Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem Zentrum für Pharmaforschung und medizinische Biotechnologie des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin
Genexpressions- und Metabolismusuntersuchungen der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin ( Dr. med. vet. )
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Daniela Rahmel
aus Berlin
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Borlak
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Borlak Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto
2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Heiner Niemann
Tag der mündlichen Prüfung: 03. Juni 2004
Abkürzungsverzeichnis
Acetyl-CoA Acetyl-CoenzymA
AFB1 Aflatoxin B1
AhR Aryl hydrocarbon-Rezeptor
AK Antikörper
AnH Anilin-Hydroxylase
APD Aminopyrin-N-Demethylase
AR Allergische Rhinitis
BeD Benzaldehyd-Dehydrogenase
bp Basenpaare
BROD Benzyloxyresorufin-O-Deethylase
BSA Bovines Serum Albumin
BzD Benzphetamin-N-Demethylase
bzw. beziehungsweise
CAR Constitutive Androstane Rezeptor
cDNA copy-DNA
CMT Cyclopentadienylmangantricarbonyl
CO Kohlenstoffmonoxid
CPM Counts per Minute
CYP Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasen
DCBN 2,6-Dichlorobenzonitril
DCPIP Dichlorophenolindophenol
DEN Diethylnitrosamin
DENd Diethylnitrosamin-N-Deethylase
DEPEC Diethylpyrocarbonat
DMNd Dimethylnitrosamin-N-Demethylase
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DPM Desintegrations per Minute
ECOD Ethoxycoumarin-O-Deethylase
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EH Epoxid-Hydrolase
ELISA Enzyme-linked immunosorbant assay
EmD Ethylmorphin-N-Demethylase
ErD Erythromycin-N-Demethylase
EROD Ethoxyresorufin-O-Deethylase
FMO Flavinhaltige Monooxygenasen
FS Friederiken-Stift
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GST Glutathion-S-Transferase
h Stunde
HMPA Hexamethylphosphoramid
HMPAd Hexamethylphosphoramid-N-Demethylase
HNEC human nasal epithelial cells
HPLC High Performance Liquid Chromatography
i.d.R. in der Regel
IgA ImmunglobulinA
IL Interleukin
IR Immunoreaktivität
LE Loteprednol-Etabonat
LK Leberkontrolle
LXR Liver X Rezeptor
M Metabolit
MFO Mischfunktionelle Oxygenase
MHH Medizinische Hochschule Hannover
min Minuten
mRNA Messenger-Ribonukleinsäure
MROD Methoxyresorufin-O-Demethylase
MTBE Methyltertbutylether
NADH Nicotinamidadenindinucletid
NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat
NDEA N-Nitrosodiethylamin
NM nasal mucosa
NNK 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon
NO Stickstoffmonoxid
NOS NO-Synthase
OM olfactory mucosa
OMP Odorant marker protein
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PAHs polyzyklische aromatische Hydrocarbone
p. appl. post applicationem
PAS periodic acid Schiff
PCR Polymerase-Kettenreaktion
pNPH p-Nitrophenol-Hydroxylase
PPAR Peroxisome proliferative activated Rezeptor
PrD Propionaldehyd-Dehydrogenase
PROD Pentoxyresorufin-O-Dealkylase
PVDF Polyvinylidendifluorid
PXR Pregnenolone X Rezeptor
RMDD retrometabolic drug design
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RT Reverse Transkriptase
s Sekunden
SDS Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
sog. Sogenannt
SOP Standard Operating Procedure
SPE solid phase extraction
TAE Tris-Essigsäure-EDTA
TBS Tris buffered saline
TCDD 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-Dioxin
TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylendiamin
tgl. täglich
TNF α Tumor-Nekrose-Faktor α
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
u.a. unter anderem
UDP Uridindiphosphat
UDP-GT Uridindiphosphat-Glucuronyl-Transferase UGT Uridindiphosphat-Glucuronyl-Transferase
Upm Umdrehungen pro Minute
usw. und so weiter
UV Ultraviolett
z.B. zum Beispiel
Zig. Zigaretten
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1 Anatomie der oberen Atemwege und der Nasenmuschel...2
1.2 Zellulärer Aufbau der Nasenschleimhaut ...7
1.3 Physiologie und Funktionen der oberen Atemwege ...11
1.4 Funktion der Nasenschleimhaut in der Biotransformation...13
1.5 Nasale Applikation von Arzneimitteln - Glucocorticoide – Soft Steroide...18
1.6 Ziel der Arbeit... 21
2. Material und Methoden... 22
2.1 Material ...22
2.1.1 Probenmaterial ...22
2.1.2 Chemiaklien...22
2.1.3 Geräte und Verbrauchsmaterialien...27
2.2 Methoden...31
2.2.1 Gewinnung und Transport des Probenmaterials...31
2.2.2 Genexpressionsuntersuchungen ...31
2.2.3 Proteinexpressionsuntersuchungen...35
2.2.4 Metabolismusuntersuchungen...40
3. Ergebnisse... 45
3.1 Genexpression...45
3.1.1 Qualität und Quantität der isolierten RNA...45
3.1.2 RT-PCR ...47
3.2 Proteinexpression...56
3.2.1 Poolgewichte und Bestimmung des mikrosomalen Proteingehaltes ...56
3.2.2 Western blot...56
3.3 Metabolismusuntersuchungen...58
3.3.1 Metabolismus von Loteprednol-Etabonat (LE) ...58
3.3.2 Testosteron-Metabolismus...69
3.3.3 EROD-Aktivitäten...72
4. Diskussion... 74
4.1 Untersuchtes Gewebe ...74
4.2 Exprimierte Gene ...75
4.3 Nachweisbares Protein...84
4.4 Metabolische Aktivität...86
4.5 Schlussfolgerungen... 89
5. Zusammenfassung ...90
6. Summary ...92
7. Danksagung ...93 8. Literaturverzeichnis ...94
9. Anhang ...I
9.1 Daten der Patienten für die Genexpression... I 9.2 Daten der Patienten für die mikrosomalen Pools ...II 9.3 Liste der verwendeten Primer...VII 9.4 Liste der verwendeten Primär- und Sekundärantikörper... IX 9.5 Agarosegele und graphische Darstellung der Genexpression...X 9.6 Darstellung der Western blots ...XLVII 9.7 HPLC-Chromatogramme von Lotepre dnol-Etabonat (LE) und seinen Metaboliten nach Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen... L
9.7.1 1. Versuchsabschnitt (Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten):
Serie 1 ... L 9.7.2 1. Versuchsabschnitt (Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten):
Serie 2 ...LII 9.7.3 2. Versuchsabschnitt (Inkubation mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) ... LVII 9.8 HPLC-Chromatogramme von Testosteron und seinen Metaboliten nach
Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen...LXI 9.9 Vorkommen von Enzymen in der respiratorischen Nasenschleimhaut (NM)
bei verschiedenen Spezies... LXIV
1. Einleitung
Die nasale Arzneistoffapplikation ist aufgrund der leichten Zugänglichkeit und der guten Durchblutung der Nasenschleimhaut nicht nur für lokal wirksame, sondern auch für systemisch wirksame Arzneimittel attraktiv. Trotz des wachsenden Interesses der pharmazeutischen Industrie an der nasalen Applikationsform ist die menschliche Nasenschleimhaut bislang kaum hinsichtlich ihrer Ausstattung an Arzneistoff- metabolisierenden Enzymen untersucht worden, was u.a. in der schwierigen Verfügbarkeit menschlichen Nasenschleimhautgewebes für wissenschaftliche Untersuchungen begründet sein dürfte. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die menschliche respiratorische Nasenschleimhaut bezüglich vorhandener Enzymsysteme sowie deren metabolischen Kompetenz näher zu charakterisieren. Im Fokus stand dabei der Nachweis der verschiedenen Isoformen des Cytochrom P450 Monooxygenasesystemes (CYPs), der wichtigsten Arzneistoff- metabolisierenden Enzymfamilie. Da das Cytochrom P450-System durch epigenetische Faktoren beeinflusst wird, wurde zusätzlich der Einfluss von Geschlecht und Raucher-Status auf das Genexpressionsmuster mitberücksichtigt. Darüber hinaus wurde die Verstoffwechselung des Glucocorticoids Loteprednol-Etabonat (LE) untersucht, welches sich derzeit in der klinischen Phase der Zulassung für die Behandlung allergischer Atemwegserkrankungen befindet (Szelenyi and Pahl, 2002). Damit sollte geprüft werden, ob und in welchem Ausmaß eine metabolische Inaktivierung durch die in der menschlichen Nasenschleimhaut vorhandenen Enzymsysteme erfolgt und ob dieser Arzneistoff somit potentiell für die nasale Applikation zur lokalen Behandlung in Frage käme.
Im Folgenden werden zunächst die anatomischen Grundlagen der oberen Atemwege und der Nasenmuscheln, von denen die untersuchte Nasenschleimhaut stammt, beschrieben.
Anschließend wird der zelluläre Aufbau der respiratorischen Nasenschleimhaut dargestellt. Es folgen Physiologie und Funktionen der oberen Atemwege sowie die Funktion der Nasenschleimhaut in der Biotransformation. Schließlich wird die nasale Applikation von Arzneimitteln erläutert, so dass über die medikamentöse Therapie allergischer Atemwegserkrankungen der Bogen zu den Glucocorticoiden und dem Arzneistoff Loteprednol-Etabonat geschlossen wird.
1.1 Anatomie der oberen Atemwege und der Nasenmuschel
Die Nasenschleimhaut ist Teil des Respirationsapparates, der sich in die folgenden drei funktionalen Abschnitte gliedert (Blue Histology, 2002; Kristic, 1991):
1. luftleitender Abschnitt, der die charakteristische respiratorische Schleimhaut besitzt.
Hierzu zählen die Nasenhöhle mit den Nasenmuscheln und den Nasennebenhöhlen, Nasopharynx, Larynx, Trachea und der Bronchialbaum mit seinen Bronchi, Bronchioli und Bronchioli terminales.
2. respiratorischer Abschnitt, der für den Gasaustausch verantwortlich ist und zu dem die Bronchioli respiratorii und das Alveolarsystem gehören.
3. Ventilationsabschnitt: Dabei handelt es sich um jene Teile des Muskuloskelettalapparates, welche die Atembewegungen ausführen.
Die knöcherne Grundlage für die Nasenschleimhaut liefert die Nasenhöhle (Cavum nasi oder Cavitas nasi), die gleichzeitig den Beginn des luftleitenden Abschnitts des Respirationsapparates darstellt. Die Nasenhöhle beginnt vorne mit den beiden Nasenlöchern, Nares, und kommuniziert hinten durch die Choanen, Choanae, mit dem nasalen Teil des Pharynx, der auch als Nasopharynx oder Epipharynx bezeichnet wird.
Durch die Nasenscheidewand, Septum nasi, entstehen zwei getrennte Nasenhöhlen, eine rechte und eine linke. Bei der Nasenscheidewand handelt es sich um eine mediane schleimhautüberzogene Trennwand, die in ihrem hinteren Teil aus Knochen, Septum nasi osseum, und in ihrem vorderen Teil aus Knorpel, Cartilago septi nasi, besteht. Das Nasenseptum steht meist jedoch nicht genau in der Medianen, sondern ist m.o.w. stark nach der einen oder anderen Seite verbogen (Septumdeviation). Nach Schiebler et al. (1997) tritt die Septumdeviation sogar bei über 70% der Menschen auf.
Die Seitenwand jeder Nasenhöhle ist medial zu drei Knochenlamellen aufgeworfen, der unteren, mittleren und oberen Nasenmuschel (Concha nasalis inferior, media et superior), wobei die oberen beiden Teile des Ethmoids sind, während es sich bei der unteren um einen eigenständigen Knochen handelt. Gelegentlich ist oberhalb der Concha nasalis superior noch eine Concha nasalis suprema ausgebildet, die ebenfalls einen Ethmoidalanteil darstellt. Durch die drei - gelegentlich vier - Nasenmuscheln ist die laterale Nasenhöhlenwand kompliziert gestaltet (siehe Abbildung 1). Da die Nasenmuscheln von ihren Anheftungszonen an der
Nasenhöhlenseitenwand nach medial und unten vorragen, entstehen zwischen den lateralen Flächen der Nasenmuscheln und der Seitenwand drei oder - bei Vorhandensein einer Concha nasalis suprema – vier Nasengänge: Meatus nasi inferior, medius, superior und evtl.
supremus. Der Raum oberhalb der oberen Nasenmuschel wird nicht als Nasengang bezeichnet, da er nicht durchgängig ist, sondern nach hinten durch das Keilbein, Os sphenoidale, verschlossen wird. Er wird aus diesem Grund als Recessus spheno-ethmoidalis bezeichnet. Die schleimhautüberzogenen Conchen erreichen i.d.R. das Nasenseptum nicht, so dass medial von ihnen der gemeinsame Nasengang, Meatus nasi communis, entsteht, der mit den anderen Nasengängen in Verbindung steht. Eine genauere Beschreibung der Nasenmuscheln selbst soll am Ende dieses Kapitels erfolgen.
Concha nasalis superior Concha nasalis media Concha nasalis inferior
Abbildung 1: Laterale Nasenhöhlenwand mit Concha nasalis superior, media und inferior
[aus: Netter FH, Kopf und Hals. In: Atlas der Anatomie des Menschen, 2. Auflage, Novartis AG, Basel: 38, 2000]
Der Boden der Nasenhöhle, der gleichzeitig auch das Dach der Mundhöhle bildet, wird jeweils vorne aus dem Processus palatinus maxillae und hinten aus der Lamina horizontalis ossis palatini gebildet.
Das Dach jeder Nasenhöhle setzt sich zusammen aus Teilen des Os ethmoidale, Os frontale, Os nasale und Os sphenoidale.
Grundsätzlich wird die Nasenhöhle in 3 strukturell und funktionell unterschiedliche Abschnitte unterteilt:
1. Nasenvorhöfe, Vestibula nasi: Die unmittelbar an die Nasenlöcher, Nares, angrenzenden Teile der Nasenhöhle stellen die ersten Zentimeter des luftleitenden Abschnitts des Respirationsapparates dar. Sie sind ausgekleidet mit verhorntem mehrschichtigem Plattenepithel, welches sich von der Gesichtshaut über die Nasenöffnung bis in die Vorhöfe fortsetzt. Dieser, auch als Regio cutanea bezeichnete Teil der Nasenhöhle, enthält außerdem besonders dicke Haare, sog. Vibrissen (Vibrissae), sowie apokrine Knäuelsdrüsen (Glandulae vestibulares nasi) und freie, d.h. nicht an Haare gebundene Talgdrüsen. Die Vibrissen, die im Gegensatz zu den Haaren der Haut keinen M. arrector besitzen, verhindern das Eindringen großer Schutzpartikel und Insekten. Seitlich befindet sich eine Epithelleiste, Limen nasi, die in etwa dem Übergang in die eigentliche Nasenhöhle mit ihrer Regio respiratoria und olfactoria entspricht und deshalb auch als „inneres Nasenloch“ (Ostium internum) bezeichnet und den Nasenlöchern als Ostium externum gegenüber gestellt wird. Im hinteren Bereich des Vestibulums werden Haare und Drüsen spärlicher. Das Epithel verliert seine Hornschicht und geht kontinuierlich in das respiratorische Epithel über.
2. Respiratorischer Abschnitt, Regio respiratoria: Der respiratorische Abschnitt schließt direkt an die Vorhöfe an und macht insgesamt den größten Anteil an der Nasenhöhle aus. Das verhornte mehrschichtige Plattenepithel der Nasenvorhöfe geht über ein unverhorntes, zunehmend dünner werdendes Plattenepithel in das mehrreihige Flimmerepithel der Regio respiratoria über. Dieses ist charakteristisch für alle Anteile des luftleitenden Abschnitts des Respirationsapparates und wird deshalb respiratorisches Epithel genannt. Der genaue histologische Aufbau wird in Kapitel 1.2.1 ausführlich erläutert.
3. Olfaktorischer Abschnitt, Regio olfactoria: Dieser Abschnitt ist gekennzeichnet durch das olfaktorische Epithel (Riechepithel, Riechschleimhaut), welches sich am Dach der Nasenhöhle, an der oberen Nasenmuschel und am gegenüberliegenden Teil des Nasenseptums befindet (Boenninghaus, 1996; Kristic, 1991; Speckmann and Wittkowski, 1998). Das olfaktorische Epithel ist mit 60 µm (Kristic, 1991; Lippert, 1996) deutlich dicker als das respiratorische Epithel und durch die Einlagerung von Lipofuszin gelbbraun gefärbt. Die Ausdehnung der Regio olfactoria wird beim Menschen in der Literatur relativ einheitlich mit 5 cm2 angegeben (Kristic, 1991;
Schiebler et al., 1997; Speckmann and Wittkowski, 1998; Weiss, 1988). Im Gegensatz zum Mensch erstreckt sich bei den Makrosmatikern die Riechschleimhaut auf eine wesentlich größere Oberfläche. So wird sie beispielsweise beim Hund mit ca. 100 cm2 (Benninghoff, 1994) angegeben.
Zum Schluss diese Kapitels möchte ich die Anatomie der Nasenmuscheln genauer betrachten, da von ihnen die Nasenschleimhaut stammt, die im Rahmen meiner Dissertation untersucht werden soll. Es handelt sich dabei um muschelartige Gebilde, die von der lateralen Wand der Nasenhöhle in das Lumen hineinragen und auf diese Weise die zuvor beschriebenen Nasengänge, Meatus nasi, bilden (siehe Abbildung 2). Ihre Form erhält die Nasenmuschel durch eine Knochenlamelle, die von einer m.o.w. dicken Schleimhaut überzogen ist.
Die untere Nasenmuschel, Concha nasalis inferior, ist die größte und längste. Von Lanz and Wachsmut h (1985) geben ihre Länge mit 35 – 58 mm, im Durchschnitt 47,7 mm, an. Sie beginnt direkt hinter dem Vestibulum nasi und hat die Form einer nach medial konvexen, vorne stumpfen und hinten zugeschärften Platte. Die konvexe, dem Meatus nasi communis zugewandte Fläche ist durch Anlagerung von Gefäßen und Drüsen fein modelliert, während die konkave Fläche glatt ist. Ihr Unterrand ist leicht nach lateral eingerollt und nimmt von hinten nach vorne an Mächtigkeit zu, was als Verstrebung aufgefasst wird.
Concha nasalis superior Concha nasalis media Concha nasalis inferior
Abbildung 2: computertomographische Darstellung der Nasenhöhle mit Nasenmuscheln und Nasenseptum
[aus: Westhofen Prof Dr M, Nase, Nasennebenhöhlen, Mittelgesicht und vordere Schädelbasis. In: Hals-Nasen- Ohrenheilkunde systematisch, UNI-MED Verlag AG, Bremen: 192, 2001]
Die mittlere Nasenmuschel, Concha nasalis media, ist die zweitgrößte und beginnt etwa 1,5 cm hinter dem Vorderende der unteren Nasenmuschel. Sie ist wie die untere Muschel von einer dicken Schleimhaut überzogen und ihre mediale konvexe und ihre konkave laterale Fläche ähneln in ihrer Oberflächenbeschaffenheit der unteren Nasenmuschel.
Die obere Nasenmuschel, Concha nasalis superior, entspringt ca. 1,5 cm hinter dem Vorderende der Concha nasalis media und stellt die kleinste der drei Muscheln dar. Die Form der Flächen ist mit jener der anderen beiden Conchen vergleichbar, während ihre Oberfläche bedingt durch die marklosen Fila olfactoria durch vertikalen Rinnen gezeichnet ist. Sie besitzt nur eine vergleichsweise dünne Schleimhaut und weist – im Gegensatz zu den unteren Nasenmuscheln – olfaktorisches Epithel auf.
Bisweilen existiert oberhalb der Concha nasalis superior noch eine Concha nasalis suprema, die ebenfalls vom Ethmoid gebildet wird. Von Lanz and Wachsmuth (1985) geben die Häufigkeit dieser Nebenmuschel mit 17,7% an. In solchen Fällen entsteht noch ein weiterer Nasengang, der Meatus nasi supremus, der – wie die anderen auch – mit dem Meatus nasi communis und dem Meatus nasopharyngeus in Verbindung steht.
1.2 Zellulärer Aufbau der Nasenschleimhaut
Im Anschluss an die makroskopische Betrachtung der Nasenhöhle soll nun der mikroskopische Aufbau der Nasenschleimhaut dargestellt werden. Die Schleimhaut, Mucosa, des Respirationstrakts wird - wie in anderen Geweben auch - in die Lamina epithelialis mucosae und die Lamina propria mucosae unterteilt, die durch eine Basalmembran voneinander getrennt werden. Bei der Lamina propria mucosae, die der Einfachheit halber oft als Propria bezeichnet wird, handelt es sich um Bindegewebe, welches als Verbindungsgewebe zu dem darunter befindlichen Stützgewebe, Knochen bzw. Knorpel, dient. Die Lamina epithelialis mucosae, auch Epithel genannt, vertritt die oberflächliche Schicht der Schleimhaut und ist von einem dünnen sero- mucösen Film überzogen. Je nach den am Aufbau des Epithels beteiligten Zellen unterscheidet man ein respiratorisches und ein olfaktorisches Epithel und damit eine Regio respiratoria und eine Regio olfactoria, wobei auch die Propria in beiden Regionen differiert.
Die respiratorische Schleimhaut hat ihren Namen aufgrund der Tatsache, dass sie im gesamten Bereich des luftleitenden Abschnitts des Respirationsapparates vorkommt.
Innerhalb der Nasenhöhle befindet sie sich am Nasenhöhlenboden, an der Seitenwand im Gebiet der unteren beiden Nasenmuscheln sowie am gegenüberliegenden Teil des Nasenseptums. Sie kleidet außerdem die Nasennebenhöhlen aus, ist dort aber nur vergleichsweise dünn. Am dicksten ist sie über den Conchen.
Es handelt sich hierbei um ein mehrreihiges Flimmerepithel, in dem zahlreich Becherzellen eingelagert sind. Es werden dabei folgende Zellarten unterschieden: Flimmerepithelzellen, Becherzellen sowie Intermediär- und Basalzellen (siehe Abbildung 3 und 4). An mechanisch stärker beanspruchten Stellen jedoch können Inseln von Plattenepithel vorkommen (Weiss, 1988). Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass auch die Vitamin A-Versorgung einen Einfluss auf Vorkommen und Ausdehnung des Plattenepithels hat (Million et al., 2001).
Abbildung 3: Schematische Darstellung des respiratorischen Epithels und der Kinozilien
[aus: Rohen JW and Lütjen-Drecoll E, Epithelgewebe. In: Funktionelle Histologie, 4. Auflage, Schattauer Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart: 72, 1999]
Die hochprismatischen Flimmerepithelzellen besitzen apikal feine, 5 – 10 µm lange (Linß and Halbhuber, 1991; Rohen and Lütjen-Drecoll, 1995) und 0,2 µm dicke (Linß and Halbhuber, 1991), bewegliche Zilien (Kinozilien, siehe Abbildung 3). Die Kinozilien gehen aus den Kinetosomen (Basalknötchen) hervor, die sich lichtmikroskopisch als feine, dunkle Linie, sog. Basalknötchenlinie, darstellen. Diese dient als wichtiges Unterscheidungsmerkmal für andere epitheliale Oberflächenstrukturen (z.B. Bürstensaum).
Die Kinozilienbewegung setzt sich zusammen aus einem raschen Schlag und einer langsamen Rückschwingphase. Dabei kann eine Frequenz von bis zu 30 Hz und eine Geschwindigkeit an der Zilienspitze von bis zu 2,5 m/s erreicht werden (Linß and Halbhuber, 1991). Beim Vorwärtsschlag ist die Zilie aufgerichtet und schlägt mit ganzer Kraft, während sie bei der Rückschwingphase stark gekrümmt ist, so dass sie sich praktisch unter dem Sekretfilm hindurchzieht. Auf diese Weise entsteht ein Flüssigkeitsstrom in Schlagrichtung, wobei die Kinozilien stets in Richtung Pharynx schlagen. Die peitschenartigen Zilienbewegungen kommen durch ein Vorbeigleiten der Mikrotubuli innerhalb des Kinoziliums zustande. Für den Energienachschub sorgen dabei Mitochondrien, die im apikalen Drittel der Flimmerepithelzellen zu finden sind. Durch inter- und intrazelluläre Koordination erfolgt eine Vereinheitlichung von Schlagrichtung und –frequenz, so dass ein wellenartiger Bewegungsablauf (Metachronie) entsteht, der dem Transport vo n Flüssigkeit, Schleim, Zellen und Fremdkörpern auf der Epitheloberfläche dient.
Flimmerepithelzelle Becherzelle Basalzelle Basalmembran seromucöse Drüsen
Die Becherzellen sind vor allem im hinteren Bereich der Nasenhöhle lokalisiert. Es handelt sich dabei um hochprismatischen Zellen, die stark mit PAS-positiven Schleimgranula gefüllt sind, so dass ihr abgeplatteter Kern und das Ergastoplasma an der Zellbasis zusammengedrängt werden. Becherzellen können auch als endoepitheliale mucöse Drüsen betrachtet werden, die zusammen mit den sero- mucösen Drüsen der Propria für den Schleimfilm auf der Epitheloberfläche verantwortlich sind. Dieser Schleimfilm ist insgesamt etwa 5 µm dick (Rohen and Lütjen-Drecoll, 1995) und setzt sich aus einer oberflächlichen Gel-Phase und einer tieferen Sol-Phase zusammen. Die Gel-Phase ist reich an Makromo lekülen und bildet eine viskoelastische Barriere, welche einen Widerstand für den aktiven, schnellen Schlag der Zilien gibt, die den Film dadurch verschieben können. Die Sol- Phase, auch Hypophase genannt, ist für die Zilienbewegung wichtig. In dieser Phase ziehen die erschlafften Zilien wieder zurück. Der Schleimfilm enthält neben wasserbindenden Glykoproteinen noch antibakterielle Proteine (Lysozyme, Laktoferrin), Immunglobuline (vor allem IgA) und Proteinaseinhibitoren, die für die lokale Infektionsabwehr von Bedeutung sind.
Die undifferenzierten Basalzellen reichen nicht bis zur Epitheloberfläche und haben keine Zilien. Wegen ihrer Teilungsfähigkeit sind sie als Stratum germinativum zu betrachten. Sie liefern die Intermediärzellen, die sich dann entweder zu Flimmerepithelzellen oder zu Becherzellen differenzieren.
Lamina epithelialis mucosae und Lamina propria mucosae werden durch eine auffallend dicke und glatte Basalmembran getrennt. So können sich die Epithelzellen bei den regenerativen Zellverschiebungen auf der Membran leicht verschieben (Rohen and Lütjen- Drecoll, 1995).
Die Lamina propria mucosae besteht aus lockerem Bindegewebe, das mit dem Periost der knöchernen Nasenwand bzw. dem Perichondrium der knorperligen Wandanteile fest verbunden ist. Subepithelial befinden sich Lymphozyten und Plasmazellen, einzeln und in Gruppen, und bilden so die lymphoide Zone. Teilweise sind diese Zellen auch intraepithelial zu finden. Unterhalb dieser Zone ist die Drüsenzone gelegen, in der zahlreich verzweigte, tubulo-alveoläre, sero-mucöse Drüsen, die Glandulae nasales, lokalisiert sind. Sie haben kurze Ausführungsgänge, die auf der Epitheloberfläche münden, sowie mucöse und seröse Drüsenanteile. In den mittleren und tieferen Schichten der Propria sind ausgedehnte venöse Schwellkörper gelegen, die besonders an der unteren und mittleren Nasenmuschel ausgeprägt
sind (Plexus cavernosi concharum). Die Füllung dieser Schwellkörper hat eine erhöhte Wärmeabstrahlung zur Folge und wird durch Dilatation der zuführenden Arteriolen sowie durch Konstriktion der abführenden tieferen Venen, die somit als Drosselvenen oder Sperrvenen dienen, hervorgerufen. Die Regulation erfolgt dabei autonom.
Insgesamt ist die Nasenschleimhaut gut mit Blutgefäßen versorgt. Die dickwandigen Arterien liegen nahe am Periost in Gestalt eines Gitterwerkes, von dem arkadenartige Gefäße abzweigen, die auf diese Weise die gesamte Propria senkrecht durchziehen. Kurz vor der Epitheloberfläche teilen sie sich in Arteriolen, aus denen ein dichtes Netzwerk fenestrierter Kapillaren entspringt, die teilweise die Oberfläche und teilweise die Drüsen versorgen.
Zwischen den Arterien und Venen befinden sich außerdem zahlreiche gewundene arteriovenöse Anastomosen.
Abbildung 4: Histologischer Schnitt durch die Schleimhaut der Nase im Bereich der Regio respiratoria (396x). Man beachte den deutlichen Flimmerbesatz (Kinozilien), die relative dicke, gerade verlaufende Basalmembran und das lockermaschige, gefäßreiche, subepitheliale Bindegewebe, in dem sich zahlreiche Lymp hozyten und Plasmazellen befinden.
[aus: Rohen JW and Lütjen-Drecoll E, Respirationssystem. In: Funktionelle Histologie, 4. Auflage, Schattauer Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart: 217, 1999]
Die Nasennebenhöhlen werden ebenfalls von Flimmerepithel ausgekleidet, wobei die Kinozilien hier in Richtung der Ostien schlagen. Im Gegensatz zur Nasenhaupthöhle sind in den Nebenhöhlen nur wenige Becherzellen vorhanden. Die Lamina propria mucosae ist zu einem dünnen Bindegewebsblatt umgebildet und auffallend gefäßarm. Sero-mucösen Drüsen sind nur vereinzelt vorhanden, venöse Schwellkörper fehlen hier vollkommen.
1.3 Physiologie und Funktionen der oberen Atemwege
Die Nasenhöhlen repräsentieren den ersten Teil des luftleitenden Abschnitts des Respirationsapparates und dienen somit in erster Linie der Luftleitung. Dabei gelangt der Hauptluftstrom von den Nasenlöchern über die Nasengänge zu den Choanen. Nur 5 – 10 % des Inspirationsvolumens erreichen das Riechepithel, die Nasennebenhöhlen sogar nur 1 % (Westhofen, 2001).
Neben der Luftleitung kommt den Nasenhöhlen noch eine weitere Aufgabe zu, die Vorbehandlung der Atemluft. Durch die Nasenmuscheln ist die Oberfläche der lateralen Nasenhöhlenwand in Falten gelegt. Die daraus resultierende Oberflächenvergrößerung erleichtert – zusammen mit der erzeugten turbulenten Strömung – die Konditionierung der Atemluft in Form von Erwärmung bzw. Abkühlung, Filterung bzw. Reinigung sowie in Form des Anfeuchtens der eingeatmeten Luft. Alles zusammen dient dem Schutz der tiefen Atemwege.
Durch unterschiedliche Blutfüllung der Schleimhaut bzw. der venösen Schwellkörper der unteren beiden Nasenmuscheln wird die inspirierte Luft auf eine Temperatur von etwa 36°C gebracht. Um einen effektiveren Wärmeaustausch zu erzielen, strömen Blut und Atemluft nach dem Gegenstromprinzip.
Eine erste Filterung der eingeatmeten Luft erfolgt durch die Vibrissen der Nasenvorhöfe. Sie fungieren als Art Reuse, die das Eindringen grober Partikel und Insekten in den Respirationstrakt verhindert. Kleinere Partikel werden dagegen durch die mucociliäre Clearance beseitigt. Hierbei transportieren die pharynxwärts schlagenden Kinozilien des Flimmerepithels den oberflächlichen Schleimfilm mit den darin gelösten Fremdstoffen zum Pharynx. Der Rachen wiederum ist reich an lymphatischen Einrichtungen, welche der Abwehr eingedrungener Mikroorganismen dienen. Zusätzlich enthält die oberflächliche, visköse Phase des Schleimfilmes antibakterielle Proteine, Immunglobuline sowie Proteinaseinhibitoren, die zusammen mit den Leukozyten des Epithels und der subepithelialen Gewebeschichten für die lokale Infektionsabwehr verantwortlich sind.
Schließlich erfolgt in den oberen Atemwegen noch das Anfeuchten der Atemluft auf 70 – 80
%. Erzielt wird dies durch Wasserverdunstung und durch Abgabe von Nasensekret, das gleichzeitig auch die Nasenschleimhaut vor dem Austrocknen schützt.
Anschwellen und vermehrte Sekretion der Nasenschleimhaut können verschiedene Ursachen haben. So kann dies reflektorisch über das vegetative Nervensystem, hormonell, durch Entzündungen, Allergien, Arzneimittel oder aber durch mechanische, thermische oder chemische Reize ausgelöst werden.
Im oberen hinteren Bereich der Nasenhöhle sind außerdem die Rezeptoren des Geruchssinnes lokalisiert. Wie bereits erwähnt, erreicht normalerweise nur ein kleiner Teil der eingeatmeten Luft die Regio olfactoria. Bei bewusster, tiefer Inspiration jedoch erhöht sich die Geschwindigkeit des eingeatmeten Luftstromes, die turbulente Strömung verwandelt sich in eine zunehmend laminare Strömung, und ein größerer Teil der Atemluft gelangt bis zum Riechepithel. Durch die geruchliche Prüfung der Inspirationsluft kommt dem olfaktorischen System somit auch noch eine Schutzfunktion zu, da viele schädliche Gase als übelriechend empfunden werden und ihre Einatmung deswegen vermieden wird.
Interessanterweise beruht die vorübergehende Minderung des Riechvermögens (Hyposmie) bei Schnupfen nicht auf einer Schädigung des olfaktorischen Systems, sondern auf der Tatsache, dass die Geruchsstoffe infolge der Schleimhautschwellung nicht mehr bis zur Riechschleimhaut gelangen.
Schließlich dient die Nasenhöhle mit ihren Nebenhöhlen beim Sprechen als Resonanzraum.
Die Konsonanten m, n und ng werden gesprochen, ohne dass der Nasenrachenraum durch das Gaumensegel abgeschlossen ist. Somit strömt die Luft via Nasenhöhle durch die Nase aus, weshalb genannte Konsonaten auch als Rhinophone bezeichnet werden.
1.4 Funktion der Nasenschleimhaut in der Biotransformation
Zusätzlich zu den in Kapitel 1.3 genannten Funktionen nimmt die Schleimhaut der oberen Atemwege auch in Bezug auf die Xenobiotransformation eine wichtige Rolle ein. Der Metabolismus von Xenobiotika wird in der Regel in zwei Phasen unterteilt. Die Phase I- Reaktion, auch Funktionalisierungsreaktion genannt, beinhaltet die Einführung oder Freisetzung funktioneller Gruppen, wie Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppen.
Die Endprodukte der Phase I-Reaktion enthalten somit chemisch reaktive funktionelle Gruppen, die von den Phase II-Enzymen benötigt werden.
Während der Phase II-Reaktion erfolgt die Konjugation der Phase I-Metaboliten an körpereigene Stoffe, weshalb dieser Vorgang auch als Konjugationsreaktion bezeichnet wird.
Hierzu zählen Glucuronidierung, Glycosidierung, Glutathion-Konjugation, Sulfatierung, Methylierung, Acetylierung, Aminosäuren-Konjugation sowie die Fettsäuren-Konjugation, deren einzige gemeinsame Eigenschaft ein energiereicher oder aktivierter Zwischenmetabolit darstellt, sei es ein aktivierter Cofaktor, wie beispielsweise UDP-Glucuronsäure bei der Glucuronidierung oder Acetyl-CoA bei der Acetylierung, oder sei es ein aktiviertes oder reaktives Xenobiotikum. Am Ende entstehen generell wasserlösliche und somit leicht eleminierbare Produkte.
Die Funktionalisierung der Verbindungen im Rahmen des Phase I-Metabolismus kann durch Oxidation, Reduktion (z.B. Reduktion von Nitrogruppen zu Aminogruppen) oder Hydrolyse (z.B. Hydrolyse von Estern durch Esterasen) erzielt werden. Phase I-Reaktionen werden von Monooxygenasen und anderen Oxidasen, Alkoho l- und Aldehyddehydrogenasen sowie Esterasen und Amidasen vermittelt. Die wichtigste Komponente des oxidativen Phase-I- Biotransformationssystems besteht aus einer Gruppe von Hämoproteinenzymen, welche kollektiv als Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasen (CYPs) bezeichnet werden.
Bei dem Cytochrom P450-System handelt es sich um eine Enzymsuperfamilie, die sich in diverse Familien und Subfamilien gliedert. Derzeit sind 18 Familien der humanen Cytochrom P450-Enzyme bekannt (Chen et al, 2002; Nelson, 2003), wobei die Anzahl sequenzierter Gene und Pseudogene ständig weiter ansteigt.
Als Hämoprotein besitzt das Cytochrom P450 ein Häm in Form eines Fe-Protoporphyrins, welches nicht-kovalent an das Apoprotein gebunden ist. Die Bezeichnung P450 stammt dabei von der Tatsache, dass das Cytochrom (Cytochrom = Pigment = P) in reduzierter Form in Anwesenheit von CO ein mit 450 nm spezifisches Absorptionsmaximum aufweist. Im Gegensatz zu den Bakterien sind genannte Cytochrome bei den Säugetieren stets membrangebunden und entweder in der inneren Membran der Mitochondrien oder aber – die Mehrheit der Cytochrome - in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert.
Das Cytochrom P450-System benötigt zusätzlich reduzierende Äquivalente, die vom NADPH oder manchmal auc h vom NADH stammen und via eines zweiten Enzyms auf das Cytochrom übertragen werden, sowie ein Atom Sauerstoff, welches von molekularem Sauerstoff oder von oxygenierten Substraten stammt. Da nur eines der beiden Sauerstoffatome von molekularem Sauerstoff in das Substrat inkorporiert wird, während das andere zu Wasser reduziert wird, werden diese Enzyme auch als Monooxygenasen bezeichnet und den Dioxygenasen, welche beide Atome einfügen, gegenüber gestellt. Aufgrund der beschriebenen doppelten Funktion – Oxidation des Substrates einerseits und Reduktion des Wassers andererseits – werden sie auch als Mischfunktionelle Oxygenasen (MFO) bezeichnet.
Um die metabolische Aktivität dieser Enzymsuperfamilie untersuchen zu können, bedient man sich bestimmter Markersubstrate, die entweder nur von einer einzelnen CYP-Isoform bzw. von einer Subfamilie oder aber von verschiedenen CYPs umgesetzt werden. Eine sehr häufig verwendete Gruppe sind dabei die 7-Alkoxyresorufine, zu denen 7-Ethoxyresorufin, 7- Methoxyresorufin, 7-Benzyloxyresorufin und 7-Pentoxyresorufin gehören. Die O- Dealkylierung des Ethoxyresorufins (EROD) ist mit den Cytochromen P450 1A1 (CYP 1A1) und 1A2 (CYP 1A2) assoziiert, von denen CYP 1A1 das Ethoxyresorufin in einem bedeutend größeren Ausmaß umsetzt, wenn beide Cytochrome vorhanden sind (Wardlaw et al., 1998).
Die Verstoffwechselung des Methoxyresorufins (MROD) wird dagegen einzig von CYP 1A2 ausgeführt (Wardlaw et al., 1998), während die O-Dealkylierung des Pentoxyresorufins (PROD) wiederum den Mitgliedern der CYP 2B-Subfamilie zugeschrieben wird (Gelardi et al., 2001; Hukkanen, 2000; Seubert et al., 2002; Wardlaw et al., 1998).
Ein weiteres Markersubstrat ist Testosteron, welches stereo- und regioselektiv von unterschiedlichen CYP-Isoformen hydroxyliert wird und somit die funktionelle Basis für das gleichzeitige Studium verschiedener Isozyme liefert.
Das wohl wichtigste Enzym innerhalb des Phase II-Metabolismus ist die UDP-Glucuronyl- Transferase (UDP-GT oder UGT), was mit der leichten Verfügbarkeit des benötigten Co- Faktors, der UDP-Glucuronsäure, erklärbar sein dürfte, da die UDP-Glucuronsäure Teil des intermediären Stoffwechsels ist und eng mit der Glycogensynthese verbunden ist. Auch hier handelt es sich um eine Enzymsuperfamilie, deren Mitglieder in zwei distinkte Familien unterteilt werden, UGT 1 und UGT 2 (King et al., 2000, Mackenzie et al., 1997).
Interessanterweise sind diese Enzyme ebenfalls in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert – was eine Ausnahme unter den Phase II-Enzymen darstellt – und damit in enger Nachbarschaft zum Cytochrom P450-System gelegen, so dass die entstehenden Phase I-Metaboliten direkt glucuronidiert werden können.
Ein weiteres Phase II-Enzym stellt die zytosolische Glutathion-S-Transferase (GST) dar, welche die Konjugation mit dem endogenen Tripeptid Glutathion katalysiert und aus zwei ähnlichen, aber nicht identischen Subunits zusammengesetzt ist. Die Glutathion-Konjugation unterscheidet sich signifikant von der Gluconat- und der Sulfat-Konjugation, da bei letztgenannten eine vorherige Aktivierung der Gluconat- bzw. Sulfat-Anteile notwendig ist. In diesem Fall aber ist die einzige chemische Voraussetzung ein elektrophiles Zentrum innerhalb des Substrates, das die Reaktion mit dem nukleophilen Glutathion ermöglicht. Somit kann die Glutathion-Konjugation als Schutzmechanismus aufgefasst werden, bei dem potentiell toxische, nukleophile Metaboliten einfach „aufgewischt“ werden (Gibson and Skett, 1986).
Die menschliche Nasenschleimhaut enthält alle Komponenten des Cytochrom P450-Systemes (Gervasi et al, 1991). Der Cytochrom P450-Gehalt der respiratorischen Schleimhaut des Menschen beträgt 25 pmol/mg Protein (Gervasi et al., 1991; Longo et al., 1989) und ist somit vergleichbar mit jenem von Hund und Ratte, jedoch geringer als jener beim Kaninchen (Gervasi et al., 1991). Verglichen mit anderen menschlichen Geweben entspricht diese CYP- Menge nur etwa 5% des Cytochromgehaltes der Leber, ist dagegen aber etwa doppelt so hoch wie in der Lunge (Gervasi et al., 1991).
Obwohl im Vergleich zur Leber die Nasenschleimhaut bezüglich ihrer Stoffwechselkapazität ein relativ unerforschtes Gebiet ist, sind trotzdem eine Anzahl konstitutiv exprimierter CYP- Isoformen in nasalen Geweben verschiedener Spezies gefunden worden, darunter Mitglieder der 1A-, 2A-, 2B-, 2C-, 2E-, 3A- und 4B-Subfamilie (Longo et al., 2000; Thornton-Manning et al., 1997). Das für die Regio olfactoria spezifische CYP 2G1 konnte bei Rind (Longo et al.,
1997), Schwein (Martini et al., 1998), Kaninchen (Ding and Coon, 1994) sowie bei Ratte und Maus (Gu et al., 1997; Gu et al., 1998) nachgewiesen werden.
Besonders gut untersucht ist die CYP 2A-Subfamilie, die beim Menschen drei Mitglieder aufweist: CYP 2A6, CYP 2A7 und CYP 2A13. CYP 2A6 und 2A7 sind reichlich in der Leber vorhanden in einem Verhältnis von etwa 1:1 (Koskela et al., 1999), während CYP 2A13 am höchsten in der Nasenschleimhaut exprimiert ist, gefolgt von Lunge und Trachea. Der CYP 2A13-Gehalt der Nasenschleimhaut ist etwa fünf mal höher als der CYP 2A6-Gehalt (Kosekla et al., 1999). Auch bei anderen Spezies sind in der Nasenschleimhaut CYP 2A-Isoformen vorhanden, beispielsweise CYP 2A10/11 beim Kaninchen, CYP 2A3 bei der Ratte und CYP 2A4/5 bei der Maus (Ding et al., 1994; Peng et al., 1993).
In der menschlichen Nasenschleimhaut ist aber nicht nur das Monooxygenase-System vertreten, sondern auch zahlreiche nicht-oxidative Enzyme, darunter die DT-Diaphorase (Gervasi et al., 1991), die Epoxid-Hydrolase (Gervasi et al., 1991; Green et al., 2001), die Glutathion-S-Transferase (Aceto et al., 1989; Gervasi et al., 1991; Green et al., 2001; Krishna et al., 1995) und das Cyanid-metabolisierende Enzyme Rhodanese (Lewis et al., 1991). Eine Übersicht über die von Gervasi et al. (1991) untersuchten Enzymaktivitäten ve rschiedener Phase I- und Phase II-Enzyme beim Menschen zeigen die Abbildungen 5 und 6.
Interessanterweise sind die Phase II-Enzyme zwei bis drei mal stoffwechselaktiver als das Cytochrom P450-System, so dass reaktive Phase I-Metaboliten gar nicht erst akkumulieren können (Gervasi et al., 1991) – eine Beobachtung, die auch Longo et al. (1991) beim Rind gemacht haben.
untersuchte Parameter nasale gepoolte Mikrosomen hepatische Mikrosomen
Protein (mg/g Gewebe) 3,5 11,2
ECOD (pmol/min/mg Protein) 2,9 480
EROD (pmol/min/mg Protein) 0,5 102
AnH (pmol/min/mg Protein) 65 687
HMPAd (pmol/min/mg Protein) 92 240
DMNd (pmol/min/mg Protein) 220 2045
APD (pmol/min/mg Protein) 65 826
Abbildung 5: Monooxygenase-Aktivitäten in menschlichen nasalen und hepatischen Mikrosomen (Gervasi et al., 1991).
untersuchte Parameter nasale gepoolte Mikrosomen hepatische Mikrosomen cytosolisches Protein
(mg/g Gewebe)
14,5 24,8
EH (nmol/min/mg Protein) 17,4 35,6
UDP-GT1 (nmol/min/mg Protein) <0,001 2,4
GST (nmol/min/mg Protein) 56,6 476
PrD (nmol/min/mg Protein) 2,08 3,07
BeD (nmol/min/mg Protein) 12,8 1,2
DT-Diaphorase
(nmol/min/mg Protein)
6,25 0,49
Carbonylreductase
(nmol/min/mg Protein)
1,92 1,85
Abbildung 6: Epoxid Hydrolase (EH) und Phase II-Enzymaktivitäten in menschlichen nasalen und hepatischen Mikrosomen (Gervasi et al., 1991).
1.5 Nasale Applikation von Arzneimitteln – Glucocorticoide – Soft Steroide
Die nasale Arzneistoffapplikation ist aufgrund der leichten Zugänglichkeit und der guten Durchblutung der Nasenschleimhaut sowohl für lokal, als auch für systemisch wirksame Arzneimittel eine attraktive Applikationsform. Bei den lokal wirksamen Arzneistoffen ist die nasale Applikationstechnik bereits für verschiedene Arzneistoffgruppen etabliert, darunter Vasokonstriktoren zur Schleimhautabschwellung ( z.B. Xylometazolin [Olynth], Oxymetazolin [Nasivin]), Mastzellstabilisatoren zur Verhinderung der Histaminausschüttung bei allergisch bedingten Erkrankungen (z.B. Cromoglicinsäure [Vividrin]) sowie verschiedene Glucocorticoide. Bei Letztgenannten handelt es sich um die wichtigste Klasse von Medikamenten zur Behandlung von Entzündungen und Allergien, gleichzeitig aber auch um Arzneimittel mit einem sehr breiten Nebenwirkungsspektrum.
Obwohl bei nasaler Administration nur ein kleiner Teil in den Blutkreislauf gelangt, sind systemische Wirkungen nicht ganz auszuschließen. Beispielsweise wird bei nasaler Verabreichung von Triamcinolonacetat eine Cortisolsuppression von 8 % (Einzeldosis) bzw.
16 % (Steady state-Dosis) beobachtet (Hochhaus et al., 2002).
Glucocorticoide stellen jedoch meistens einen unverzichtbaren Therapiebestandteil bei der Behandlung von Allergien dar, so auch bei der Behandlung der allergischen Rhinitis (Histologischer Schnitt durch die Nasenschleimhaut eines Patienten mit allergischer Rhinitis siehe Abbildung 7). Die allergische Rhinitis – als Allergiekorrelat der Nasenschleimhaut – ist eine weltweit verbreitete Erkrankung und betrifft etwa 10 – 50 % der Bevölkerung (Pawankar and Fokkens, 2001). Die steigende Prävalenz in den letzten Jahren, die häufige Kombination mit Asthma bronchiale (Kumar and Singh, 2002; Pawankar and Fokkens, 2001) und die meist unerlässliche Glucocorticoidtherapie haben die Suche nach neueren und sicheren Therapiekonzepten forciert. Durch Arzneistoffkonstruktion nach dem Prinzip des RMDD (retrometabolic drug design) ist eine neue Klasse von Steroiden entstanden, die sich durch einen erhöhten therapeutischen Index auszeichnet, da diese Substanzen so konstruiert sind, dass sie nach ihrer systemischen Verfügbarkeit sofort zu inaktiven Metaboliten verstoffwechselt werden (Bodor, 1999). Erster Vertreter dieser sog. Soft Steroide ist das Loteprednol-Etabonat (LE), das für allergische ophthalmologische Indikationen bereits zugelassen ist und sich derzeit in der klinischen Phase der Zulassung für die Behandlung
allergischer Atemwegserkrankungen befindet (Szelenyi and Pahl, 2002). In Abbildung 8 sind Design, Metabolismus und allgemeine Struktur von Soft Steroiden dargestellt.
Abbildung 7: Histologischer Schnitt durch die untere Nasenmuschel eines Patienten mit allergischer Rhinitis. Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Links: 100-fache Vergrößerung. Man beachte das mehrreihige Flimmerepithel, die deutliche Basalmembran und das lockere Bindegewebe der Lamina propria, in welches in den tieferen Schichten zahlreiche Immunzellen eingelagert sind. Rechts: 200-fache Vergrößerung.
Ausschnittsvergrößerung aus den tiefen Schichten der Nasenschleimhaut desselben Patienten. Man beachte die deutliche Infiltration von eosinophilen Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen.
[Die Aufnahmen wurden freundlicherweise von Prof. Dr. med. habil. Klaus Richter, Gemeinschaftspraxis für Pathologie Prof. Dr. K. Richter und Dr. W. Beschow, Hannover zur Verfügung gestellt.]
200 µm 100 µm
Abbildung 8: Design, Metabolismus und allgemeine Struktur von Soft Steroiden. Das Design beginnt mit einem inaktiven Metaboliten eines aktiven Steroids, gefolgt von einer Umwandlung dieses inaktiven Metaboliten in ein isosterisches/isoelektronisches Analog des Leitsteroids, von dem Aktivität angenommen wird. Das Design dieses Soft Steroids ist so gestaltet, dass jenes Steroid in einem Schritt zurück zu dem inaktiven Metaboliten verstoffwechselt wird, mit dem das Design begonnen hat, ohne sich dabei anderen metabolischen Umwandlungen zu unterziehen. Schließlich wird der inaktivierte Metabolit nach erfolgter Konjugation eleminiert.
[ in Anlehnung an: Bodor N, Recent advances in retrometabolic design approaches. J. Control. Release, 62: 209- 222, 1999.]
Soft Steroid inaktivierter
Metabolit
Konjugation und Elemination
Konjugation und Elemination retrometabolic drug design
(RMDD)
R1= Alkyl-, halogenierter Alkylrest, usw.
R2= Alkyl-, Carbonyl-, Carboxylrest, usw.
R3= H, α- oder β-CH3 X1, X2= H, F
∆1= Doppelbindung (vorhanden oder fehlend)
inaktivierter Metabolit
Soft Steroid inaktivierter
Metabolit
Konjugation und Elemination
Konjugation und Elemination retrometabolic drug design
(RMDD)
R1= Alkyl-, halogenierter Alkylrest, usw.
R2= Alkyl-, Carbonyl-, Carboxylrest, usw.
R3= H, α- oder β-CH3 X1, X2= H, F
∆1= Doppelbindung (vorhanden oder fehlend)
inaktivierter Metabolit
1.6 Ziel der Arbeit
Trotz des wachsenden Interesses der pharmazeutischen Industrie an der nasalen Applikationsform ist die menschliche Nasenschleimhaut bislang kaum hinsichtlich ihrer Arzneistoff- metabolisierenden Kompetenz untersucht. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die menschliche respiratorische Nasenschleimhaut bezüglich vorhandener Enzymsysteme sowie metabolischer Kompetenz näher zu charakterisieren. Schwerpunktmäßig wurden dabei die verschiedenen Isoformen des Cytochrom P450-Systemes (CYPs) untersucht. Da Rauchen nachweislich einen Einfluss auf die pulmonale CYP-Expression bei Mensch und Ratte besitzt (Eke and Iscan, 2002; Haussmann et al., 1998; Hukkanen, 2000; Willey et al., 1997) und bei der Ratte eine CYP-Enzyminduktion durch Zigarettenrauch auch in der nasalen Schleimhaut beobachtet wurde (Haussmann et al., 1998; Wardlaw et al., 1998), ist davon auszugehen, dass auch in der menschlichen Nasenschleimhaut Unterschiede im Genexpressionsmuster abhängig vom Raucherstatus auftreten. Um dieses zu untersuchen, wurden die Spender in eine Raucher- und eine Nicht-Raucher-Gruppe unterteilt. Die Nasenschleimhaut stammte dabei von Patienten, die sich aufgrund einer Muschelhyperplasie einer partiellen Turbinektomie der Concha nasalis inferior unterzogen haben.
Im ersten Versuchsabschnitt wurde die totale RNA der Schleimhaut isoliert, qualitativ und quantitativ bestimmt und mittels RT-PCR auf die Expression verschiedener Phase I- und Phase II- Enzyme, regulatorischer Rezeptoren sowie Entzündungsmediatoren untersucht.
Durch Ultrazentrifugation wurden im zweiten Versuchsabschnitt Mikrosomen gewonnen, wobei aufgrund der geringen Gewebemengen die Nasenmuscheln mehrerer Patienten gepoolt werden mussten. Auch hierbei wurde die Unterteilung in Raucher und Nicht-Raucher beibehalten. Die Mikrosomen wurden für die anschließende Proteinbestimmung verwendet, in deren Rahmen bestimmte Cytochrom P450 Monooxygenasen durch Western blotting weiter charakterisiert wurden, so dass Gen- und Proteinexpression dieser Isozyme verglichen werden konnten. Zur Untersuchung der metabolischen Kompetenz wurden die mikrosomalen Membranen für verschiedene katalytische Assays verwendet. Der Schwerpunkt ruhte hierbei auf der Verstoffwechselung des Soft Steroids Loteprednol- Etabonat (LE), dessen Metabolitenprofil mittels Radio-HPLC bestimmt wurde. Abschließend wurden die Enzymaktivitäten gegenüber den CYP-Markersubstraten Testosteron und Ethoxyresorufin ermittelt.
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Probenmaterial
humane Nasenmuscheln Friederiken-Stift, Hannover;
Medizinische Hochschule Hannover
2.1.2 Chemikalien
2.1.2.1 Reagentien für die Untersuchung der Genexpression
Agarose NEEO Ultra-Qualität, Rotigarose für Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe die Elektrophorese (Code 2267-3; Charge 43151566)
Bromphenolblau Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code B-8026; Charge 18H3630)
Custom Primers, 50nM, entsalzt Invitrogen GmbH, Karlsruhe (Primerliste einschließlich PCR-Bedingungen siehe Anhang Seite VII bis VIII)
DNA ladder, 100bp Invitrogen GmbH, Karlsruhe
(Code 15628-050; Charge 1131233)
DNA Typing Grade 50X TAE Buffer Life Technologies, Paisley, Schottland (Code 24710-030; Charge 1101351)
dNTP Mix (5mM für RT) Qiagen, Hilden
(Code 1010355; Charge 10921673)
dNTP Solution 100mM, PCR grade MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot (Code R0181; Charge 0273)
Ethanol 96% Riedel-de Haën Sigma-Aldrich, Seelze (Code 24105; Charge 13330)
Ethidiumbromidlösung 10 mg/ml Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code E-1510; Charge 117H8509)
Glycerin Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 3783.2; Charge 04252672)
HotStar Taq, 5 units/µl Qiagen, Hilden (Code 1007837; Charge 11239460)
2-Mercaptoethanol Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code M-7522; Charge 105F-02785)
Omniscript Reverse Transcriptase 4 units/µl Qiagen, Hilden (Code 1010890; Charge 11229931)
PCR Buffer, 10x Qiagen, Hilden
(Code 1005479; Charge 11239890)
Random Hexamers Promega, Mannheim
(Code C118A; Charge 13232211)
RNA 6000 Nano LabChip Agilent Technologies Deutschland GmbH, (Code 5065-4476; Charge EC18BK02) Waldbronn
RNA 6000 Nano Reagents & Supplies Agilent Technologies Deutschland GmbH, (Code 5065-4476; Charge EC21RK02) Waldbronn
RNasin Ribonuclease Inhibitor 10 000 units Promega, Mannheim (Code N211B; Charge 13000713)
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden
(Code 74104; Charge 11234541)
10 x RT Buffer Qiagen, Hilden
(Code 1010883; Charge 10922292)
Xylencyanol Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code X-4126; Charge 117H3626)
2.1.2.2 Reagentien für die mikrosomalen Untersuchungen
Acetonitril Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 8825.2; Charge 20281)
30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code 3029.1; Charge 18254163)
11-α-Hydroxyprogesteron Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code H-5502; Charge 17H0285)
Ammoniumacetat Merck KG, Darmstadt
(Code 1.01116.0500; Charge A180816 932)
Ammoniumperoxodisulfat Merck KG, Darmstadt
(Code 1.01201.0100; Charge K27070601)
β-Glucuronidase (EC 3.2.1.31) Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code G-0751; Charge 120K1321)
β-NADPH, reduced form Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code N-1630; Charge 81K7067)
Bicinchoninic Acid Solution Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code B-9643; Charge 60K5300)
Bovine Serum Albumin Fraction V PAA Laboratories GmbH, Linz, (Code K41-001-100; Charge G16112-207) Österreich
Chemicon ECL Chemicon, Temecula, USA
(Code 2230; Charge 20020402)
Dimethylsulfoxid Merck KG, Darmstadt
(Code 1.02952.1000; Charge K30558552 220)
EDTA Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code E-5134; Charge 100K0284)
Essigsäure Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 6755.1; Charge 31150335)
Ethanol 96% Riedel-de Haën Sigma-Aldrich, Seelze (Code 24105; Charge 13330)
Ethoxyresorufin Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code E-3763; Charge 22K4012)
Ethyl Acetat Mallinckrodt Baker B.V., Holland
(Code 8037; Charge 9930110002)
Glycin Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 3908.2; Charge 49151490)
Heptan Fluka Chemie GmbH, Schweiz
(Code 51745; Charge 423800/1)
Kupfer-(II)-sulfat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code P023.1; Charge 44046989)
[4-14C] Loteprednol Etabonate Amersham pharmacia biotech,
(Code CFQ13089) Buckinghamshire, England
Loteprednol Etabonate VIATRIS GmbH & Co KG, Frankfurt (Code X-387; Charge 25)
Methanol Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 4627.1; Charge 15253746)
Natriumchlorid Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 3957.1; Charge 02146852)
Potassium Chloride Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code P-5404; Charge 87H06665)
Precision blue protein standard prestained Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Code 161-0372; Charge 91731)
Primärantikörper für Western blot
(Liste der verwendeten Primärantikörper siehe Anhang Seite IX)
2-Propanol Merck KG, Darmstadt
(Code 1.09634.2500; Charge K29036034 112)
Resorufin Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code R-3257; Charge 18H3639)
Roti-Block 10x Konzentrat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code A151.1; Charge 06148259)
Roti-Load1 4x Konzentrat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code K929.1; Charge 27045406)
Rotiszinteco plus Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code 0016.2; Charge 40251611)
SDS ultra pure Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 2326.2; Charge 48046682)
Sekundärantikörper für Western blot Chemicon, Temecula, USA (Liste der verwendeten Sekundärantikörper siehe Anhang Seite IX)
Sodium hydroxide Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code S-5881; Charge 127H01821)
Sucrose Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code S-9378; Charge 100K0121)
TEMED p.a. Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 2367.1; Charge 06141122)
Testosteron Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code T1500; Charge 39H0638)
Tris Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 4855.2; Charge 50152286)
Trizma Base Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code T-1503; Charge 11K5424)
Trizma Hydrochloride Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code T-3253; Charge 69H5435)
Tween20 Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 9127.1; Charge 47046531)
Western Lightning Chemiluminescence PerkinElmer Life Sciences, Boston, USA Reagent Plus (Code NEL105; Charge 254753)
2.1.3 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies Deutschland GmbH,
(Serien-Nr. DE01727542) Waldbronn
Analysenwaage Sartorius MC210S Sartorius AG, Göttingen (Serien-Nr. 11410980)
Biometra Standard Power Pack P25 Biometra, Göttingen (Serien-Nr. 4111139)
BioRad PowerPac 200 Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 285BR04868)
BioRad PowerPac 300 Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 283BR09143)
BioRad Sub-CellGT Elektrophoresekammer Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 61S01069)
C18-Nucleosil-Säule (250 x 4 mm, Macherey-Nagel, Düren Partikelgröße 5 µm, Serien-Nr. 1106105)
Chirurgische Pinzette, 14,5 cm Medicalis, Garbsen Chirurgische Schere, gerade, spitz/spitz, 14,5 cm Medicalis, Garbsen ELISA Reader Dynatech MR5000 Dynatech, Ohio, USA (Serien-Nr. G3112)
Emission Filter 620/10 (615-625 nm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Code 1702426)
Excitation Filter 510/10 (505-515 nm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Code 1702423)
Filterpapier Merck KG, Darmstadt (Code 1001-931)
Flow Scintillation Analyzer 500TR Series Packard BioScience Company, USA (Serien-Nr. 421035)
Fluorometer VersaFluor Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 435 BR 0769)
Gelkammer Biometra Minigel-Twin Typ G42 Biometra, Göttingen (Serien-Nr. 1409129)
Gewebehomogenisator Dounce 7 ml und 1 ml Wheaton, USA
Glasplatte, ausgeschnitten Whatman Biometra, Göttingen (Code 010-003)
Glasplatte mit fixierten Spacern 0,6 mm Whatman Biometra, Göttingen (Code 010-002)
HPLC Series 1100 für Testosteronmetabolismus Hewlett Packard GmbH, Waldbronn [ Degasser G1322A (Serien-Nr. JP 73014117)
Quat Pump G1311A (Serien-Nr. DE 83104972) ALS G1313A (Serien-Nr. DE 82206896) Col Comp G1316A (Serien-Nr. DE 82207725) DAD G1315A (Serien-Nr. DE 90604736) ]
HPLC Series 1100 für Radio-HPLC Hewlett Packard GmbH, Waldbronn [ Degasser G1322A (Serien-Nr. JP 73014143)
Quat Pump G1311A (Serien-Nr. DE 83104953) ALS G1329A (Serien-Nr. DE 91603535) ALS Therm G1330A (Serien-Nr. DE 82203511) Col Comp G1316A (Serien-Nr. DE 82207724) VWD G1314A (Serien-Nr. JP 73797282) ]
Kamm 10-zähnig 0,6 mm für Minigel und Whatman Biometra, Göttingen Minigel-Twin (Code 010-016)
Klammern für Gelelektrophorese Whatman Biometra, Göttingen (Code 010-007)
Kodak Digital Science Image Station 440 CF Kodak, USA (Serien-Nr. 207102)
LS 6500 Multi-Purpos Scintillation Counter Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Serien-Nr. 7070019)
Magnetrührer Heidolph MR 3000 Heidolph Instruments GmbH & Co.KG,
(Serien-Nr. 030008262) Schwabach
Mahlkugeln Wolframcarbid 5 mm F. Kurt Retsch GmbH & Co KG, Haan (Code 05.368.0038)
Megafuge 2.0R Heraeus Kendro Laboratory Products, Osterode (Serien-Nr. 268322)
Mini Trans-Blot Elektrophoretic Transfer Cell Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 37S/4382)
MS2 Minishaker IKA IKA Works, INC., Wilmington, USA (Serien-Nr. 03.059839)
Nunc-Immuno Plates NUNC GmbH & Co KG, Wiesbaden
(Code 442 404)
Polycarbonatröhrchen Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Code 355618; Charge 010115)
PVDF-Transfer-Membran NEN Life Science Products, Boston,
(Code NEF102; Charge 183321) USA
Rotilabo-Einsätze 100 µl Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code C516.1; Charge 69752226AS7)
Rotor 70Ti Beckmann Coulter, Palo Alto, USA
(Serien-Nr. 01E 933)
Roto-Shake Genie Scientific Industries, Inc.,
(Serien-Nr. 1580) New York, USA
Schwingmühle Retsch MM 200 F. Kurt Retsch GmbH & Co KG, Haan (Serien-Nr. 200609018G)
Sigma Tischzentrifuge 1-15 Sigma Laborzentrifugen, Osterode (Serien-Nr. 83054)
Silikonabdichtung 1,0 mm für Minigel und Whatman Biometra, Göttingen Minigel-Twin (Code 010-005)
Spherisorb ODS-2-Säule (250 x 4 mm, Latek, Eppelheim Partikelgröße 3 µm, Serien-Nr. 9802010)
Test tube heater SHT 20 Stuart Scientific Co. Ltd., Surrey, England (Serien-Nr. 5051)
Thermocycler T3 Biometra, Göttingen
(Serien-Nr. 0904125, 0904126, 0904134)
Thermomixer compact Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,
(Serien-Nr. 5350 02163) Hamburg
Thermomixer comfort Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,
(Serien-Nr. 5355 03052) Hamburg
Trockeneis Kohlensäurewerk, Laatzen
Ultra Turrax® T8 IKA Labortechnik, Staufen
(Serien-Nr. 00.080400)
Ultrazentrifuge Optima LE-80K Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Serien-Nr. COL Ø 1C27)
Verschlüsse für Polycarbonatröhrchen Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Code 338824)
Waage BP 3100P Sartorius AG, Göttingen
(Serien-Nr. 11903531)
Wärmeschrank Typ UE 400 Memmert GmbH + CoKG, Schwabach (Serien-Nr. c498-0396)
Wasserbad Julabo SW21 Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach (Serien-Nr. 03904420519)
Waters Oasis HLB 3cc (60mg) Extraction Waters Corporation, USA Cartridges (Code WAT094226; Charge W2147J4)
White virgin PTFE septa, 8mm Agilent Technologies Deutschland GmbH,
(Code 5183-4434) Waldbronn
Zentrifuge Mikro 22R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen (Serien-Nr. 0001096-03-00)
Zentrifugenröhrchen 15 ml Sarstedt, Nümbrecht (Code 62.554.502; Charge 2182 1603)
Zentrifugenröhrchen 50 ml Sarstedt, Nümbrecht (Code 62.547.254; Charge 2196 7023)
2.2 Methoden
2.2.1 Gewinnung und Transport des Probenmateriales
Respiratorische Nasenschleimhaut wurde von Patienten gewonnen, die sich aufgrund einer Muschelhyperplasie einer partiellen Turbinektomie der Concha nasalis inferior unterzogen hatten (Auflistung der Patienten einschließlich der Patientendaten siehe Anhang Seiten I bis VI). Die Personen wurden vor dem operativen Eingriff über das Projekt aufgeklärt und haben ihre Einwilligung für die Untersuchung erteilt.
Innerhalb von 10 – 15 Minuten nach ihrer operativen Entfernung wurden die Nasenmuscheln mittels Trockeneis schockgefroren und bei –80°C gelagert.
2.2.2 Genexpressionsuntersuchungen
Sämtliche Untersuchungen zur Genexpression erfolgten in den Laboren T2.09 und T2.023 des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin.
2.2.2.1 RNA-Isolation
Die RNA-Isolation aus der humanen respiratorischen Nasenschleimhaut wurde nach dem Protokoll des Herstellers des RNeasy Mini Kits von Qiagen durchgeführt. Abweichend vom Protokoll wurde die gewonnene RNA jedoch nicht im mitgelieferten RNase-freien Wasser, sondern in 50 µl DEPC- (Diethylpyrocarbonat) Wasser eluiert. Um hauptsächlich epitheliales Gewebes zu erhalten, wurden die oberflächlichen Schichten der conchalen Schleimhaut vorsichtig von den darunter liegenden knorpeligen und knöchernen Trägerstrukturen abgekratzt. Anschließend wurde das im Buffer RLT (lysis buffer) des RNeasy Mini Kits befindliche Gewebe mit jeweils einer Bleikugel pro Probe in der Schwingmühle zwei Mal 60 Sekunden bei einer Frequenz von 15 Hz homogenisiert.
Die qualitative und quantitative RNA-Messung erfolgte mit dem Agilent Bioanalyzer der Agilent Technologies Deutschland GmbH, Waldbronn nach Herstellerprotokoll, wozu 1 µl RNA je Probe eingesetzt wurde. Zur Beurteilung der RNA-Qualität wurden die beiden ribosomalen Banden herangezogen, deren Verhältnis (28S rRNA : 18S rRNA) im Idealfall einer reinen und intakten RNA 2:1 ist. Die Schärfe der ribosomalen Banden wurde nicht für Qualitätsbeurteilung herangezogen.
Proben mit einer RNA-Konzentration > 60 ng/µl wurden für die nachfolgende RT-(Reverse Transkriptase) Reaktion verwendet, bei geringerer RNA-Ausbeute oder bei mangelnder Qualität wurde die RNA-Isolation wiederholt und die RNA erneut gemessen.
2.2.2.2 RT-Reaktion und RT-PCR
Die Umschreibung der RNA in cDNA wurde mit der Omniscript Reverse Transcriptase von Qiagen durchgeführt. Für die reverse Transkription wurde jeweils 1 µg RNA eingesetzt und mit der entsprechenden Menge DEPC-Wasser auf ein Volumen von 12,75 µl eingestellt. Anschließend wurde die RNA für 5 min bei 65°C denaturiert. Nach Herunterkühlen der Probe auf Raumtemperatur wurde der Reaktionsmix bestehend aus 2 µl 10 x RT-Puffer, 2 µl dNTP Mix (5 mM), 2 µl Random Hexamers (5 µM), 0,25 µl RNasin (5 µM) und 1 µl Omniscript Reverse Transcriptase hinzugegeben und die RT-Reaktion bei 37°C gestartet. Da bei Probe M-R 4 aufgrund der geringen RNA-Konzentration von nur 67 ng/µl bei Einsatz von 1 µg RNA das Volumen von 12,75 µl überschritten wurde, musste bei dieser Probe der 1,5-fache RT-Ansatz gewählt werden, d.h. die RNA wurde mittels DEPC-Wasser auf ein Volumen von 19,12 µl gebracht, die 1,5-fache Menge des genannten Reaktionsgemisches hinzugefügt und die Reaktion gestartet. Im Anschluss an die einstündige Inkubation bei 37°C, während der die RNA in cDNA umgeschrieben wurde, erfolgte
eine erneute Denaturierung bei 95°C für 5 min. Die entstandenen cDNA wurde bei –20°C aufbewahrt.
Unter Zugabe von 20 µl A. bidest. bzw. von 10 µl A. bidest. im Falle des 1,5-fachen RT-Ansatzes wurde die in der reversen Transkription gewonnene cDNA auf eine Konzentration von 25 ng/µl verdünnt und pro PCR-Ansatz jeweils 1 µl cDNA (25 ng) eingesetzt. Die PCR wurde mit der HotStar Taq DNA Polymerase von Qiagen durchgeführt. Zum PCR-Cocktail, bestehend aus jeweils 14,375 µl A. bidest., 2 µl 10x PCR Buffer, 0,5 µl dNTP Solution (10mM), 0,125 µl HotStar Taq Polymerase sowie 2 µl der jeweiligen 10 µM Primergebrauchslösung ( je 10 µl 5´ bzw. 3´ Primer auf 80 µl A. bidest.) wurden pro Ansatz 1 µl cDNA hinzugegeben und die Reaktion im Thermocycler für 15 min bei 95°C gestartet. Für die zyklische Amplifizierung wurden folgende Bedingungen gewählt:
Aktivierung der Polymerase 15 min bei 95°C, Denaturierung 45 s bei 95°C, Annealing 60 s mit primerspezifischen Temperaturen (siehe Anhang Seite VII bis VIII), Elongation 60 s bei 72°C. Je nach Oligomer wurden unterschiedliche Zyklenzahlen verwendet. Im Anschluss an den letzten Zyklus erfolgte stets eine Reaktion für 7 min bei 72°C sowie ein Herunterkühlen des Gerätes auf 4°C zur Konservierung der Proben.
Parallel zu den Proben wurden bei der PCR jeweils eine Leber- und eine Negativkontrolle mitgeführt. Bei der Leberkontrolle handelte es sich um cDNA, die aus RNA humaner Leberzellkulturen durch reverse Transkription gewonnen wurde. Leber wurde als Kontrolle verwendet, da es sich bei der Leber um dasjenige Organ handelt, in dem die meisten Cytochrom P450 Monooxygenasen exprimiert sind. Nicht in der Leber exprimiert sind dagegen die Cytochrome 2A13 (Koskela et al., 1999; Su et al., 2000), 2F1 (Carr et al., 2003; Chen et al., 2002; Ding and Kaminsky, 2002, Nishimura et al., 2003), 2S1 (Rylander et al., 2001), 3A5 (Hukkanen et al., 2003), 4B1 (Nhamburo et al., 1989; Nishimura et al., 2003) sowie die Enzyme FMO2 (Dolphin et al., 1998) und UGT 2A1 Jedlitschky et al., 1999). Aus methodischer Sicht wurde damit in Kauf genommen, dass nicht bei allen untersuchten Genen in der Leberkontrolle RT-PCR Amplifikate nachgewiesen werden konnten. Bei der Negativkontrolle wurde anstelle der cDNA 1 µl A. bidest.
eingesetzt.
