der Oberfläche des Kleinhirns verharren und nicht in die inneren Schichten eindringen können. Dort neigen sie zu Proliferation, was in einem erhöhten Risiko für ein Medulloblastom resultiert (44).
1.5 Das CHEK2-Gen und seine Funktion
Um die korrekte Weitergabe von genetischer Information zu sichern, haben Zellen kom- plexe Mechanismen zur Überwachung der genomischen Integrität entwickelt. Zellen re- agieren auf DNA-Schäden mit der Aktivierung vielschichtiger Reparaturwege, zu denen auch die Aktivierung von CHEK2 gehört (45). Es gilt als vermeintliches Tumorsuppres- sorgen und ist auf dem langen Arm des Chromosoms 22 lokalisiert. CHEK2 besteht aus 14 Exons, hat eine ungefähre Größe von 50 Kilobasen (kb) und kodiert die Zellzyklus- Checkpoint-Kinase-2 (CHK2), eine Serin/Threonin-Protein-Kinase, die bei DNA–Schä- den wie etwa Doppelstrangbrüchen durch z.B. ionisierende Strahlung, die Zellprolifera- tion stoppt und die DNA-Reparatur initiiert (46,47).
Die CHK2-Proteinstruktur zeigt drei charakteristische Domänen: eine N-terminale SQ/TQ-Gruppen-Domäne, eine Gabelkopf-assoziierte-Domäne (FHA) und eine Se- rin/Threonin-Kinase-Domäne. Die Serin-Glutamin/Threonin-Glutamin-Gruppen-Do- mäne (SQ/TQ) wirkt regulatorisch und besitzt Aktivierungsstellen für ATM (ataxia te- langiectasia-mutated protein kinase), durch die CHK2 bei DNA-Doppelstrangbrüchen angeregt wird (48). Dies geschieht vor allem durch Phosphorylierung von Threonin-68, wodurch es zur Homodimerisierung kommt und CHK2 seine volle Aktivität durch Trans- phosphorylierung von Theronin-383 und -387 im katalytischen Zentrum erlangt (49). Die FHA-Domäne ist für die Aktivierung weiterer Substanzen und damit für die Weiterlei- tung des Signals zuständig (47).
In aktiviertem Zustand phosphoryliert die CHK2-Kinase eine Vielzahl von Substraten, unter anderem die CDC25C-Phosphatase, welche wiederum den die Mitose einleitenden Komplex Cdk2/Cyclin B1 hemmt und somit einen Arrest in G2 bewirkt, wodurch der Eintritt in die Mitose verwehrt wird (45,50). Durch eine Unterbrechung des Zellzyklus wird der Zelle Zeit gegeben, die bestehenden DNA-Schäden zu reparieren und somit die Weitergabe mutierter Sequenzen zu verhindert (45). Weitere, in den Zellzyklus eingrei- fende Zielsequenzen, sind die Plk3-Kinase und der Transkriptionsfaktor E2F1 (47).
Außerdem aktiviert und stabilisiert CHK2 das Tumorprotein p53 durch Phosphorylierung von Serin-20, was zur Trennung von p53 und MDM2 führt und so die Stabilisierung und Akkumulation von p53 ermöglicht (49). Dies wiederum führt über die Aktivierung von p21/cip1 und 14-3-3σ zu einem Arrest des Zellzyklus in der G1- und G2-Phase (45). Als Antwort auf die DNA-Schädigung werden außerdem p53-abhängige Apoptosepfade ak- tiviert (51), sodass bei massiven DNA-Schäden, die nicht adäquat repariert werden kön- nen, der programmierte Zelltod eingeleitet wird (50). Durch Phosphorylierung des Tran- skriptionsfaktors E2F1 an Serin-364 und des tumorunterdrückendem promyelozytischen Leukämie-Proteins (PML) an Serin-117 werden außerdem p53-unabhängige Apopto- sepfade aktiviert. (49).
Auch eine Interaktion von CHK2 und BRCA1 wurde nachgewiesen. Dabei aktiviert CHK2 BRCA1 durch Phosporylierung von Serin-988 und ermöglich so die Dislokation vom nuklearen Foci, wodurch BRCA1 seine Wirkung an der DNA-Reparatur entfalten kann und für Regeneration nach DNA-Schäden sorgt (52). BRCA1 vermittelt die fehler- freie homologe Rekombination (HR) zur Reparatur von DNA-Schäden und unterdrückt die fehleranfällige Non-homologe Rekombination mit End-joining (NHEJ) (49).
Abbildung 1: Biochemische Funktion von CHK2, gezeichnet nach einer Vorlage von Zhou et al. (53)
Einleitung 25
Eine weitere Funktion von CHK2, unabhängig von DNA-Schäden, liegt in der Stabilisa- tion der Chromosomen während der Mitose. CHK2 ist an dem korrekten und zeitgerech- ten Aufbau des Spindelapparates beteiligt, welcher Voraussetzung für die regelrechte An- heftung der Chromosomen an eben diesen und die darauffolgende Teilung der Schwes- terchromosomen ist. Dies ist besonders interessant, da chromosomale Instabilität (CIN) ein wichtiges Charakteristikum humaner Karzinome ist und daher der Verlust von CHEK2 oder die Beeinträchtigung dessen Kinaseaktivität suffizient ist CIN in diploiden somatischen Zellen herbeizuführen (49).
1.5.1 CHEK2*1100delC
Die Mutattion CHEK2*1100delC bezeichnet den Verlust einer Cytosinbase im Exon 10 an der Stelle 1100. Diese Variation führt zur Synthese eines verkürzten Proteins, das seine Funktion in der Zellzyklus-Kontrolle verloren hat (46). Daraus resultiert eine verminderte DNA-Reparatur und die Unfähigkeit der Zelle trotz Erbgut-Schäden in den programmier- ten Zelltod überzugehen und endet in erhöhter Anfälligkeit für Krebserkrankungen. Etwa 4% der Brustkrebspatientinnen in Deutschland tragen diese Mutation. Aber auch bei 0,7%
der gesunden Bevölkerung findet sich diese Variante von CHEK2 (54). Die Wahrschein- lichkeit für diese Mutationsträger/innen an Brustkrebs zu erkranken ist zwei- bis dreimal so hoch, wie für Patientinnen ohne CHEK2*1100delC. Bei familiärer Belastung steigt es sogar auf das fünffache (46). Des Weiteren ist das Risiko für das Auftreten von bilateralen Mammakarzinomen bei 1100delC-Mutationsträgerinnen sechsmal höher (55). Das Ri- siko für gleichzeitige BRCA1- oder BRCA2-Mutationsträgerinnen ist nicht erhöht. Für den männlichen Brustkrebs steigt das Risiko um das 10fache (56)
1100delC wurde vermehrt in Familien, die an dem Li-Fraumeni Syndrom (LFS) erkrankt sind und anderen, die ein ähnliches Krebsmuster aufweisen, gefunden (55). Das LFS ist ein seltenes hoch penetrantes familiäres Krebssyndrom, dem in 75% der Fälle eine hete- rozygote Keimbahnmutation im Gen TP53 zugrunde liegt. Erkrankte Patienten haben ein 85%iges Risiko im Laufe ihres Lebens Krebs zu entwickeln (57). Die in diesem Zusam- menhang gefundenen CHEK2-Mutationen wurden vor allem bei Patienten gefunden, die keine TP53-Mutation besitzen (49). Neben 1100delC existieren weitere Mutationen (del5395, IVS2+1G>A), welche ebenfalls zu einem verkürzten Protein führen (58).
2 Material
2.1 Chemikalien
2.1.1 Allgemeine Chemikalien
1kb DNA-Ladder Sigma Chemie, Steinheim
3100-Avant Genetic Analyzer Buffer with EDTA
Applied Biosystems, Darmstadt
3100-Avant Genetic Analyzer POP-6™
(Polymer)
Applied Biosystems, Darmstadt
ABI PRISM™ Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit
Applied Biosystems, Darmstadt
Agarose Ultra Pure™ Invitrogen, Carlsbad, USA
Ammoniumchlorid Sigma Chemie, Steinheim
Borsäure Merck, Darmstadt
Bromphenolblau Roth, Karlsruhe
DNA Polymerase Mix (Expand Long Template PCR System)
Roche, Basel
Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) Biobudget, Krefeld
EDTA Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Ethanol Uvasol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid (GelRed) Invitrogen
Formamid ultrapure AppliChem, Darmstadt
GelRed 10.000x in DMSO, Biotium Biotrend, Köln
HPCL-Wasser J.T.Baker, Deventer, NL
Kaliumchlorid Roth, Karlsruhe
2 Material 27
Magnesiumchlorid 25mM Qiagen, Hilden
Magnesiumchloridhexahydrat Merck, Darmstadt Natriumacetat 3M
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Merck, Darmstadt Serva
Oligodesoxyribonukleotide (Primer für CHEK2) Eurogentec
Polyethylenglykol 8000 Sigma Chemie, Steinheim o USB??
Proteinase K Merck, Darmstadt
Puffer 2 (Expand Long Template PCR System) Roche, Basel
Q-Solution Qiagen, Hilden
SALSA®MLPA® reagents for DNA or RNA analysis
MRC Holland, Amsterdam, NL
TaqMan®SNPGenotypingAssayC_1414756_10 TaqMan®SNPGenotypingAssayC_1865279_10 TaqMan®SNPGenotypingAssayC_1015584_10 TaqMan®SNPGenotypingAssayC_11655953_10 TaqMan® -1100delC-Sonde
LifeTechnologies, Carlsbad, USA LifeTechnologies, Carlsbad, USA LifeTechnologies, Carlsbad, USA LifeTechnologies, Carlsbad, USA LifeTechnologies, Carlsbad, USA TopTaq™ DNA-Polymerase 5units/µl Qiagen, Hilden
TopTaq™ PCR Buffer (AB) Qiagen, Hilden
TRIS Merck, Darmstadt
Xylencyanol Merck, Darmstadt
2.1.2 Zusammensetzung spezieller Standardlösungen und Puffer
DNA-Extraktion
Lysepuffer 155mM NH4Cl
10mM KHCO3
0,1mM NA2-EDTA in Aqua bidest, pH 7,4
10 x STE-Puffer 0,5M Tris-HCl
1M NaCl 0,01M EDTA
in Agua bidest., pH 7,5
10 x TE-Puffer 0,1M Tris-HCl
0,01M Na2-EDTA in Aqua bidest., pH 8,0
Proteinase K-Lösung 10mg Proteinase K
10ml autoklaviertes HPLC-Wasser Proteinase K-Ansatz 190µl autoklaviertes Aqua bidest.
40µl 10Xste 20µl 10% SDS
150µl Proteinase K-Lösung
Agarose-Gelelektrophorese
Ladepuffer 0,25% Bromphenolblau
0,25% Xylencyanol 100% Formamid
10 x TBE (1:10 verdünnt) 108g TRIS-HCl (0,9M) 54g Borsäure (0,9M) 7,2g EDTA (0,02M)
in Aqua bidest., pH 8,3, autoklaviert
2 Material 29
2 % Agarosegel 2g Agarosepulver
ad 100ml 1 x TBE-Puffer
DNA-Fällungen
70 % Uvasol 35ml 100% Uvasol
15ml autoklaviertes HPLC-Wasser Polyethylenglykol (PEG-Lösung) 262g Polyethylenglykol 8000
1,2g Magnesiumchloridhexahydrat 4,2g Natriumacetat
ad 1L Aqua bidest., autoklaviert bis gewünschte Viskosität erreicht
Natriumacetat-Ethanol-Lösung 30ml 100% Uvasol
1ml autoklavierte 3M Natriumacetatlösung 95 % Formamidlösung 95ml Formamid ultrapur
5ml autoklaviertes HPLC-Wasser
2.2 Biotechnische Geräte
Abzug Mc 6 Waldner Laboreinrichtungen, Wangen
Autoklaviergeräte:
HAST 6-6-6 LVSA 50 / 70
Zirbus Technology, Bad Grund Zirbus Technology, Bad Grund
Eismaschine Ziegra Ziegra, Isernhagen
Feinwaage BS 1500 S Sartorius, Göttingen
Fotodokumentation:
Kamera Pieper FK7512IQ-IR UV-Tisch UXT-20M-8E
Biostep GmbH, Jahnsdorf Biostep GmbH, Jahnsdorf
Thermodrucker P91D Computer Belinea
Mitsubishi, Japan
Brunen IT Service GmbH, Wittmund Gefrier- und Kühlschränke:
Comfort Superfrost Premium Nofrost
Liebherr, Ochsenhausen Liebherr, Ochsenhausen Liebherr, Ochsenhausen Gelelektrophoresekammern:
Modell 40-1410
Horizon 58, Life Technologies Mit Spannungsgeber:
Biometra Standard Power Pack P25
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Gibco BRL, Eggenstein
Biometra, Göttingen Heizblock ThermoStat plus Eppendorf, Hamburg Magnetrührer IKA-Combimag Ret Janke und Kunkel, Staufen
Mikrowelle Panasonic, Kadoma, Japan
PCR-Maschinen:
96 HPL Gradient
GeneAmp® PCR System 2700
MJ Research PTC-200 Peltier Thermal- llCycler
7500 Fast Real-Time PCR System
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Applied Biosystems, Darmstadt
Biozym, Hessisch-Oldendorf
Applied Biosystems, Darmstadt Sequenziergerät:
ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analy- iiizer mit 36 cm Kapillare
Applied Biosystems, Darmstadt
Sterile Werkbank HeraSafe 332 Kendro Laboratory Products, Hanau Stromversorgungsgerät (für Elektrophorese)
Standard Power Pack 25 Biometra, Göttingen
Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg
2 Material 31
Vortexmachinen:
VWR 1719 MS2 Minishaker
VWR International, Radnor, USA IKA Works Inc, Wilmington, USA Zentrifugen:
Tischzentrifuge miniSpin Tischzentrifuge Perfect Spin P Centrifuge 5415D
Eppendorf, Hamburg
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Eppendorf, Hamburg
Zubehör:
Drucker Hewlett Packard Deskjet 6122 Computer DELL GX 270
Monitor 17in FLTAT 1703 FRGRAY
Hewlett Packard, Böblingen Dell, Frankfurt
Dell, Frankfurt
2.3 Kleingeräte und Laborbedarf
96-Well Multiply-Plate PCR Sarstedt, Nümbrecht
Autoklavierband Omnilab, Bremen
Einweg-Handschuhe:
Peha-soft, powderfree Purple Nitrile powder-free Sterling Nitrile powder-free
Hartmann, Heidenheim
Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Falcon-Tubes
15ml-Tube 50ml-Tube
Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht Klebefolie für 96-Well Platten Sarstedt, Nümbrecht
Kleenex Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien
Kühlblock Eppendorf, Hamburg
Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Washington,
USA
Pinzetten Jürgens, Hannover
Pipetten:
Reference-Modelle Research-Modelle Research Pro 0.5-10μl
Serologische Pipette bis 10 ml
Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg Sarstedt, Nümbrecht Pipettenspitzen
≤ 10µl (grau) ≤ 200µl (gelb) ≤ 1000µl (blau)
Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht Reaktionsgefäße
0,5ml 1,5ml
Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht
Skalpell Jürgens, Hannover
2.4 Software
Fotodokumentation:
Software Phoretix Grabber Biostep GmbH, Jahnsdorf Logistische Regression
STATA 12.0 StataCorp LP, Texas, USA
MLPA-Software MRC Holland, Amsterdam, NL
Online-Software Haploview 4.2 1000 Genomes
Broad Institute, Cambridge, USA EMBL-EBI, Camebridge, UK Sequenzierung
DataCollection Software Sequencing Applied Biosystems, Darmstadt
3 Methoden 33
Analysis 5.1.1 7500 Avant Software
Applied Biosystems, Darmstadt
TaqMan®-Software Applied Biosystems, Darmstadt
3 Methoden
3.1 Extraktion von genomischer DNA aus Vollblut
Die für die Experimente benötigte DNA wurde aus Leukozyten des jeweiligen Patienten- blutes gewonnen. Da Erythrozyten und Thrombozyten keinen Zellkern und somit keine verwertbare DNA besitzen eignen sie sich für DNA-Extraktion nicht. Die DNA der Leu- kozyten befindet sich im Zellkern, der, wie die Zelle selbst, von einer Lipiddoppelschicht umgeben ist. Das Ziel ist es beide Membranen zu zerstören, um die DNA isolieren zu können und sämtliche anderen Bestandteile zu entfernen, sodass letztendlich nur noch die reine DNA aus den Leukozyten zurückbleibt.
Der erste Schritt zur Gewinnung der DNA war die Anwendung eines Lysepuffers, wel- cher Zellmembranen auflöst und somit die Intrazellularbestandteile entlässt. Zur besseren Reinheit der Ergebnisse, empfiehlt sich die Anwendung in zwei aufeinander folgenden Durchgängen. Dazu wurde zu jeder 3ml Blutprobe 6ml Lysepuffer hinzugegeben und diese anschließend 20 Minuten in Eis inkubiert. Danach wurden die Proben 20 Minuten zentrifugiert und es folgte der zweite Durchgang, bei dem zu jeder Probe nun nur noch 5 ml Lysepuffer gegeben wurde und diese anschließend wiederum 20 Minuten inkubiert und zentrifugiert wurde.
Um die störenden Proteine zu entfernen wurde nachfolgend der Proteinase-K-Verdau an- gewandt. Vorbereitend wurden die zusammengelagerten DNA-Proben in Reaktionsge- fäße überführt, in denen sie ein weiteres Mal zentrifugiert wurden. Der entstandene flüs- sige Überstand wurde mit Hilfe einer Pipette entfernt. Anschließend wurde die eigentliche Reaktion angesetzt, indem zu jeder Probe einen 400μl Mastermix hinzugegeben wurde, der sich wie folgt zusammensetzte:
190μl fluoreszenzfreies Wasser
40μl 10fach STE
20μl 10% SDS
150μl Proteinase K-Lösung (10mg/ml).
Die Proben wurden sorgfältig mit dem Mastermix gemischt und über mindestens 12 Stun- den in einen beheizten Rüttler gegeben, damit die Proteinbestandteile gebunden werden.
Nach Ablauf der vorgegebenen Zeit wurde jede Probe mit 400μl Phenol versetzt und so- mit „gewaschen“. Es schlossen sich eine zehnminütige Eisinkubation sowie eine ebenso lang andauernde Zentrifugation an. Der Überstand wurde wiederum entfernt und mit dem sich am Boden des Reagenzgefäßes befindlichen DNA-Rest wurde die Phenol-Waschung wiederholt.
Da nach diesen ersten Schritten die DNA aber noch nicht gänzlich rein von störenden Produkten ist, schloss sich eine weitere Waschung mit Chloroform an. Chloroform be- wirkt die Zusammenlagerung der an Phenol gebundenen Proteinbestandteile auf dem Bo- den des Gefäßes. Über dieser bodenständigen Phase liegt die DNA in einer wässrigen Phase. Für die Reaktion wurden etwa 250μl Chloroform zu jeder Probe hinzugegeben (je nach Probengröße, Verhältnis 1:1) und es folgte eine Inkubation auf Eis für fünf Minuten.
Nachfolgend wurde jede Probe siebeneinhalb Minuten zentrifugiert, wonach sich für ge- wöhnlich eine deutliche Phasentrennung zeigte. Nun war es möglich die obere Phase, in der sich die DNA befand, vom Rest der Reaktionsflüssigkeit zu trennen. Die DNA wurde mit der zweieinhalb fachen Menge 100% Uvasol ihres eigenen Volumens und der 0,1- fachen Menge an Natriumacetat versetzt, um eine Ausfällung der DNA zu erzielen, wel- che sich durch kleine weiße Wolken im Reaktionsgefäß darstellt.
Die DNA-Fällung beanspruchte etwa zwölf Stunden und anschließend folgte die letzte Aufreinigung der DNA. Hierzu wurden die Proben zunächst 30 Minuten zentrifugiert, danach wurden die Überstände abgegossen und jede Probe mit 500μl 70% Ethanol ver- setzt, um übriges Salz aus der Probe herauszulösen. Die Reaktionsgefäße wurden zehn Minuten zentrifugiert und der Überstand wiederum entfernt. Um sicher zu gehen wirklich alle ungewollten Bestandteile zu eliminieren, wurden die Proben noch kurzzeitig nach- zentrifugiert und der Überstand abermals mit der Pipette entfernt. Zuletzt wurden die Pro- ben bei 50°C getrocknet und je nach Probengröße mit 150-250μl 1xTE versetzt, gemischt
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und 48 Stunden stehen gelassen. Dieser Schritt beendete die DNA-Isolierung und die Proben konnten zu weiteren Verarbeitung genutzt werden.
3.2 PCR-Technik zur Amplifizierung von genomischer DNA
3.2.1 Funktionsprinzip der PCR-Technik
Die Polymerasekettenreaktion oder kurz PCR (Polymerase Chain Reaction) ist eine re- volutionäre Methode zur exponentiellen Vervielfältigung von DNA und wurde 1985 von Kary Mullis entwickelt (59). Mit ihrer Hilfe können kleinste Mengen an genetischem Material nachgewiesen und analysiert werden. Das Prinzip beruht auf der Eigenschaft der DNA-Polymerase einen komplementären DNA Strang zu einer Einzelstrangsequenz zu synthetisieren. Zur Eingrenzung des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts dienen Primer.
Sie bestehen aus wenigen Nukleotiden und binden an spezifischen Stellen und bestimmen somit den Start und das Ende der Sequenz. Durch Anlagerung der DNA-Polymerase an den Primern und nachfolgender Neusynthese des komplementären Stranges in 3´-5´- Richtung entsteht ein neuer Doppelstrang, der nun wiederum aufgetrennt werden kann und als neue Matrize dient (60).
Um ein DNA-Fragment zu kopieren, benötigt es drei Reaktionen mit je unterschiedlichen Temperaturen:
1. Denaturierung:
In der ersten Reaktion wird der Doppelstrang der DNA durch Hitze getrennt. Der Zusammenhalt der Einzelstränge der DNA kommt durch Wasserstoffbrückenbin- dungen zwischen den Basen Guanin und Cytosin sowie Thymin und Adenosin zustande. Um diese Bindungen zu lösen, wird die Hitzedenaturierung mit einem Temperaturoptimum zwischen 94 und 96 Grad Celsius angewandt.
2. Primerhybridisierung:
Die DNA liegt nun in Einzelsträngen vor und die Primer können an die gewünsch- ten Zielsequenzen binden. Die Temperatur ist stark von den eingesetzten Primern abhängig, aber liegt meist in einem Bereich zwischen 55 und 65 Grad Celsius. Es gibt einen Vorwärts-Primer und einen Rückwärts-Primer, sodass an jedem Ein- zelstrang sequenziert werden kann.
3. Elongation:
Die DNA-Polymerase setzt nun am 3´-Ende des Primers an und produziert den komplementären Strang, indem sie die dazu gegebenen freien Nukleotide in der richtigen Reihenfolge aneinandersetzt. Die einzustellende Temperatur hängt von dem optimalen Arbeitsspektrum der verwendeten DNA-Polymerase ab (meist 68- 72°C).
Diese drei Schritte werden nun so oft hintereinander ausgeführt, bis man schließlich Bil- lionen von Kopien hat. Meist werden 20 bis 30 Zyklen benötigt.
Abbildung 2: Schematische Darstellung einer Polymerasekettenreaktion, gezeichnet nach einer Vorlage aus: Die Polymerase-Kettenreaktion von Linz, U.;Degenhardt, H.(60)
3.2.2 Anwendung des PCR-Verfahrens
Die Polymerasekettenreaktionen wurden im Labor der Frauenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover maschinell durchgeführt. Die dafür entwickelten Thermocycler sind in der Lage, konstante Temperaturen zu halten sowie schnelle Temperaturwechsel zu erzielen. Wichtig ist, dass die Proben nicht durch Fremd-DNA-Material verunreinigt werden, weshalb unter einer sterilen Werkbank gearbeitet wurde. Außerdem sollten alle verwendeten Materialien vorher autoklaviert oder vom Hersteller steril verpackt sein.
Für den von mir verwendeten Reaktionsansatz wurden je 2,5µl der entsprechenden DNA- Probe in ein 1,5ml-Reaktionsgefäß pipettiert, welche auf Eis gelagert wurde, um eine vorzeitige Reaktion zu vermeiden. Nachfolgend wurde der Mastermix, ein Gemisch, das
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alle weiteren benötigten Reagenzien bereits enthält, angefertigt. Dieser setzte sich wie folgt zusammen:
Tabelle 2: Mastermix-Ansatz zur Anfertigung einer PCR
Reagenz Volumen
H2O 7µl
Q-Solution 2,5µl
AB-Puffer 2,5µl
Primer Forward 2,5µl
Primer Reverse 2,5µl
Mg2+ 2,5µl
dNTPs 2µl
TopTaq Polymerase 2µl
Gesamt: 22,5µl
Abhängig von dem zu amplifizierenden Exon wurde das dazu gehörige Primerpaar, be- stehend aus einem vorwärts und einem rückwärts arbeitenden Primer, verwendet. Zur Amplifizierung der einzelnen CHEK2-Exons wurden folgende Primer verwendet:
CHEK2-1F: CAg-CCC- AgA-AgA-ACT-ATA-gg CHEK2-1R: ACC-Tgg-ACA-ACT-CCA-ATC-Ag CHEK2-4F: ATC-AgT-gAT-CgC-CTC-TTg-Tg CHEK2-4R: AgA-gCA-ACA-CCC-TgT-CTC-AC CHEK2-5F: CTg-TgT-CCT-CTg-CAA-ACA-gg CHEK2-5R: Tgg-gAA-gTT-ATg-AAg-ACg-Tg CHEK2-6F: Agg-CAg-CCT-TgA-gTC-AAC-Tg CHEK2-6R: gCT-Agg-gTT-ACA-ggC-ATC-Ag
CHEK2-7F: gAA-CTT-CCA-AgC-CTC-TgA-gg CHEK2-7R: ggC-AAg-CCT-ACA-TTA-gAT-TC CHEK2-8F: gTT-TCC-AAC-Tgg-gAC-ATC-Tg CHEK2-8R: CgA-TTT-CTg-CCT-AAT-TCA-gg CHEK2-9F: CTT-ACg-gTT-TCA-CCC-AgC-Tg CHEK2-9R: CAA-AgT-gCT-ggg-ATT-ACA-gg CHEK2-10F: CTT-CTT-ggA-CTg-gCA-gAC-TAT-g CHEK2-10R: ATC-ACC-TCC-TAC-CAg-TCT-gTg-C CHEK2-11F: TCT-TTA-TAT-CTg-AAT-gCC-ACT-gAg CHEK2-11R: gCA-CAT-ACA-CAT-TTT-AgC-ATA-CCA CHEK2-12F: CgT-Gat-gAT-CTC-AgA-CCC-TC
CHEK2-12R: CAT-gTC-TCT-CAg-gCA-gCA-g CHEK2-13F: gCT-AgC-CCT-gTC-ATT-CTA-ggA-g CHEK2-13R: AgC-TCC-TTA-AgC-CCA-gAC-TAC-AT CHEK2-14F: CCA-CTT-TAC-Tgg-AAg-CAT-ATT-g CHEK2-14R: CAT-CAg-TgA-CTg-TgA-AAA-AgC-AA
Die Polymerase wurde stets zuletzt zu dem Mastermix gegeben, um eventuelle Reaktio- nen vorab zu minimieren. Der Mastermix wurde gemischt und je 22,5µl zu jeder Probe hinzugegeben. Anschließend wurden die Proben mit dem Mastermix gut vermischt und kurz zentrifugiert, um eventuelles Material von Deckel und Wand am Boden des Reakti- onsgefäßes zu sammeln. Außerdem wurde ein Leerwert eingesetzt, eine Probe, die aus- schließlich Mastermix enthält, um eine etwaige Verunreinigung nachweisen zu können.
Die Reaktionsgefäße wurden im Thermocycler platziert und das PCR-Programm TD63 gestartet, welches aus 35 Wiederholungen des PCR-Zyklus besteht und wie folgt pro- grammiert wurde:
3 Methoden 39 Tabelle 3: Ablauf einer PCR am Beispiel des Programms TD63
Schritt 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Temp. 95°C 63°C 72°C 63°C 72°C 94°C 72°C 94°C Zu Schritt 2.
Und x35 Zeit 5min 1min 1min 1min 1min 1min 1min 1min
Nach vollendeter Reaktion werden die Proben im Thermocycler automatisch gekühlt.
Anschließend konnten die Proben aus dem Thermocycler entfernt werden und in einem Agarosegel ausgewertet werden.
3.2.3 Besonderheiten von CHEK2 (Exon 10-14): LongRange PCR und Nested PCR
Da die Exons zehn bis vierzehn des CHEK2-Gens auch in anderen Genabschnitten als homologe Kopien, sog. Pseudogenen, die nicht codieren, vorkommen, ist es deutlich schwieriger sie durch eine Polymerasekettenreaktion spezifisch zu amplifizieren, da auch die Sequenzen der Pseudogene mit vervielfältigt werden. Daher empfiehlt es sich eine Long Range PCR durchzuführen, in der ein Abschnitt, in diesem Fall bestehend aus Exon 10 bis Exon 14, in einem Stück amplifiziert werden kann. Verwendet wurden folgende Primer:
CHK2_9-14F: CAT-CTC-AAg-AAg-Agg-ACT-gTC-T CHK2_9-14R: gCA-CAA-AgC-CCA-ggT-TCC-ATC
Da dieser DNA-Abschnitt eine sehr lange Sequenz darstellt, werden weitere spezielle Re- agenzien und ein anderes PCR-Programm für diese Reaktion benötigt. Anschließend kön- nen dann durch eine Nested PCR die einzelnen Exons von den zuvor amplifizierten Pro- ben einzeln vervielfältigt werden. Dies stellt sicher, dass für die darauffolgende Sequen- zierreaktion ausschließlich Genmaterial aus dem CHEK2-Gen verwendet wird.
Zur oben beschriebenen Reaktion wurden je 2,5µl DNA mit 22,5µl des Mastermixes in einem Reaktionsgefäß, welches auf Eis gelagert wurde, vermischt. Der Mastermix setzt sich aus folgenden Reagenzien zusammen:
