Genexpressionsuntersuchungen

Sämtliche Untersuchungen zur Genexpression erfolgten in den Laboren T2.09 und T2.023 des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin.

2.2.2.1 RNA-Isolation

Die RNA-Isolation aus der humanen respiratorischen Nasenschleimhaut wurde nach dem Protokoll des Herstellers des RNeasy^ Mini Kits von Qiagen durchgeführt. Abweichend vom Protokoll wurde die gewonnene RNA jedoch nicht im mitgelieferten RNase-freien Wasser, sondern in 50 µl DEPC-(Diethylpyrocarbonat) Wasser eluiert. Um hauptsächlich epitheliales Gewebes zu erhalten, wurden die oberflächlichen Schichten der conchalen Schleimhaut vorsichtig von den darunter liegenden knorpeligen und knöchernen Trägerstrukturen abgekratzt. Anschließend wurde das im Buffer RLT (lysis buffer) des RNeasy^ Mini Kits befindliche Gewebe mit jeweils einer Bleikugel pro Probe in der Schwingmühle zwei Mal 60 Sekunden bei einer Frequenz von 15 Hz homogenisiert.

Die qualitative und quantitative RNA-Messung erfolgte mit dem Agilent Bioanalyzer der Agilent Technologies Deutschland GmbH, Waldbronn nach Herstellerprotokoll, wozu 1 µl RNA je Probe eingesetzt wurde. Zur Beurteilung der RNA-Qualität wurden die beiden ribosomalen Banden herangezogen, deren Verhältnis (28S rRNA : 18S rRNA) im Idealfall einer reinen und intakten RNA 2:1 ist. Die Schärfe der ribosomalen Banden wurde nicht für Qualitätsbeurteilung herangezogen.

Proben mit einer RNA-Konzentration > 60 ng/µl wurden für die nachfolgende RT-(Reverse Transkriptase) Reaktion verwendet, bei geringerer RNA-Ausbeute oder bei mangelnder Qualität wurde die RNA-Isolation wiederholt und die RNA erneut gemessen.

2.2.2.2 RT-Reaktion und RT-PCR

Die Umschreibung der RNA in cDNA wurde mit der Omniscript Reverse Transcriptase von Qiagen durchgeführt. Für die reverse Transkription wurde jeweils 1 µg RNA eingesetzt und mit der entsprechenden Menge DEPC-Wasser auf ein Volumen von 12,75 µl eingestellt. Anschließend wurde die RNA für 5 min bei 65°C denaturiert. Nach Herunterkühlen der Probe auf Raumtemperatur wurde der Reaktionsmix bestehend aus 2 µl 10 x RT-Puffer, 2 µl dNTP Mix (5 mM), 2 µl Random Hexamers (5 µM), 0,25 µl RNasin (5 µM) und 1 µl Omniscript Reverse Transcriptase hinzugegeben und die RT-Reaktion bei 37°C gestartet. Da bei Probe M-R 4 aufgrund der geringen RNA-Konzentration von nur 67 ng/µl bei Einsatz von 1 µg RNA das Volumen von 12,75 µl überschritten wurde, musste bei dieser Probe der 1,5-fache RT-Ansatz gewählt werden, d.h. die RNA wurde mittels DEPC-Wasser auf ein Volumen von 19,12 µl gebracht, die 1,5-fache Menge des genannten Reaktionsgemisches hinzugefügt und die Reaktion gestartet. Im Anschluss an die einstündige Inkubation bei 37°C, während der die RNA in cDNA umgeschrieben wurde, erfolgte

eine erneute Denaturierung bei 95°C für 5 min. Die entstandenen cDNA wurde bei –20°C aufbewahrt.

Unter Zugabe von 20 µl A. bidest. bzw. von 10 µl A. bidest. im Falle des 1,5-fachen RT-Ansatzes wurde die in der reversen Transkription gewonnene cDNA auf eine Konzentration von 25 ng/µl verdünnt und pro PCR-Ansatz jeweils 1 µl cDNA (25 ng) eingesetzt. Die PCR wurde mit der HotStar Taq DNA Polymerase von Qiagen durchgeführt. Zum PCR-Cocktail, bestehend aus jeweils 14,375 µl A. bidest., 2 µl 10x PCR Buffer, 0,5 µl dNTP Solution (10mM), 0,125 µl HotStar Taq Polymerase sowie 2 µl der jeweiligen 10 µM Primergebrauchslösung ( je 10 µl 5´ bzw. 3´ Primer auf 80 µl A. bidest.) wurden pro Ansatz 1 µl cDNA hinzugegeben und die Reaktion im Thermocycler für 15 min bei 95°C gestartet. Für die zyklische Amplifizierung wurden folgende Bedingungen gewählt:

Aktivierung der Polymerase 15 min bei 95°C, Denaturierung 45 s bei 95°C, Annealing 60 s mit primerspezifischen Temperaturen (siehe Anhang Seite VII bis VIII), Elongation 60 s bei 72°C. Je nach Oligomer wurden unterschiedliche Zyklenzahlen verwendet. Im Anschluss an den letzten Zyklus erfolgte stets eine Reaktion für 7 min bei 72°C sowie ein Herunterkühlen des Gerätes auf 4°C zur Konservierung der Proben.

Parallel zu den Proben wurden bei der PCR jeweils eine Leber- und eine Negativkontrolle mitgeführt. Bei der Leberkontrolle handelte es sich um cDNA, die aus RNA humaner Leberzellkulturen durch reverse Transkription gewonnen wurde. Leber wurde als Kontrolle verwendet, da es sich bei der Leber um dasjenige Organ handelt, in dem die meisten Cytochrom P450 Monooxygenasen exprimiert sind. Nicht in der Leber exprimiert sind dagegen die Cytochrome 2A13 (Koskela et al., 1999; Su et al., 2000), 2F1 (Carr et al., 2003; Chen et al., 2002; Ding and Kaminsky, 2002, Nishimura et al., 2003), 2S1 (Rylander et al., 2001), 3A5 (Hukkanen et al., 2003), 4B1 (Nhamburo et al., 1989; Nishimura et al., 2003) sowie die Enzyme FMO2 (Dolphin et al., 1998) und UGT 2A1 Jedlitschky et al., 1999). Aus methodischer Sicht wurde damit in Kauf genommen, dass nicht bei allen untersuchten Genen in der Leberkontrolle RT-PCR Amplifikate nachgewiesen werden konnten. Bei der Negativkontrolle wurde anstelle der cDNA 1 µl A. bidest.

eingesetzt.

2.2.2.3 Linearitätsnachweis

Um den linearen Amplifikationsabschnitt zu gewährleisten, erfolgte vor der eigentlichen PCR für jeden Primer eine Primereinstellung mit einem cDNA-Mix aller Proben, welcher pro Oligomer bei 30, 33, 36 und 39 Zyklen getestet wurde. Beispielhaft sind nachfolgend die Linearitäten einiger Primer graphisch dargestellt.

Abbildung 9: Linearitätsnachweis für die Primer CYP 4B1, UGT 2A1, FMO 2, FMO 3, PPAR α und PPAR γ.

Dargestellt sind die an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte bei jeweils 30, 33, 36 und 39 Amplifikationszyklen.

CYP 4B1

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte

y = 11013x - 14255 R² = 0,9975

2.2.2.4 Auswertung der Amplifikate

Zur amplifizierten cDNA wurden 6 µl 6x DNA-loading buffer – bestehend aus 40 mg Bromphenolblau, 20 mg Xylencyanol, 100,64 g Glycerin ad 200 ml A. bidest. - hinzugegeben und je Probe 10 µl in eine Kammer auf einem 1,5%igen Agarosegel (in 100 ml 1x TAE-Puffer, versetzt mit 1 µl Ethidiumbromid) aufgetragen. Der Größenkontrolle diente dabei der in die jeweils erste Kammer gegebene DNA-Molekulargewichtsmarker (nachfolgend Ladder genannt). Nach 45-minütiger Auftrennung der cDNA bei 120 V in der Elektrophoresekammer erfolgte die Darstellung mittels UV-Licht an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA). Durch die Verwendung spezifischer Primer ausreichender Länge und die Überprüfung der erwarteten bp-Länge konnten die Amplifikate ausreichend verifiziert werden. Eine eigenständige Verifizierung in Form einer Sequenzierung oder eines Restriktionsenzymverdaus wurde nicht durchgeführt.

Für die Auswertung wurden die Bandenstärken der PCR-Produkte der zu untersuchenden Gene mit der 1D-Image Analysis Software für Windows Version 3.5.3B geldensitrometrisch ermittelt und die Mittelwerte sowie Standardabweichungen aller Kandidatengene für die Raucher und die Nicht-Raucher, sowie die männlichen und weiblichen Patienten berechnet. Die statistische Signifikanzanalyse wurde mittels Mathematica^4.2 der Wolfram Research, Inc. (www.wolfram.com) durchgeführt, wobei das Programmpaket „Statistics´HypothesisTests´“ mit dem Programm

„MeanDifferenceTest“ und der Option TwoSided->True zur Anwendung kam. Voraussetzung für die Anwendbarkeit dieses Tests ist das Vorliegen einer Normalverteilung, was vorab mit dem Shapiro-Wilk-Test gesondert überprüft wurde.

Gemäß SOP wurde pro Patient und Primer eine RT-PCR durchgeführt, weshalb weder ein Intra-, noch ein Inter-Assay Variationskoeffizient angegeben werden kann.