3. Ergebnisse
3.1 Genexpression
3.1.2 RT-PCR
Sämtliche Agarosegele der exprimierten Gene mit dazugehöriger graphischer Auswertung sind im Anhang auf den Seiten X bis XLVI dargestellt.
3.1.2.1 Genexpression der Housekeeping-Gene CyclophillinA und GAPDH
Genexpressionsergebnisse werden häufig in Relation zu stabil exprimierten Genen, sog.
Genen, dargestellt. GAPDH, welches in der Literatur oft als Housekeeping-Gen ausgewiesene wird (Jung et al., 1997; Mollerup et al., 1999; Jung et al., 2003), zeigte einen signifikanten Unt erschied (p<0,05) zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern. So lag der durchschnittliche geldensitrometrisch ermittelte RNA-Gehalt von GAPDH in der Raucher-Gruppe signifikant höher als in der Nicht-Raucher-Raucher-Gruppe (siehe Abbildung 17).
Bei CyclophillinA, einem weiteren Housekeeping- Gen (Elder et al., 2000; Yang et al., 2000), war der beobachtete Unterschied mit p = 0,076 statistisch zwar nicht signifikant, jedoch wurde aufgrund der Nähe zum Signifikanzniveau (p<0,05) auf eine Darstellung der Werte relativ zu Cyc lophillinA ebenfalls verzichtet.
Die Genexpressionsergebnisse werden daher absolut dargestellt.
Abbildung 17: Genexpression von CyclophillinA (links) und GAPDH (rechts). Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n = 12) und die Raucher-Gruppe (n = 10).
*: p = 0,076; **: p<0,05.
3.1.2.2 CYP-Genexpression
Von den insgesamt 20 untersuchten Cytochrom P450 Monooxygenasen (siehe Liste der verwendeten Primer im Anhang auf den Seiten VII und VIII) konnten die Cytochrome 1A2, 3A7 und 4A11 auch nach zahlreichen PCR-Amplifikationen von bis zu 39 Zyklen nicht nachgewiesen werden.
Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) zwischen der Raucher- und der Nicht-Raucher-Gruppe konnten für CYP 1A1, 1B1 und 2S1 ermittelt werden. Aus statistischer Sicht war dieser Unterschied bei CYP 1B1 mit einer Signifikanz von p<0,00006 am stärksten ausgeprägt, gefolgt von CYP 1A1 mit p<0,002. Alle drei Monooxygenasen waren bei den Rauchern stärker exprimiert als bei den Nicht-Rauchern. Betrachtet man bei genannten drei Genen zusätzlich das Geschlecht, so fällt auf, dass CYP 1A1 und 2S1 nur bei den Raucherinnen signifikant erhöht waren. Hingegen war CYP 1B1 geschlechtsunabhängig bei männlichen wie weiblichen Rauchern erhöht.
Abbildung 18: Genexpression von CYP 1B1 (links) und CYP 2S1 (rechts). Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n = 12) und die Raucher-Gruppe (n = 10).
*: p<0,00006; **: p<0,03.
Ein statistisch signifikanter Geschlechtsunterschied unabhängig vom Raucherstatus konnte nur für CYP 2J2 mit p<0,0004 ermittelt werden (siehe Abbildung 19). So exprimieren Männer CYP 2J2 weitaus stärker als Frauen, wobei bei einer Nichtraucherin (W-NR 5) keine CYP 2J2-Transkripte nachweisbar waren. Auch CYP 2C9 war bei Männern stärker exprimiert, wenngleich der Unterschied mit p = 0,063 statistisch nicht signifikant war. Hinzu kommt, dass CYP 2C9 bei nur 12 (neun Männern und drei Frauen) der 22 Probanden erfolgreich detektiert wurde, weshalb vor einer Bewertung weitere Untersuchungen mit größeren Patientenzahlen notwendig erscheinen.
CYP 1B1
Abbildung 19: Genexpression von CYP 2J2. Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Frauen (n = 10) und die Männer (n = 10).
*: p<0,0004.
Während CYP 1B1, 2A6/7, 2A13, 2B6, 2C8 und 2S1 bei allen Spendern in der respiratorischen Nasenschleimhaut exprimiert waren, fehlten die übrigen Cytochrome bei mindestens einer der insgesamt 22 Personen. CYP 2F1, 2J2 und 4B1 fehlten bei je einer Nicht-Raucherin, wobei es sich jeweils um eine andere Patientin handelte (W-NR 3, W-NR 5 und W-NR 2). CYP 3A4 war bei einer Raucherin R 4) sowie einer Nicht-Raucherin (W-NR 1) nicht nachweisbar, während die Cytochrome 2E1 und 3A5 bei je drei Nicht-Rauchern (jeweils bei zwei Männern und einer Frau) fehlten. Die Isozyme CYP 2C18 und 2C19 waren bei jeweils zwei Rauchern und einer Nicht-Raucherin (CYP 2C18: M-R 3, M-R 4, W-NR 3;
CYP 2C19: W-R 3, M-R 3 und W-NR 4) nicht nachweisbar.
Im Falle des CYP 2D6 war in Höhe des erwarteten Amplifikates von 332 bp keine Bande detektierbar, dafür jedoch mehrere größere Fragmente (siehe Abbildung 20).
CYP 2J2
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000
Frauen Männer
Lichtwerte
*
CYP 2J2
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000
Frauen Männer
Lichtwerte
CYP 2J2
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000
Frauen Männer
Lichtwerte
*
Abbildung 20: CYP 2D6-Genexpression bei Rauchern (A) und Nicht-Rauchern (B). Darstellung des 1,5
%igen Agarosegeles
Die an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) geme ssenen mittleren Lichtintensitäten der Cytochrome 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2E1 und 3A4 waren deutlich schwächer als jene der zugehörigen Positivkontrolle, während die mittlere CYP 2J2-Intensität das 2,3-fache der zugehörigen Positivkontrolle betrug. Nicht in der Positivkontrolle detektierbar waren Transkripte folgender Isoformen: CYP 2A13, 2F1, 2S1, 3A5 und 4B1.
332 bp
Ladder PK NK 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Ladder 332 bp
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7
W-NR M-NR
W-R M-R
A: Raucher :
B: Nicht-Raucher:
332 bp
Ladder PK NK 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Ladder 332 bp
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7
W-NR M-NR
W-R M-R
A: Raucher :
B: Nicht-Raucher:
3.1.2.3 Genexpression Flavinhaltiger Monooxygenasen (FMOs), der Epoxid-Hydrolase (EH) sowie verschiedener Phase II-Enzyme
Von den sechs bekannten FMOs (Cashman and Zhang, 2002; Furnes et al., 2003) wurden die Isozyme FMO 2, FMO 3 und FMO 5 auf ihre Expression in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut untersucht. Jedes der drei Gene konnte bei allen 22 Patienten nachgewiesen werden. Die bei den Rauchern beobachtete reprimierte FMO 2-Genexpression lag mit p=0,055 knapp unterhalb des statistischen Signifikanzniveaus von p<0,05. Interessanterweise verursachte dabei das Rauchen bei Männer und Frauen ganz unterschiedliche Effekte. Während die Expression von FMO 2 bei männlichen Spendern mit p<0,05 statistisch signifikant reduziert war, konnte bei weiblichen Spendern (p<0,98) kein Einfluss durch das Rauchen beobachtet werden (siehe Abbildung 21).
Vergleicht man die mittleren Lichtwerte der PCR-Amplifikate mit dem entsprechenden Lichtwert der mitgeführten Positivkontrolle (humane Leber), so war der Wert für FMO 3 mit dem der Positivkontrolle etwa vergleichbar, während der mittlere Wert für FMO 5 geringfügig darunter lag. FMO 2 dagegen konnte in der Positivkontrolle nicht nachgewiesen werden.
Abbildung 21: Genexpression von FMO 2 bei Frauen (links) und Männern (rechts). Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucherinnen (n = 5) und die Raucherinnen (n = 5) sowie für die Nicht-Raucher (n = 7) und die Raucher (n = 5). Man beachte die unterschiedlichen Effekte durch das Rauchen bei Männer und Frauen.
*: p<0,98; **: p<0,05.
FMO 2 bei Frauen FMO 2 bei Männern
*
FMO 2 bei Frauen FMO 2 bei Männern
*
**
Die Epoxid-Hydrolase (EH) katalysiert die Addition von Wasser an Epoxide, um das korrespondierende Dihydrodiol zu bilden. Diese Reaktion produziert hauptsächlich Metaboliten geringerer Reaktivität, die leicht zu konjugieren und auszuscheiden sind (Seidegard and Ekstrom, 1997). In der untersuchten Nasenschleimhaut konnten EH-Transkripte bei allen Personen nachgewiesen werden, wobei keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Raucher-Status oder Geschlecht erkennbar waren.
Von den Phase II- Enzymen Glutathion-S-Transferase (GST) und UDP-Glucuronyl-Transferase (UDP-GT oder UGT) wurden die Subformen GST α2, GST µ1, GST ρ1 sowie UGT 1A1 und UGT 2A1 untersucht.
Die hier untersuchten Glutathion-S-Transferasen waren jeweils bei allen Patienten nachweisbar. Die gemessenen Lichtwerte der PCR-Amplifikate der Spender lagen im Falle der GST µ1 leicht oberhalb des Lichtwertes der Leberkontrolle, im Falle der GST α2 eindeutig darüber. Mit Ausnahme zweier Raucher (W-R 2 und M-R 1), die nur ein schwaches Signal lieferten, befanden sich auch die Werte für GST ρ1 deutlich oberhalb des Wertes der Positivkontrolle. Raucher wiesen insgesamt einen geringeren mRNA-Gehalt an GST α2 auf (p<0,002), wie in Abbildung 22 zu sehen ist. Bei Betrachtung der Geschlechter zeigte sich dabei, dass dieser Unterschied nur bei männlichen Spendern (p<0,001) statistisch signifikant war, nicht jedoch bei weiblichen Spendern (p<0,33).
Abbildung 22: Genexpression von GST α2. Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n = 12) und die Raucher-Gruppe (n = 10) sowie Lichtwert für die Leberkontrolle.
*: p<0,002.
0 50000 100000 150000 200000 250000
Leberkontrolle Nicht-Raucher Raucher Lichtwerte
*
GST α2 GST α2 GST α2
0 50000 100000 150000 200000 250000
Leberkontrolle Nicht-Raucher Raucher Lichtwerte
*
GST α2 GST α2 GST α2
*
GST α2 GST α2 GST α2
Die in der Leber stark exprimierte UGT 1A1 ließ sich in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut bei vier Rauchern und zwei Nicht-Rauchern nachweisen, allerdings erst nach 39 PCR-Amplifikationszyklen (siehe Abbildung XXVI im Anhang Seite XXXV).
Dagegen war die auch als olfaktorische UGT bezeichnete UGT 2A1 (Jedlitschky et al., 1999) in der Nasenschleimhaut sämtlicher 22 Spender vorhanden (siehe Abbildung XXVII im Anhang Seite XXXVI), nicht jedoch in der Positivkontrolle (humane Leber). Signifikante Unterschiede hinsichtlich Raucher-Status oder Geschlecht waren weder bei den drei Glutathion-S-Transferasen, noch bei den beiden UDP-Glucuronyl- Transferasen erkennbar.
3.1.2.4 Genexpression verschiedener regulatorischer Rezeptoren
Da die transkriptorische Regulation der hier untersuchten Enzyme unter anderem über verschiedene nukleäre Transkriptionsfaktoren bzw. Rezeptoren erfolgt, wurden ergänzend folgende Rezeptoren in die Untersuchungen miteinbezogen: Aryl hydrocarbon-Rezeptor (AhR), Constitutive Androstane Rezeptor β (CAR β), Liver X Rezeptor α (LXR α), Pregnenolone X Rezeptor (PXR), Peroxisome proliferative activated Rezeptor α (PPAR α) und Peroxisome proliferative activated Rezeptor γ (PPAR γ).
Die Rezeptoren AhR, LXR α, PXR, PPAR α und PPAR γ waren in der respiratorischen Nasenschleimhaut aller 22 Personen exprimiert, wobei AhR, PPAR α und PPAR γ vergleichbare Lichtintensitäten wie die Positivkontrolle (humane Leber) lieferten, während LXR α und PXR deutlich schwächere Lichtintensitäten aufwiesen. CAR β war interessanterweise nur bei vier weiblichen Rauchern und sechs männlichen Nicht-Rauchern nachweisbar (siehe Abbildung XXIX im Anhang Seite XXXVIII), und zwar mit Lichtwerten deutlich unterhalb der Positivkontrolle.
Ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,015) zwischen der Raucher- und der Nicht-Raucher-Gruppe war nur bei PPAR γ (siehe Abbildung 23) vorhanden. Interessanterweise war die beobachtete PPAR γ-Induktion nur bei den Raucherinnen aufzeigbar. PXR wiederum war mit einer statistischen Signifikanz von p<0,005 bei weiblichen Spendern stärker exprimiert als bei männlichen (siehe Abbildung 23).
Abbildung 23: Genexpression von PPAR γ (links) und PXR (rechts). Mittelwerte und Standardabweichungen der an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte für die Nicht-Raucher- (n = 12) und die Raucher-Gruppe (n = 10) im Fall von PPAR γ bzw. für Frauen (n = 10) und Männer (n = 12) im Fall von PXR.
*: p<0,015; **: p<0,005.
3.1.2.5 Genexpression verschiedener Cytokine
Da Rauchen nachweislich zu entzündlichen Atemwegsveränderungen führt (Dwyer, 2003;
Kasuga et al., 2003; Oudijk et al., 2003), wurden folgende Cytokine als Marker für mögliche Entzündungsreaktionen (Jones et al., 2003) untersucht: IL-1β, IL-6, IL-8 und TNF α. Auf diese Weise sollte geprüft werden, ob die zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern beobachteten Unterschiede in der Genexpression in Zusammenhang mit einer möglichen Nasenschleimhautentzündung gebracht werden könnten. Unterschiede in der Expression genannter Entzündungsmediatoren zwischen Rauchern und Nicht-Rauchern konnten jedoch nicht festgestellt werden.
Transkripte von TNF α und IL-8 waren bei allen Patienten nachweisbar, IL-1β-Amplifikate fehlten bei einer Nicht-Raucherin (W-NR 2). Dagegen war IL-6 nur bei sechs Rauchern (drei weibliche und drei männliche) und vier Nicht-Rauchern (zwei männliche und zwei weibliche) exprimiert.