Metabolismusuntersuchungen

Die Inkubationsexperimente wurden in den Laboren T2.06, T2.07, T2.08 sowie T2.09 des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt.

2.2.4.1 Metabolismus von Loteprednol-Etabonat (LE)

Um die Verstoffwechselung von Loteprednol-Etabonat, dem ersten Vertreter der sog. Soft Steroide (Szelenyi and Pahl, 2002), zu untersuchen, wurde ¹⁴C-Loteprednol-Etabonat als Substrat verwendet und das entstehende Metabolitenprofil mittels Radio-HPLC bestimmt. Die Messung des Loteprednol-Etabonats und seiner Hauptmetaboliten wurde dabei durch Frau Diplom-Chemikerin Qiong Luo am Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt.

Abbildung 11: Strukturformel von Loteprednol-Etabonat (LE), dem ersten Vertreter der sog. Soft Steroide.

[aus: Bodor N, Recent advances in retrometabolic design approaches. J. Control. Release, 62: 209-222, 1999.]

2.2.4.1.1 1.Versuchsabschnitt: Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten

Im ersten Versuchsabschnitt erfolgten die Inkubationen der einzelnen mikrosomalen Nasenmuschelpools sowie der mitgeführten Negativ- (nur Puffer und Substrat) und Positivkontrollen bei 60 und/oder 120 min (siehe Abbildung 10). Die Versuche wurden dabei in zwei Versuchsserien aufgeteilt, wobei in der ersten Serie Rattenlebermikrosomen, in der zweiten humane Lebermikrosomen als Positivkontrolle verwendet wurden. Die konzentrierte Mikrosomensuspension wurde mit 0,1 M TRIS-Puffer auf 1 mg mikrosomales Protein / ml eingestellt und mit 1 mM β -NADPH versetzt. Zum Start der Reaktion wurde je Ansatz Loteprednol-Etabonat (25 µM) mit einer Aktivität von 1 µCi/ml hinzugegeben und die Reaktionsansätze im Wasserbad bei 37°C 60 bzw. 120 min inkubiert. Im Anschluss wurden die Proben für 5 min bei 8.000 Upm und 4°C zentrifugiert und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –80°C schockgefroren.

Die Metaboliten wurden durch Festphasenextraktion nach folgender Methode gewonnen: Zunächst wurden die Kartuschen (Waters Oasis HLB 3cc (60 mg) Extraction Cartridges der Firma Waters Corporation, USA) mit 3 ml Ethanol und 2 ml A. bidest. konditioniert, dann die Proben aufgetragen.

Nach aufeinanderfolgenden Waschschritten mit 1 ml Ethanol (15%), 1 ml A. bidest. und 1 ml Ethylacetat/Heptan (2:98) sowie Trocknen der Säule erfolgte die Elution mit 3 ml Ethylacetat/Heptan (35:65) und 1 ml Ethylacetat. Anschließend wurde das Eluat unter Stickstoffstrom bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Trocknung eingedampft und das erhaltene Extrakt in 40 µl mobiler Phase – bestehend aus Methanol und Essigsäure (0,5%, pH 3) im Verhältnis 62:38 – aufgenommen.

Bei einem Injektionsvolumen von 10 µl und einer Flussrate von 0,3 ml / min wurden die Metaboliten auf einer Spherisorb ODS-2-Säule (250 x 4 mm, Partikelgröße 3 µm, Latek, Eppelheim) bei 25°C chromatographisch aufgetrennt. Die Trennung der Metaboliten erfolgte mit folgendem Gradienten der mobilen Phase:

I. 0-9 min mit 62% Methanol, 38 % Essigsäure (0,5%, pH 3) II. 9-16 min mit 74% Methanol, 26 % Essigsäure (0,5%, pH 3) III. 16-39 min mit 74% Methanol, 26 % Essigsäure (0,5%, pH 3) IV. 39-43 min mit 62% Methanol, 38 % Essigsäure (0,5%, pH 3) V. 43-55 min mit 62% Methanol, 38 % Essigsäure (0,5%, pH 3)

Der Detektion diente ein Flow Scintillation Analyzer 500TR Series der Firma Packard BioScience Company, USA.

2.2.4.1.2 2. Versuchsabschnitt: Inkubation mit und ohne Glucuronidase-Zusatz

Durch zusätzlichen Glucuronidase-Verdau können Glucuronide nachgewiesen werden. Aus diesem Grund wurden die Proben in doppelter Menge angesetzt, im Anschluss an die LE-Inkubation gesplittet und die eine Hälfte mit, die andere Hälfte ohne Glucuronidase behandelt. Parallel zu den Organpools wurden zwei Positiv- (humane Lebermikrosomen) und zwei Negativkontrollen (nur Puffer und Substrat) mitgeführt (jeweils mit und ohne Glucuronidase-Zusatz).

Auch hier wurde – mit Ausnahme von Pool 15 - der mikrosomale Proteingehalt mit 0,1 M TRIS-Stock auf 1 mg / ml eingestellt und 1 mM β-NADPH zugesetzt. Bei Pool 15 musste die Proteinkonzentration aufgrund der geringen Proteinausbeute auf 0,5 mg / ml halbiert werden. Nach Zugabe von 25 µM Loteprednol-Etabonat mit einer Aktivität von 1 µCi/ml wurden die Proben im Wasserbad bei 37°C 120 min inkubiert und anschließend 5 min bei 4°C und 8.000 Upm zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen, halbiert und eine Hälfte mit, die andere ohne β -Glucuronidase inkubiert. Die Aliquots erhielten hierzu das gleiche Volumen an Ammoniumacetatpuffer (200 mM, pH 4,5) unter Zugabe von 5 mg / ml β-Glucuronidase bzw. ohne β-Glucuronidase-Zusatz (Kontrollen) und wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.

Die Festphasenextraktion der Inkubate sowie die anschließende HPLC-Messung erfolgten wie unter 2.2.4.1.1 beschrieben. Vor dem HPLC-Auftrag wurden jeweils 5% des Probenvolumens abgenommen, mit je 4 ml Rotiszint^ versetzt, gemischt und die Radioaktivität des ¹⁴C-Isotops jeweils eine Minute als DPM (Desintegrations per Minute) im LS 6500 Multi-Purpos Scintillation Counter der Firma Beckmann Coulter, Palo Alto, USA gemessen und für die Berechnung der Wiederfindung eingesetzt.

2.2.4.2 Testosteron-Metabolismus

Testosteron wird von unterschiedlichen CYP-Isoformen stereo- und regioselektiv hydroxyliert und liefert auf diese Weise Informationen über die Aktivität einzelner Isozyme. Pro Ansatz wurden 50 µM Testosteron eingesetzt. Zusätzlich wurde eine Negativ- (nur Puffer und Substrat) und eine Positivkontrolle (humane Lebermikrosomen) mitgeführt. Der mikrosomale Proteingehalt wurde mit 0,1 M TRIS-Stock auf 0,5 mg / ml eingestellt und die Inkubation unter Zusatz von 1 mM β -NADPH bei 37°C im Wasserbad durchgeführt. Nach 120 min wurden die Proben für 5 min bei 8.000 Upm und 4°C zentrifugiert und die Überstände und Pellets bei –80°C schockgefroren.

Von den Überständen wurden 900 µl abgenommen, mit jeweils 100 µl 2-Propanol, 5 ml Ethylacetat sowie 1 µg 11-α-Hydroxyprogesteron als internem Standard versetzt und auf dem Rotoshake 20 min bei Raumtemperatur extrahiert. Zur Trennung der Phasen wurden die Proben 20 min bei Raumtemperatur und 2.200 Upm zentrifugiert und die obere Ethylacetat-Phase mit den darin gelösten Metaboliten unter Stickstoffstrom eingedampft. Zur HPLC-Messung wurden die Extrakte in je 100 µl mobiler Phase (Wasser / Methanol / Acetonitril, 60/25/15, v/v/v) aufgenommen, von denen jeweils 80 µl in das HPLC-System (Hewlett Packard HP Series 1100) injiziert wurden. Die mobile Phase wurde durch eine HP 1100 Quaternary Pump mit einer Flussrate von 1 ml / min durch das System gepumpt. Die chromatographische Auftrennung der Testosteronmetaboliten 6α -Hydroxytestosteron, 7α--Hydroxytestosteron, 6β-Hydroxytestosteron, 16α-Hydroxytestosteron, 2α-Hydroxytestosteron sowie Androstendion erfolgte auf einer C18-Nucleosil-Säule (250 x 4 mm, Partikelgröße 5 µm, Macherey-Nagel, Düren) bei einer Ofentemperatur von 30°C.

Der Trennung der Metaboliten diente folgender Gradient der mobilen Phase:

I. 0-12 min mit 60% Wasser, 25% Methanol, 15% Acetonitril;

II. 12-15 min mit 45% Wasser, 40% Methanol, 15% Acetonitril;

III. 15-27 min mit 45% Wasser, 45% Methanol, 10% Acetonitril;

IV. 27-32 min mit 40% Wasser, 30% Methanol, 30% Acetonitril;

V. 32-35 min mit 40% Wasser, 25% Methanol, 35% Acetonitril;

VI. 35-40 min mit 30% Wasser, 20% Methanol, 50% Acetonitril;

VII. 40-45 min mit 60% Wasser, 25% Methanol, 15% Acetonitril.

Die Detektion erfolgte bei 238 nm.

2.2.4.3 EROD-Aktivitäten

Ethoxyresorufin ist ein profluoreszierendes Substrat für CYP 1A1, dessen metabolische Umsetzung zu dem fluoreszierenden Resorufin gemessen werden kann. Hierzu wurde eine Ethoxyresorufin-Stammlösung in DMSO mit einer Konzentration von 1 mg / ml hergestellt und durch Zugabe zu den einzelnen Reaktionsansätzen auf die endgültige Konzentration von 10 µM verdünnt. Die konzentrierte Mikrosomensuspension der Proben und der Positivkontrolle wurde mit 0,1 M TRIS-Stock auf 0,5 mg mikrosomales Protein / ml eingestellt und mit 1 mM β-NADPH versetzt. Mikrosomen humaner Hepatozyten dienten dabei als Positivkontrolle. Die Inkubation erfolgte im Wasserbad bei 37°C.

Nach 120 min wurde die Reaktion mit 200 µl Acetonitril abgestoppt und die Proben 5 min bei 5.000 Upm zentrifugiert. Zur Bestimmung der Glucuronide wurden die Überstände halbiert und ein Aliquot

mit, das andere ohne Glucuronidase behandelt. Die Proben erhielten hierzu das gleiche Volumen an Ammoniumacetatpuffer (200 mM, pH 4,5) unter Zusatz von 5 mg / ml β-Glucuronidase bzw. ohne β-Glucuronidase-Zusatz (Kontrollen) und wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.

Das Dealkylierungsprodukt Resorufin wurde in dem Fluorometer VersaFluor (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) bei einer Excitationswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 585 nm unter Zusatz von je 500 µl Glycinpuffer und 1000 µl TRIS-Puffer pro Probe bzw. Kalibrierlösung gemessen. Zur Erstellung der Kalibriergerade wurde Resorufin in unterschiedlichen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 nM) in Ethanol gelöst (siehe Abbildung 12). Lagen die gemessenen Fluoreszenzwerte der Proben oberhalb des höchsten Wertes der Kalibriergerade, so wurden die Proben in einem Gemisch aus Acetatpuffer, Glycinpuffer und TRIS-Puffer (im Verhältnis 1:1:2) verdünnt und die Messung wiederholt. Bei der Berechnung der Konzentration wurde das Ergebnis mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor multipliziert.

Abbildung 12: Resorufin-Kalibriergerade zur Bestimmung des Resorufin-Gehaltes in nmol.

Resorufin-Kalibriergerade

3 40 95

220

346

473 y = 6,2509x - 27,578 599

R² = 0,9999

0 100 200 300 400 500 600 700

0 20 40 60 80 100 120

Resorufin-Gehalt [nmol]

Fluoreszenz