Bedeutung der Varianten in CHEK2

5.2.1 Leserasterdeletion c.1100delC

Die Mutation c.1100delC im CHEK2-Gen, welche einen vorzeitigen Abbruch der Trans-lation in der Kinase-Domäne verursacht und zu einem verkürzten und instabilen Protein führt, wurde bereits in diversen Studien mit einem erhöhten Risiko für Brustkrebs in Ver-bindung gebracht (46,54-56). Die Prävalenz in der gesunden Bevölkerung variiert zwi-schen den einzelnen Populationen (98). In der nordeuropäizwi-schen Bevölkerung wird die Variante für die Mehrheit der mit CHEK2-assoziierten Mammakarzinome verantwortlich gemacht (99). Margolin et al. fanden 2007 heraus, dass 1100delC in der schwedischen Population existiert und verstärkt bei Patientinnen mit familiärem Brustkrebs auftritt (2,2%), wogegen sich diese Mutation in der Kontrollgruppe lediglich zu 0,7% fand. Au-ßerdem fiel auf, dass die Variante vor allem bei jung erkrankten Patientinnen mit famili-ärem Brustkrebs vertreten war (5,1% der Patientinnen <45Jahre, p=0,003), deren mittle-res Diagnosealter zehn Jahre unter dem der anderen Brustkrebspatientinnen lag (p=0,001) (98). Zhang et al. untersuchten 3882 Brustkrebspatientinnen und 8609 Kontrollen völlig verschiedener Herkunft im Hinblick auf c.1100delC. In außereuropäischen Populationen fand sich die Mutation extrem selten (0% der Asiatinnen, 0,6% der Brasilianerinnen). In der weißen Population hingegen zeigte sich wiederum bei Patientinnen mit familiärem Brustkrebs eine erhöhte Frequenz. Es konnte belegt werden, dass Frauen aus weißen Po-pulationen mit familiärem Brustkrebs im Vergleich zu gesunden weißen Frauen eine rund fünffach erhöhte Wahrscheinlichkeit besitzen die CHEK2-Mutation zu tragen (OR: 5,2 [2,6-10,5], p<0,0001). Weiße Frauen, die an nicht familiärem Brustkrebs erkrankten, zeigten immerhin noch eine 2,6fach erhöhte Chance für c.1100delC (OR: 2,6 [1,1-5,8], p=0,05 (98). Dies entspricht auch den Erkenntnissen von Weischer et al., die in ihrer Studie von 2008 ein Odds Ratio von 2,7 [2,1-3,4] für das sporadische Mammakarzinom und ein Odds Ratio von 4,8 [3,3-7,2] für das familiäre Mammakarzinom in Kombination mit c.1100delC angeben, was einem kumulativen Risiko für Brustkrebs bis zum Alter von 70 Jahren bei CHEK2*1100delC-Heterozygotie von 37% entspricht (46).

Auch bei Patientinnen russischer Abstammung konnte c.1100delC nachgewiesen werden.

In der Studie von Chekmariova et al. waren 2,1% der unilateral betroffenen Frauen und

5,2% der bilateral betroffenen Mammakarzinompatientinnen betroffen. Im Kollektiv der gesunden Kontrollen im mittleren Alter zeigte lediglich 1/448 (0,2%) diese Variante, in den Kontrollen der älteren gesunden Frauen war es keine einzige (100). Diese Ergebnisse weisen allesamt auf eine potentiell wichtige klinische Rolle der CHEK2*1100delC-Tes-tung bei Frauen europäischer und russischer Herkunft im Hinblick auf das Mammakarzi-nom hin.

Bisher widmet sich der Großteil der Publikationen über c.1100delC zwar der Assoziation zum Mammakarzinom, aber auch andere maligne Erkrankungen konnten schon in Zu-sammenhang mit dem Polymorphismus in Verbindung gebracht. Dies betrifft unter ande-rem die Erkrankung am Prostatakarzinom, papillären Schilddrüsenkarzinom und Magen-karzinom (58,101,102).

c.1100delC und Endometriumkarzinom

Der Zusammenhang zwischen der c.1100delC-Mutation und Endometriumkarzinom ist bislang weitgehend unerforscht. Die einzigen Untersuchungen diesbezüglich stammten zu Beginn meiner Arbeit von Pennington et al., welche in einer Studie von 2013 das Ge-nom von 151 Patientinnen mit serösem EndometriumkarziGe-nom auf Keimbahnmutationen in 30 verschiedenen Tumorsuppresssor-Genen untersuchten. Es konnten in 1,3% der Fälle Mutationen im CHEK2-Gen detektiert werden, bei denen es sich um c.1100delC und p.I157T handelte (103).

In dem von mir untersuchten Kollektiv von Endometriumkarzinompatientinnen zeigten 1,9% der untersuchten Proben die c.1100delC-Mutation in heterozygoter Form. Im Ver-gleich zur gesunden Normalbevölkerung, in der die Mutation etwa zu 1 % vorkommt, ist dies eine Steigerung um mehr als 100%. Im Vergleich dazu tragen ungefähr vier Prozent der an Brustkrebs erkrankten Frauen die Variante (54). Das von mir erhobene Ergebnis ordnet sich also zwischen der Häufigkeitsverteilung von Gesunden und der von Brust-krebspatientinnen ein. Das niedrigere Risiko und die niedrigere Häufigkeit von Endomet-riumkarzinom könnten erklären, warum in den bisher bekannten Brustkrebsfamilien mit c.1100delC noch keine Häufung von Endometriumkarzinom aufgefallen ist. Die Zusam-menschau meiner Ergebnisse in Kombination mit den Erkenntnissen von Pennington et al. lassen aber vermuten, dass CHEK2*1100delC eine potentielle Rolle in der Entstehung von Endometriumkarzinom zuteil werden könnte. Mit Berücksichtigung der neuesten Er-kenntnisse im Hinblick auf das Brustkrebsrisiko durch c.1100delC und der daraus

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resultierenden Relevanz dieses Polymorphismus sind daher auch im Bereich der Endo-metriumkarzinomerkrankung weitere Fall-/Kontrollstudien dringend notwendig, um die genaue Bedeutung dieser Frameshift-Mutation und ihre Auswirkungen auf die Genese des häufigsten Tumors des weiblichen Genitals weiter zu eruieren.

Ein besonderes Augenmerk möchte ich auf die von mir untersuchte Patientin mit der Pro-bennummer EH36 legen, die heterozygote Trägerin der Mutation c.1100delC ist und 2010 die Diagnose eines Karzinosarkom des Uterus gestellt bekam. In der Krankengeschichte der Patientin finden sich außerdem eine Mamma-Karzinomerkrankung im Jahre 2000, ein Non-Hodgkin-Lymphom 2005 sowie ein Basalkarzinom am Ohr 2011. Solch eine Häufung von Krebserkrankungen lassen an ein Li-Fraumeni-Syndrom (LFS) denken, ein autosomal-dominat vererbtes Tumorprädispositionssyndrom, wenn auch die Kriterien für das LFS und das Li-Fraumeni-like-Syndrom enger gesetzt werden (104). Ursprünglich sind Mutationen in CHEK2, einschließlich c.1100delC, als Ursache für Li-Fraumeni-Syn-drom entdeckt und beschrieben worden (Bell et al. 1999). Tatsächlich haben Wissen-schaftler bereits den Zusammenhang zwischen CHEK2*1100delC und dem Li-Fraumeni-Syndrom untersucht und sind zu dem Schluss gekommen, dass die Variante nicht allein ursächlich für das LFS ist, sondern bei den untersuchten Patientinnen in Zusammenhang mit ihren Brust- und Kolorektalen Karzinomen stehen (105).

5.2.2 p.I157T

Die Variante p.I157T, welche durch einen Basenaustausch von Thymin gegen Cytosin an der Position 470 zu einer Missense-Mutation führt, steht ebenfalls in Verruf, das Risiko für eine Vielzahl von verschiedenen Karzinomen zu erhöhen (44,47). Diverse Studien gaben Anlass zu dieser Vermutung, so auch die Studie von Cybulski et al. von 2004, die p.I157T in Assoziation mit dem Mammakarzinom(OR 1.4; P=0.02), dem Kolonkarzinom (OR 2.0; P=0.001), dem Nierenzellkarzinom (OR 2.1; P=0.0006), dem Prostatakarzinom (OR 1.7; P=.002) und dem Schilddrüsenkarzinom (OR 1.9; P=0.04) fanden. Der Umfang der mit p.I157T assoziierten Krebsformen ist also deutlich größer, als vorerst gedacht (106). Des Weiteren konnte eine erhöhte Frequenz dieser Variante unter Patienten mit Kolorektalen Karzinomen im Rahmen eines Lynch-Syndroms festgestellt werden (OR = 1.7; p = 0.007) (107). In einer Metaanalyse von Han et al. aus dem Jahre 2013, in die Daten von 26.336 Fällen und 44.219 Kontrollen aus 18 verschiedenen Studien einflossen,

konnte eine allgemeine Empfindlichkeit für Krebserkrankungen gezeigt werden (OR, 1.39; 95% CI, 1.19-1.63; p<0.0001). Ebenso konnten erhöhte Risiken für die spezielle Erkrankung an einem Mammakarzinom (OR=1.58, 95% CI=1.42-1.75, p<0.00001) so-wie für das Kolorektale Karzinom (OR=1.67, 95% CI=1.24-2.26, p=0.0008) ermittelt werden (108). Dies beweist erneut die Relevanz des CHEK2-Gens in der Krebsforschung und der hier thematisierten Variante. Gleiche Schlussfolgerungen zogen auch Liu et al.

in einer Metaanalyse von 2012. Sie erhoben Daten von 19.621 Fällen und 27.001 Kon-trollen mit dem Ergebnis eines erhöhten Risikos für Brustkrebs (OR = 1.48 [1.31-1.66], P < 0.0001). Interessanter Weise zeigte sich eine starke Assoziation zwischen der Muta-tion p.I157T und Fällen mit lobulärem Mammakarzinom (OR = 4.17 [2.89-6.03], P <

0.0001)(109). Auch ein anderer Vertreter der gynäkologischen Tumore konnte bereits mit der p.I157T-Mutation in Verbindung gebracht werden. Szymanska et al. konnten 2006 den Zusammenhang zwischen dieser Missense-Variante und dem Auftreten von ovariel-len Zystadenomen (OR = 1.7; P = 0.005), ovarielovariel-len Borderline-Tumoren (OR = 2.6; P = 0.002) und gering invasiven Ovarialkarzinomen (OR = 2.1; P = 0.04) herstellen (110).

Daher scheint es nur logisch den Zusammenhang zwischen der p.I157T-Mutation und weiteren gynäkologischen Tumoren, wie dem Endometriumkarzinom weiter zu untersu-chen.

Im Gegensatz zu den genannten Studien, die p.I157T als krebsinduzierend beschreiben, existieren allerdings ebenso Analysen, die p.I157T eine hemmende Wirkung zusprechen und den SNP damit als protektiv für spezielle Krebserkrankungen deklarieren. So zeigt eine Studie von Cybulski von 2008, in der das Genom von 895 Lungenkrebspatienten, 430 Kehlkopfkrebspatienten sowie 6291 Kontrollen aus Polen untersucht wurde, dass bei p.I157T möglicherweise ein geringeres Risiko besteht, an diesen beiden Karzinomtypen zu erkranken (ORLunge = 0,3 [0,2-0,5], P = 3 x 10(-8), ORKehlkopf = 0,6 [0,3-0,99], P = 0,05) (111).

I157T und das Endometriumkarzinom

Die Missense-Mutation p.I157T im Exon 3 des CHEK2-Gens wurde bereits als Kandidat für Endometriumkarzinom geprüft. In einer Studie von Konstantinova et al. aus dem Jahr 2009 wurden 268 Endometriumkarzinompatientinnen und 449 weibliche Kontrollen auf das Vorliegen eben dieser Mutation hin getestet. Es zeigte sich, dass die Mutation p.I157T häufiger unter den Kontrollen vorhanden war als unter den Fällen (2.45% vs. 1.75%),

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jedoch waren diese Ergebnisse ohne statistische Signifikanz. Wurden in die Analyse aus-schließlich Fälle einbezogen, offenbarte sich eine starke Überexpression in Fällen mit spätem Diagnosezeitpunkt und tiefer myometrialer Invasion (20%, p = 0.01). Die Karzi-nome waren von unterschiedlichen histologischen Entitäten, sodass kein Zusammenhang zwischen einem bestimmten histologischen Typ und der Erkrankung zu bestehen scheint (112).

Unter den 239 von mir untersuchten DNA-Proben von Patientinnen zeigte eine Probe die p.I157T-Mutation. Allerdings stellte sich bei der Analyse der klinischen Daten heraus, dass diese Patientin kein Endometriumkarzinom im eigentlichen Sinne besitzt, sondern dass der Tumor die Histologie eines Sarkoms aufweist. Derzeit liegen keine ausführlichen Untersuchungen zur Assoziationen zwischen p.I157T und Sarkomen vor, wenngleich es hier erneut interessant ist, auf die ursprüngliche Identifizierung von p.I157T als eine Mu-tation bei Li-Fraumeni Patienten hinzuweisen (Bell et al. 1999).

5.2.3 Weitere genetische Variationen des CHEK2-Gens

Der von mir untersuchte Genpool wies mit den Polymorphismen c.1100delC und p.I157T zwei bereits bekannte und in vielerlei anderer Hinsicht untersuchte Varianten des CHEK2-Gens auf. Zu Beginn meiner Untersuchungen bestand die Hoffnung darin neue, bisher unbekannte Varianten im Genmaterial der von mir ausgewählten Patientinnen zu beobachten, was jedoch nicht eingetreten ist. Dafür verantwortlich ist sicherlich die ge-ringe Größe meines Kollektivs. Eine höhere Anzahl an Sanger-Sequenzierungen hätte aber damals den Rahmen dieser Arbeit gesprengt. Die Arbeiten könnten mit heutigen Methoden des Next-Generation Sequencing ergänzt werden, die einen weit höheren Durchsatz erlauben. Mit den Ergebnissen zu c.1100delC und p.I157T konnten bereits be-stehende Hypothesen unterstützt, bzw. ergänzt werden. Dennoch möchte ich hier einen Ausschnitt aus weiteren seltenen Mutationen im CHEK2-Gen in Zusammenhang mit Krebserkrankungen geben.

rs8135424 und Endometriumkarzinom

O´Mara et al. untersuchten in einer Studie von 2011 1597 Fälle und 1507 Kontrollen im Hinblick auf Polymorphismen in DNA-Reparaturgenen und Genen, die in den Hormon-stoffwechsel integriert sind. Ihre Ergebnisse zeigten für die Variante rs8135424, welche einen Basenaustausch im CHEK2-Gen an der Nukleotidposition 589 von Cytosin zu

Thymin darstellt, ein vermindertes Risiko für das Endometriumkarzinom (OR: 0,83 [0,70-0,98], p = 0,03) (113).

rs738722 und rs4822983 und Ösophaguskarzinom

In einer 2015 veröffentlichten Studie von Jia et al. konnte ein Zusammenhang zwischen oben genannten Polymorphismen und einem erhöhten Risiko für Ösophaguskrebs herge-stellt werden. Untersucht wurden 360 Fälle und 310 Kontrollen. Im χ²- Test konnte bereits für rs738722, welche einen Basenaustausch von Thymin zu Cytosin beschreibt, ein er-höhtes Risiko (OR = 1,343 [1,053-1,713], p = 0,017) ermittelt werden. Im additiven lo-gistischen Regressionsmodell waren sowohl rs738722 (OR = 1,43 [1,05-1,94], p = 0,02) als auch rs4822983 (OR = 1,42 [1,03-1,95], p = 0,028) mit einem erhöhten Risiko für das Ösophaguskarzinom assoziiert (114).

1422delT und das Li-Fraumeni-Syndrom

Bell et al. detektierten eine Variante in der Kinasedomäne von CHEK2, eine Deletion von Thymin an der Nukleotidposition c.1422, welche zu einem Frameshift geführt hätte.

Diese Variante stellte sich allerdings später als ein Sequenzier-Artefakt heraus, verursacht durch Sequenzen eines Pseudogens mit Homologie zu dem 3´-Bereich des CHEK2-Gens.

Für eine qualitativ gute Analyse der letzten Exons ist eine spezifische Voramplifikation mittels Long-range PCR wichtig, wie auch in meiner Arbeit durchgeführt (Abschnitt 3.2.3).

5.2.4 MLPA Ergebnisse

In dem von mir untersuchten Probenkollektiv zeigten zwei Proben Hinweise auf eine möglicherweise reduzierte Gendosis. Diese waren in der Probe EH20 im Exons 7 sowie in der Probe EJ142 in den Exons 1, 2, 3, 6, 9, 10 und 11 zu erkennen. Diese erfüllten die Qualitätskriterien (d- und Q- Fragmente) hinreichend, sodass eine fehlerhafte Signal-stärke eher unwahrscheinlich ist.

Es muss allerdings gesagt werden, dass der Versuch nur einmal durchgeführt wurde und daher ein Zufall möglich ist. Zur Validierung wäre daher eine Wiederholung notwendig.

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Zudem sollte eine Validierung auch durch andere Methoden wie zum Beispiel dem next generation sequenzing erfolgen, dabei ist es möglich, Stränge bis zu einer Länge von 15.000 Basen zu untersuchen. Ebenso wäre eine Untersuchung durch das single molecule sequenzing möglich, bei dem das Ausmaß des Gendosisreduktion genauer bestimmt wer-den kann.

5.2.5 CHEK2 in der gezielten Krebstherapie

Ziel der Targeted Therapie ist es, durch Medikamente Tumorzellen gezielt zu bekämpfen.

Angriffspunkte der Medikamente sind Merkmale, die es ausschließlich oder häufiger in Tumorzellen als in gesunden Zellen gibt. Dies geschieht z.B. durch Blockierung von Stoffwechselwegen und Wachstum oder durch gezielte Aktivierungen des Immunsys-tems. Zur Gruppe dieser Medikamente gehören unter anderem Signaltransduktionshem-mer, AngiogenesehemSignaltransduktionshem-mer, Antikörper, Proteasomhemmer und Methylierungshemmer (115).

Durch die bereits beschriebenen Funktionen von CHEK2 in der zellulären Antwort auf DNA-Schäden liegt die Vermutung nahe, durch eine Inhibition der CHK2-Kinase eine erhöhte Wirksamkeit gentoxischer Medikamenten zu erreichen (49). In der Tat konnte durch eine gegensätzliche (antisense) Hemmung von CHEK2 und anschließender Gam-mastrahlung oder die Anwendung von Topoisomerase-I-Hemmern eine erhöhte Apopto-seaktivität nachgewiesen werden (49). Eine weitere Studie zeigte, dass die Inhibition von CHEK2 durch kleine RNA (small interfering RNA) oder dominant-negative Formen der Kinase (CHEK2-DN) in Verbindung mit ionisierender Strahlung oder Doxorubicin eben-falls zu einer erhöhten Apoptoserate führt (55). Unglücklicherweise sind diese Inhibitoren noch nicht spezifisch genug und interferieren auch mit anderen Zielproteinen, vor allem mit dem funktionsverwandten CHEK1, wodurch das Ausmaß dieser Hemmung nicht ge-nau eingrenzt werden kann (55).

Trotz der teils widersprüchlichen Ergebnisse bezüglich des therapeutischen Nutzens durch eine CHEK2-Hemmung bleibt die Frage bestehen, ob auch der Verlust von CHEK2 in Krebsgewebe zum Vorteil für eine Krebstherapie genutzt werden kann. Ein erster Ver-such in diese Richtung ist die Verwendung von Poly-ADP-Ribose-Polymerase-Inhibito-ren (PARP), die die Reparatur von Einzelstrangbrüchen mittels Basenexzisionsreparatur hemmen und somit die BRCA1-initiierte Homologe Rekombination (RH) zur DNA-Re-paratur triggern. Diese wird u.a. durch CHEK2 vermittelt, beispielsweise über eine Phos-phorylierung von BRCA2, und sollte sie durch den Verlust von CHEK2 ebenfalls

beeinträchtigt sein, führt die verminderte Reparaturfähigkeit zu einer synthetischen Leta-lität, die mit einer erhöhter Apoptoserate einhergeht, was den Untergang der Tumorzelle bedeuten würde (49). Denkbar ist auch, dass CHKE2-defiziente Tumore besonders sen-sibel auf eine parallele Inhibition von CHEK1 reagieren könnten.

Im Gegensatz dazu könnte auch eine vermehrte Aktivierung von CHEK2 von therapeu-tischem Interesse sein, da hierdurch die Tumorzelle zur Beendigung der Proliferation ge-zwungen werden könnte. Eine Studie kombinierte p53-defiziente Kolonkarzinom- und HeLa-Zervixkarzinomzellen mit einer Tetrazyklin-induzierbaren Form von CHEK2. Tat-sächlich wurde bei Induktion die CHEK2-Kinase in beiden Zellreihen produziert und durch Phosphorylierung an T68 aktiviert. Der erhöhte Spiegel an aktivierter CHEK2-Kinase führte zu verminderter Zellproliferation, G2-Arrest und vermehrter Apoptose.

All diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass durch Manipulation der CHEK2-Kinase-Aktivierung ein therapeutischer Vorteil erzielt werden kann. Es stehen jedoch verschiedenste Reaktionswege zur Verfügung, deren Wirksamkeit unbedingt weiter er-forscht werden muss (57).