4 Ergebnisse
4.2 CHEK2-Analyse
4.2.3 MLPA ® -Analyse
Abbildung 12: I157T (Probe EJ178, Exon 2/3) Abbildung 13: Beispiel Wildtyp (Probe EH10, E2/3)
4.2.3 MLPA®-Analyse
Große Deletionen oder Insertionen können bei Heterozygotie durch die in Abschnitt 4.2.2. beschriebenen Sequenzierungen vielfach nicht entdeckt werden. Um herauszufin-den, ob in den vorliegenden DNA-Proben Dosisunterschiede für einzelne Exons vorlie-gen, wurde außerdem eine MLPA®-Analyse durchgeführt. Diese ermöglicht die Detek-tion von DeleDetek-tionen oder DuplikaDetek-tionen einzelner Exons oder ganzer Gene. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden die Peak-Höhen der einzelnen Amplifikationsprodukte über die Summe der Werte jedes Exons normalisiert. Des Weiteren fand eine Normalisierung über sechs Referenzwerte (Positionen 133, 190, 210, 283, 381 und 409) statt. Diese wurden innerhalb des Exons miteinander verglichen.
Es wurden 36 Proben mit Hilfe von MLPA® analysiert, 32 davon konnten ausgewertet werden (Call-Rate von 89%).
Grafische Auswertung der Amplifikationsprodukte
Die Grafik der über die Summe der Exons normalisierten Werte für Exon 1 zeigte eine verringerte Gendosis der Probe EJ142 (Probe 30), mit einem Prozentwert von nur 3,8%.
Der Median lag bei 6,5%, den höchsten Wert weist die Probe EH17 (Probe 4) mit 10,5%
auf. Normalisierte man die Werte über sechs Referenzwerte, so war diese Abweichung nicht mehr erkennbar.
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Abbildung 14: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 1, normalisiert über die Summe aller Werte
Abbildung 15: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 1, normalisiert über sechs Referenzwerte
Auch der Wert für Exon 2 und 3 schien in der Probe EJ142 (Probe 30) mit nur 1,9%
verringert zu sein. Der Median lag bei 4,8%, der Mittelwert lautete 4,7%. Diese Verän-derung zeigte sich auch in der Normalisierung über die sechs Referenzpunkte.
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Abbildung 16: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 2/3, normalisiert über die Summe aller Werte
Bei der grafischen Analyse des vierten Exons zeigten sich keine deutlichen Abweichun-gen von über 50% des Medians. Dieser lag bei 6,1%, der Mittelwert lag bei 6,3%, der kleinste Wert lag bei der Probe EJ7 (Probe 13) mit 3,7%.
Abbildung 17: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 4, normalisiert über die Summe aller Werte
Auch bei Exon 5 zeigte sich eine weitgehend homogene Verteilung. Der Median lag bei 6,9%, der Mittelwert lag bei 6,8%. Den kleinsten Wert wies die Probe EJ7 (Probe 13) mit 4,4% auf.
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Abbildung 18: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 5, normalisiert über die Summe aller Werte
In Exon 6 zeigte die Probe EJ142 (Probe 30) einen Prozentwert von nur 2,1%. Bei der Normalisierung über die sechs Referenzwerte wies allerdings die Probe EH8 (Probe 1) den geringsten Wert auf. Der Median der Werte lag bei 4,6%, der Mittelwert bei 4,4%.
Abbildung 19: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 6, normalisiert über die Summe aller Werte
Die grafische Analyse des Exons 7 zeigte eine verringerte Gendosis bei der fünften Probe.
Dabei handelt es sich um die Probe EH20 mit einem Wert von 3,2%. Dieser war ebenfalls bei der Normalisierung über die sechs Referenzwerte verringert, jedoch nicht um mehr als 50% des Medians, welcher bei 5,8% liegt. Der Mittelwert lautete 5,7%.
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Abbildung 20: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 7, normalisiert über die Summe aller Werte
Die Analyse des Exons 8 wies einen Median 13,7% von und einen Mittelwert von 13,6%
auf. Der niedrigste Wert fand sich in der zehnte Probe EH41 (Probe 10) mit 9,5%, den höchsten Wert zeigte die zweite Probe (EH13) mit 18,3%, Abweichungen von über 50%
des Medians waren nicht vorhanden.
Abbildung 21: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 8, normalisiert über die Summe aller Werte
Der niedrigste Wert in der Auswertung des Exons 9 wies die Probe EJ142 (Probe 30) mit 2,0% auf. Bei der Normalisierung über die sechs Referenzwerte hatte die Probe EJ142 jedoch nicht den geringsten Wert. Bei dieser Auswertung stimmten Median und Mittel-wert mit einem Wert von 4,8% überein.
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Abbildung 22: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 9, normalisiert über die Summe aller Werte
Auch in der Auswertung des Exons 10 wies die Probe EJ142 (Probe 30) den niedrigsten Wert mit 2,5% auf. Hierbei lag im Vergleich auch über die Normalisierung mittels der sechs Referenzwerte der geringste Wert der CHEK2-Proben bei der Probe EJ142. Der Median lag bei 5,9%, der Mittelwert bei 6,4%. Die Abweichung lag damit knapp über der 50%-Marke des Medians.
Abbildung 23: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 10, normalisiert über die Summe aller Werte
Wiederum wies die Probe EJ142 (Probe 30) den niedrigsten Wert mit 2,8% in der Aus-wertung des Exons 11 auf. In der Normalisierung über die sechs Referenzwerte lag der
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Mittelwert Exon 10 ∑E Median Exon 10 ∑E
geringste Wert nicht bei dieser Probe. Der Median befand sich bei 5,0%, der Mittelwert liegt bei 5,3%.
Abbildung 24: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 11, normalisiert über die Summe aller Werte
Die Analyse des Exons 12 zeigte eine weitgehend homogene Verteilung. Der Median lag bei 15,6%, der Mittelwert fand sich bei 15,8%.
Abbildung 25: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 12, normalisiert über die Summe aller Werte
Die grafische Auswertung des Exon 13 zeigte bei den ersten drei, sowie Proben fünf und sieben eine Abweichung um die vier Prozentpunkte vom Median (10,2%) und Mittelwert
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Mittelwert Exon 11 ∑E Median Exon 11 ∑E
Mittelwert Exon 12 ∑E Median Exon 12 ∑E
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(10,1%). Den geringsten Wert wies die Probe EH57 (Probe 11) mit 5,9% auf, welche auch in der Normalisierung über die sechs Referenzwerte den geringsten Wert vorwies.
Abbildung 26: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 13, normalisiert über die Summe aller Werte
Bei der Auswertung des Exons 14 lag der Median bei 7,1%, der Mittelwert bei 9,0%. Bei den Proben EJ7 (Probe 13, 27,4%) und EJ142 (Probe 30, 27,1%) waren deutliche Abwei-chungen zu erkennen, die über der 50%-Marke des Medians lagen und somit für eine Erhöhung der DNA-Dosis sprachen. Ebenso verhielt es sich mit der Probe EJ153 (Probe 31), die einen Wert von 19,7% zeigte.
Abbildung 27: Relative Quantifizierung der genspezifischen Amplifikationsprodukte Exon 14, normalisiert über die Summe aller Werte
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Auswertung der Q- und D-Fragmente:
Zur Qualitätssicherung des MLPA®-Proben standen verschiedene Referenzwerte zur Verfügung. Die vier Quantitäts-Kontroll-Fragmente (Q-Fragmente) befinden sich an den Positionen 64, 70, 76 und 82 und geben an, wie viel DNA in der Probe vorhanden ist. Sie sind komplette Fragmente, die nicht hybridisiert oder legiert werden müssen. Je mehr DNA vorhanden ist, desto kleiner sind die Q-Fragmente, was im Umkehrschluss bedeu-tet, dass die Werte umso höher ausfallen, je weniger DNA vorhanden ist.
Die in der Tabelle aufgeführten Proben stellen diejenigen Proben dar, die in der grafi-schen Auswertung der MLPA-Versuche gröbere Abweichungen zeigten. Die Probe EJ7 zeigte einen erhöhten Wert für das Q-64-Fragment, die Proben EH41 und EH57 wiesen im Q-70-Fragment Abweichungen zu höheren Werten auf und die Probe EJ163 verfügte über einen erhöhten Wert für das Q-76-Fragment. In diesen Fällen könnte der Grund in der Abweichung der Exonlängen eine zu geringe DNA-Ausgangsmenge darstellen.
Des Weiteren existieren D-Fragmente, die sich an den Positionen 88 und 92 befinden. Sie detektieren Sequenzen mit starken CpG-Inseln. Diese beinhalten große Mengen an Gua-nin und Cytosin und lassen sich nur schlecht denaturieren. Sind die Fragmente klein, deu-tet dies auf Probleme bei der Denaturierung der DNA-Probe hin. Dies kann durch einen zu geringen Salzanteil (≤40mM) in der Probe bedingt sein. Durch inkomplette Denatu-rierungen können falsch positive Ergebnisse für Exon-Deletionen entstehen (67). Die Probe EH57 weist solch einen verringerten Wert für das D-92-Fragment auf. Dieser lag lediglich bei 1,3, wohingegen Median und Mittelwert bei 8,7 lagen. Damit kann dies Ur-sache einer falsch positiven Exondeletion sein. Zusammenfassend erfüllten vier der sechs im MLPA-Test auffälligen Proben nicht hinreichend die Qualitätskriterien. Die beiden verbleibenden Proben zeigten Hinweise auf eine möglicherweise reduzierte Dosis des Exons 7 (EH20) bzw. der Exons 1, 2, 3, 6, 9, 10 und 11 (EJ142).
4 Ergebnisse 81 Tabelle 23: Q- und D-Fragmentwerte der in MLPA® auffallenden Proben
Median
Mittel-wert EH20 EH41 EH57 EJ7 EJ142 EJ153
Q 64 2,0 3,5 1,1 2,0 0,7 9,6 4,5 4,9
Q 70 2,1 3,2 1,2 11,7 8,4 4,1 2,0 3,4
Q 76 0,6 1,5 1,1 / / 3,6 / 4,1
Q 82 3,5 5,2 / 5,7 6,2 9,9 / 1,5
D 88 8,3 8,8 11,3 6,5 7,1 7,1 8,0 7,3
D 92 8,7 8,7 11,1 4,7 1,3 8,7 9,3 8,1