Sequenzierung

3.4.1 Funktionsprinzip der Sequenzierung

Die Sequenzierung ermöglicht die genaue Entschlüsselung der Basenabfolge eines defi-nierten DNA-Abschnitts. Es existieren verschiedene Methoden, die meisten leiten sich von der Methode nach Sanger aus dem Jahre 1975 ab (62). Dieses Verfahren erfolgt en-zymatischen und ist in der Lage DNA-Stränge mit einer Länge von bis zu 500 Basenpaa-ren zu sequenzieBasenpaa-ren (63). Mit Hilfe dieser Technik können Wildtypformen, sowie mög-liche homozygote oder heterozygote Ausprägungen einer Mutation detektiert werden.

Das Verfahren ähnelt zu Beginn der PCR. Später kommen andere Reaktionsschritte hinzu, die vor allem der Reinigung dienen. Das Prinzip der Sequenzierung selbst besteht jedoch in der Messung von Kettenabbrüchen. Dafür werden spezielle Terminatoren (2´,3´-Didesoxyribonukleosid-5´-triphosphate (ddNTPs)), die an ihrem 3´-Ende keine OH-Gruppe besitzen, verwendet. Sie können durch die DNA-Polymerase enzymatisch über ihre 5´-Triphosphatgruppen an vorangegangene 3´-OH-Gruppen angeknüpft werden und so in die wachsende Kette eingebaut werden, können selbst aber keine Phosphodies-terbrücken zu weiteren 2´-Desoxynukleotiden eingehen. Die Konsequenz ist ein Ketten-abbruch, der durch die zahlreiche Vervielfältigung an jeder möglichen Stelle greifen kann. Im Reaktionsansatz befinden sich also neben der DNA-Polymerase, den spezifi-schen Primern und den vier für die Kettenverlängerung notwendigen 2´-Desoxynukleo-sid-5´-triphoshaten (dNTPs) auch geringe Mengen der vier für den Kettenabbruch ver-antwortlichen ddNTPs. Durch eine Fluoreszenzmarkierung der ddNTPs kann diese je-weils letzte Base durch einen Fotomultiplier erkannt werden und so die komplette Se-quenz zusammengesetzt werden (63).

3.4.2 Anwendung der Sequenzierung PEG-Fällung

Zur Sequenzierung einer DNA-Probe ist eine vorangehende Amplifizierung mittels PCR unerlässlich, um ausreichend Genmaterial zu genieren. Da sich in dem PCR-Produkt

allerdings noch allerhand zusätzliches Material, wie Primer, Polymerase, etc. befindet, muss die DNA von diesen Substanzen gereinigt werden. Zu diesem Zweck wurde Po-lyethylenglykol (PEG) im Verhältnis 1:1 zum PCR-Produkt (25µl) gegeben und anschlie-ßend sorgfältig gemischt und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte eine zehnminütige Zentrifugation bei 13.200 rpm mit dem Ziel der Phasentrennung. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen war, konnte der PEG-Überstand abpipettiert und das übrige Reagenz mit je 100ml 100%igen Uvasol versetzt werden, um auch kleine Reste der PEG-Lösung zu entfernen. Nach weiteren zehn Minuten in der Zentrifuge und erneu-tem Abpipettieren des Überstands wurden die DNA-Pellets bei 50° Celsius zehn Minuten getrocknet und mit 16µl autoklaviertem HPLC-Wasser vermischt. Um die Qualität der gereinigten PCR-Produkte zu beurteilen, empfiehlt es sich diese in einem 2%- Agarosegel auszuwerten. Weist die Probe eine breite definierte Bande im Gel auf, ist dies ein Zeichen für die Reinheit der Probe und ausreichend Genmaterial. Anhand der unterschiedlich aus-fallenden Banden kann bestimmt werden, wie viel des Genmaterials für die weitere Ver-arbeitung vonnöten ist. Fällt die Bande schmal aus, muss entsprechend mehr DNA im nächsten Prozess eingesetzt werden.

Abbildung 4: Beispiel einer Gel-Elektrophorese CHEK2 Exon2/3 nach PEG-Fällung, EH17 = starke Bande mit viel Genmaterial, EJ14 = schwache Bande mit wenig Genmaterial

Sequenzierreaktion

Die Sequenzierreaktion läuft nach dem Prinzip einer Polymerasekettenreaktion ab, mit dem Unterschied, dass es randomisiert zu Kettenabbrüchen kommt. Vor der Sequenzie-rung selbst müssen die Primer auf ihre Funktionsfähigkeit getestet werden. Hierzu wur-den zuerst alle Vorwärts-Primer für die Exons 1 bis 14 mit je zwei zufällig ausgewählten

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DNA-Proben getestet und das Ergebnis der Sequenzierung bewertet. Zeigte sich ein nicht zufriedenstellendes Ergebnis, wurden die jeweiligen Rückwärts-Primer getestet und bei besseren Ergebnissen von dort an verwendet. Bei Ausbleiben einer Qualitätssteigerung durch den rückwärts arbeitenden Primer, wurde der Vorwärts-Primer verwendet.

Um diese Sequenzierreaktion zu beginnen, wurde ein bestimmtes Volumen an PCR-Pro-dukt, welches von der Bandenstärke der Gel-Elektrophorese abhing und meist zwischen 2,0µl und 4,0µl lag, mit dem vorher ausgetesteten Primer und dem Bigdye® Sequencing-Kit, der alle weiteren Reagenzien, wie beispielsweise Polymerase, dNTPS und die fluo-reszenzmarkierten ddNTPs enthält, gemischt und anschließend mit autoklaviertem HPLC-Wasser zu 10µl Gesamtlösung aufgefüllt.

Tabelle 6: Zusammensetzung der Proben zur Sequenzierung

Reagenz Volumen in µl

Gereinigtes PCR-Produkt 2,0-4,0µl

BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit 1,5µl

Autoklaviertes HPCL-Wasser 4,5-6,5µl

Gesamt: 10µl

Anschließend wurden die Reaktionsgefäße in den Thermocycler gegeben und das Pro-gramm „SEQ“ ausgewählt. Dieses ProPro-gramm beinhaltete insgesamt 26 Zyklen aus Dena-turierung, Annealing und Elongation, ähnelt damit also einer gewöhnlichen PCR mit dem Unterschied, dass Zeit- und Temperaturabschnitte verändert sind und eine finale Elonga-tionsphase nicht durchgeführt wird.

Tabelle 7: Ablauf der Sequenzierreaktion am Beispiel von „SEQ“

Sequenzierschritt Vordena-tu-rierung

Annealing Elongation Denaturie-rung

Kühlzyklus

Temperatur 95°C 50°C 60°C 95°C 10°C

Dauer 5 min 15 sec 4 min 30 sec unendlich

Wiederholungen 1 26 26 26 1

Die Sequenzierreaktion bewirkte, dass nach Abschluss der Reaktion wie bei einer ge-wöhnlichen PCR eine Vielzahl von komplementären Strängen synthetisiert wurde, jedoch in unterschiedlicher Länge durch die von den ddNTPs ausgelösten Kettenabbrüche. Die genaue Stelle des Abbruchs ist dabei randomisiert, da es von jeder der vier Basen gleich viele modifizierte Nukleotide gibt. Darüber hinaus fällt das Verhältnis von dNTPs zu ddNTPs sehr zugunsten der dNTPs aus, sodass es durchaus zu langen Ketten kommen kann, bevor ein ddNTP eingebaut wird und einen Abbruch bewirkt. Das Resultat ist dem-nach eine Vielzahl von Strängen, mit unterschiedlichen Längen, deren letzte Base stets fluoreszenzmarkiert ist.

Fällung der Sequenzierprodukte

Im Anschluss an eine Sequenzierreaktion musste die Probe wiederum von störenden zu-sätzlichen Bestandteilen gereinigt werden, denn diese würden die spätere Auswertung behindern. Dazu wurde jede 10µl-DNA-Probe mit dem dreifachen (30µl) an 100%-fluo-reszenzfreiem Ethanol (Uvasol) und dem 0,1fachen (1µl) an Natriumacetat versetzt, ge-rüttelt und je nach Belieben entweder eine Stunde in Dunkelheit bei Raumtemperatur oder mind. 12 Stunden im Kühlschrank inkubiert. Es folgte eine 30minütige Zentrifugation bei 13200 rpm. Der Überstand mit den störenden Agenzien wurde abgetragen und das DNA-Pellet mit 300µl 70%-fluoreszenzfreiem Ethanol gemischt und zehn Minuten bei 13200rpm in der Zentrifuge gewaschen. Nach vorsichtigem Abpipettieren des erneut ent-standenen Überstands wurde das Pellet bei 50°C etwa sieben Minuten im Thermoblock getrocknet und abschließend in 20µl 95%igem Formamid gelöst. Nach einer einstündigen Inkubation in Dunkelheit oder alternativ über Nacht bei 4°C im Kühlschrank konnte die DNA verwendet werden.

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Sequenzentschlüsselung

Zunächst wurden die Proben für die kapillarelektrophoretische Auftrennung vorbereitet.

Dazu empfiehlt sich eine dreiminütige Denaturierung bei 93°C in Kombination mit un-mittelbar anschließender Kühlung auf Eis. Für die Verwendung im 3100-Avant TM Ge-netic Analyzer mussten die nun denaturierten Proben in eine 96-Well Plate der Reihen-folge nach überführt werden und in den entsprechenden Probenträger gesetzt werden. Mit Hilfe der Data Collection Software wurden die wichtigsten Informationen eingeben. Eine neue Platte wurde erstellt und alle Probennummern nach der vorher bestimmten Reihen-folge eingegeben. Außerdem wurde die Kapillarlänge definiert (36cm), das zu verwen-dende Sequenziermodul (POP 6 TM) ausgewählt und der Ordner für die zu speichernden Ergebnisse bestimmt, bevor der Genetic Analyzer gestartet werden konnte. Die Laufzeit betrug etwa eine Stunde für vier Proben. War das Programm des Genetic Analyzers ab-geschlossen, konnten die Daten in dem vorgesehenen Ordner ausgewählt werden und mit Hilfe der Sequence Analysis Software graphisch dargestellt, begutachtet und bei gutem Gelingen ausgedruckt werden. Durch die optische Auswertung der einzelnen graphischen Muster in Vergleich zu der Wildtypfrequenz können so etwaige Mutationen nachgewie-sen werden. In der folgenden Abbildung ist ein Ausschnitt einer gelungenen Sequenzie-rung von Exon 2 dargestellt.

Abbildung 5: Ausschnitt einer Sequenzentschlüsselung, Exon 2 des CHEK2-Gens in Probe EJ10