3. Ergebnisse
3.2 Proteinexpression
3.3.1 Metabolismus von Loteprednol-Etabonat (LE)
Die Radio-HPLC-Messung des Arzneistoffs Loteprednol- Etabonats und seiner Hauptmetaboliten wurde von Frau Diplom-Chemikerin Qiong Luo am Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt. Sämtliche Chromatogramme – getrennt dargestellt für die einzelnen Versuchseinheiten – sind im Anhang auf den Seiten L bis LX abgebildet.
Abbildung 27 zeigt die detektierten LE-Metaboliten mit der jeweiligen relativen Retentionszeit in Bezug zu Loteprednol- Etabonat sowie die durch MS-HPLC-Messung erhaltenen Daten zur Anzahl der Hydroxylgruppen, der Carbonylgruppen und der Doppelbindungen am Steroidring (Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003).
Metabolit Relative Retentionszeit
Anzahl der Hydroxylgruppen
Anzahl der Carbonylgruppen
Anzahl der Doppelbindungen
am Steroidring
M 1 0,29 3 1 2
M 2 0,32 2 1 2
M 3 0,49 2 1 1
M 4 0,55 2 1 2
M 5 0,62 2 1 1
M 7 0,71 2 1 1
M 8 0,77 1 2 2
M 13 0,95 1 1 2
LE 1,00 1 1 2
M 12 1,21 2 1 1
Abbildung 27: Nachgewiesene LE-Metaboliten, zugehörige relative Retentionszeiten sowie Anzahl der Hydroxylgruppen, der Carbonylgruppen und der Doppelbindungen am Steroidring.
[in Anlehnung an: Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003]
Abkürzungen: LE = Loteprednol-Etabonat; M = Metabolit.
3.3.1.1 Teil I: Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten
Die Ergebnisse hausinterner Wiederfindungsversuche durch LE-Inkubation von Rattenlebermikrosomen belegen, dass die durchschnittliche Wiederfindung nach der Festphasenextraktion 83,9 % betrug und deshalb als akzeptabel eingestuft wurde (Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003).
Die Inkubation menschlicher Nasenmuschelmikrosomen erfolgte im ersten Versuchsabschnitt bei unterschiedlichen Inkubationszeiten und wurden in zwei Versuc hserien durchgeführt.
Peaks ab 50 CPM (Counts per Minute) wurden integriert und als prozentualer Anteil an der Gesamtpeakfläche angegeben. Die prozentualen Peakflächen der verschiedenen Metaboliten und des Loteprednols sind in Abbildung 28 (1. Serie) und 29 bis 30 (2. Serie) dargestellt, die um die Negativkontrollen korrigierten Werte in den Abbildungen 31 (1. Serie) und 32 bis 33 (2. Serie).
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 1 (M-NR,
60 min)
Pool 2 (M-NR,
60 min)
Pool 4 (M-NR, 120 min)
Pool 5 (M-NR, 120 min)
Pool 7 (M-R, 120 min)
PK (60 min)
NK 1 (60 min)
NK 2 (120 min)
M 1 0.25 -- -- -- -- -- 0.25 -- --
M 2 0.31 -- -- -- -- -- 2.60 -- --
? 0.37 -- -- -- -- -- 2.55 -- --
M 3 0.50 -- 0.80 -- -- -- 7.19 0.70 0.69
M 5 0.59 -- 0.75 0.28 -- -- 38.4 0.74 0.43
M 8 0.78 2.36 10.9 2.89 8.05 3.06 11.8 6.24 8.90
M 13 0.93 0.72 1.54 0.63 1.14 0.81 1.21 0.32 0.36
14C-LE 1.00 96.9 86.0 96.2 90.8 96.1 35.6 92.0 89.6
M 12 1.21 -- -- -- -- -- 0.44 -- --
Abbildung 28: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.
Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 1. Serie: Inkubation bei 60 und 120 min. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als prozentuale Peakfläche bezogen auf die Gesamtpeakfläche jedes Chromatogramms.
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 4 (M-NR)
Pool 5 (M-NR)
Pool 6 (W-NR)
Pool 7 (M-R)
Pool 8 (W-R)
Pool 9 (M-NR)
Pool 10 (M-R)
Pool 11 (W-NR)
PK 1 NK 1
? 0.37 -- -- -- -- -- -- -- -- 0.29 --
M 3 0.50 -- -- -- -- -- -- -- -- 4.28 --
M 5 0.58 -- -- -- -- -- -- -- -- 27.6 --
M 8 0.77 0.98 1.36 2.62 1.47 1.33 1.82 1.64 1.91 1.67 2.52
M 13 0.95 -- -- -- -- -- -- -- -- 21.2 --
14C-LE 1.00 99.0 98.6 97.4 98.5 98.7 98.2 98.4 98.1 45.0 97.5
Abbildung 29: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.
Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 2. Serie: Inkubation bei 60 min. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als prozentuale Peakfläche bezogen auf die Gesamtpeakfläche jedes Chromatogramms.
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 2 (M-NR)
Pool 9 (M-NR)
Pool 10 (M-R)
Pool 11 (W-NR)
PK 2 NK 2
? 0.37 -- -- -- -- 0.26 --
M 3 0.50 -- -- -- -- 1.54 --
M 5 0.59 -- -- -- -- 20.7 --
M 8 0.78 2.74 2.06 2.14 6.77 2.44 6.77
M 13 0.95 -- -- -- -- 10.2 --
14C-LE 1.00 97.3 97.9 97.9 93.2 64.8 93.2
Abbildung 30: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.
Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 2. Serie: Inkubation bei 120 min. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als prozentuale Peakfläche bezogen auf die Gesamtpeakfläche jedes Chromatogramms.
Metabolit Relative
Abbildung 31: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.
Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 1. Serie: Inkubation bei 60 und 120 min. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als nachgewiesen oder nicht nachgewiesen, korrigiert um die jeweilige Negativkontrolle.
+ Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche > 25 % höher als die der Negativkontrolle
(+) Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche bis zu 25 % höher als die der Negativkontrolle Ο Metaboliten mit einer relativen Peakfläche ≤ Negativkontrolle
-- Metaboliten nicht nachgewiesen
? Nicht identifizierte Peaks (Metaboliten).
Metabolit Relative
Abbildung 32: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.
Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 2. Serie: Inkubation bei 60 min. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als nachgewiesen oder nicht nachgewiesen, korrigiert um die Negativkontrolle.
Glossar siehe Abbildung 31.
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 2 (M-NR)
Pool 9 (M-NR)
Pool 10 (M-R)
Pool 11 (W-NR)
PK 2
? 0.37 -- -- -- -- +
M 3 0.50 -- -- -- -- +
M 5 0.59 -- -- -- -- +
M 8 0.78 Ο Ο Ο Ο Ο
M 13 0.95 -- -- -- -- +
14C-LE 1.00 + + + + +
Abbildung 33: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.
Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 2. Serie: Inkubation bei 120 min. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als nachgewiesen oder nicht nachgewiesen, korrigiert um die Negativkontrolle.
Glossar siehe Abbildung 31.
Aufgrund ihrer hohen metabolischen Aktivität wurden Lebermikrosomen als Positivkontrolle verwendet. In der Positivkontrolle der ersten Serie (Rattenlebermikrosomen) wurden die Metaboliten M 1, M 2, M 3, M 5, M 8, M 13 und M 12, in denen der zweiten Serie (humane Lebermikrosomen) die Metaboliten M 3, M 5 und M 13 detektiert. Darüber hinaus wurde in den Positivkontrollen beider Versuchsserien ein bisher nicht identifizierter Metabolit (M ?) mit einer relativen Retentionszeit von 0,37 nachgewiesen.
Im Gegensatz zu den Positivkontrollen konnten in den Inkubaten mit nasalen Mikrosomen nur wenige Metaboliten in nur einigen Proben und in geringen Mengen nachgewiesen werden. So wurden in Pool 2 (M-NR, 60 min Inkubation) kleine Mengen der Metaboliten M 3, M 5 und M 8 sowie in Pool 6 (W-NR, 60 min Inkubation) kleine Mengen des Metaboliten M 8 detektiert. In beiden Fällen lag die Ausbeute der gemessenen Metaboliten nur bis zu 25 % höher als die der Negativkontrolle. In allen Proben der ersten Versuchsserie wurden zudem geringe Mengen des Metaboliten M 13 gefunden. Aufgrund der geringen Probenanzahl mit detektierbaren Metaboliten ist jedoch keine Aussage über den Einfluss von Inkubationszeit, Geschlecht oder Raucherstatus auf die metabolische Aktivität zu treffen.
Betrachtet man schließlich die prozentualen Anteile des verbleibenden Loteprednols an der Gesamtpeakfläche bei den Proben und den zugehörigen Kontrollen, so zeigt sich, dass die durchschnittliche Loteprednolfläche der Organpools (Serie 1: 93,2 %; Serie 2: 98,4 % bei 60 min Inkubation und 96,6 % bei 120 min Inkubation) größer als die der jeweiligen Negativkontrolle (Serie 1: 90,8 %; Serie 2: 97,5 % bei 60 min Inkubation und 93,2 % bei 120 min Inkubation) ist, die Loteprednolfläche der Positivkontrollen (Serie 1: 35 %; Serie 2: 45 % bei 60 min Inkubation und 64,8 % bei 120 min Inkubation) jedoch deutlich kleiner als die der Negativkontrollen ist (siehe Abbildung 34).
Abbildung 34: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 1.
Versuchsabschnitt (unterschiedliche Inkubationszeiten), 1. und 2. Serie. Loteprednolpeakfläche der Negativ- und Positivkontrolle sowie der jeweiligen Organpools in % der Gesamtpeakfläche.
1. Versuchsabschnitt: Serie 1
0
NK PK 5 Organpools
Proben
LE-Peakfläche ( % )
1. Versuchsabschnitt: Serie 2 60 min Inkubation
NK PK 8 Organpools
Proben
LE-Peakfläche ( % )
1. Versuchsabschnitt: Serie 2 120 min Inkubation
NK PK 4 Organpools
Proben
LE-Peakfläche ( % )
1. Versuchsabschnitt: Serie 1
0
NK PK 5 Organpools
Proben
LE-Peakfläche ( % )
1. Versuchsabschnitt: Serie 2 60 min Inkubation
NK PK 8 Organpools
Proben
LE-Peakfläche ( % )
1. Versuchsabschnitt: Serie 2 120 min Inkubation
NK PK 4 Organpools
Proben
LE-Peakfläche ( % )
3.3.1.2 Teil II: Inkubation mit und ohne Glucuronidase-Zusatz
Die in diesem Versuchsabschnitt durchgeführten Wiederfindungsversuche durch Messung der Gesamtradioaktivität vor und nach der Festphasenextraktion (siehe Abbildung 35) ergaben eine durchschnittliche Wiederfindung nach der Festphasenextraktion von 84,5 % für die Proben ohne Glucuronidase- Zusatz und von 84,1 % für die Proben mit Glucuronidase-Zusatz.
Damit ist die Wiederfindung mit jener der hausinternen Studie (83,9 % für Proben ohne Glucuronidase-Zusatz, siehe Abschnitt 3.3.1.1) vergleichbar.
Abbildung 35: Gesamtradioaktivität der Kontrollen und der Organpools, dargestellt als DPM (Desintegrations per Minute), gemessen am LS 6500 Multi-Purpos Scintillation Counter der Firma Beckmann Coulter, Palo Alto, USA. Die oberen beiden Grafiken (jeweils ohne und mit Glucuronidase-Zusatz) zeigen die Gesamtradioaktivität vor der SPE (solid phase extraction), die unteren beiden nach der SPE.
Gesamtradioaktivität vor SPE
Im zweiten Versuchsabschnitt erfolgte die LE-Inkubation menschlicher nasaler Mikrosomen bei 120 min mit und ohne Glucuronidase-Zusatz. Auch hier wurden Peaks ab 50 CPM (Counts per Minute) integriert und als prozentualer Anteil an der Gesamtpeakfläche dargestellt (siehe Abbildungen 36 bis 39).
Als Positivkontrolle dienten - wie in der 2. Serie des ersten Versuchsabschnittes - humane Lebermikrosomen, bei denen in diesem Versuchsabschnitt jedoch zusätzlich zu den Metaboliten M 3, M 5, M 13 und dem bisher nicht identifizierten Metaboliten (M ?) mit einer relativen Retentionszeit von 0,37 des ersten Versuchsabschnittes der Metabolit M 7 sowie in Spuren der Metabolit M 8 nachgewiesen werden konnten.
Bei allen fünf untersuchten Organpools war der Metabolit M 8 unter Zusatz des Enzyms β -Glucuronidase deutlich gegenüber der Negativkontrolle erhöht. Ohne -Glucuronidase-Zusatz hingegen lag M 8 unterhalb der Negativkontrolle, mit Ausnahme von Pool 15 (W-R), bei dem M 8 in dem Bereich bis zu 25 % oberhalb der Negativkontrolle zu finden war. M 8 der Positivkontrolle befand sich ohne Glucuronidase-Zusatz ebenfalls unterhalb der Negativkontrolle, mit Glucuronidase-Zusatz im Bereich bis zu 25 % oberhalb der Negativkontrolle. Unter Glucuronidase-Zusatz wurde bei Pool 15 (W-R) ein weiterer Metabolit detektiert, der mit einer relativen Retentionszeit von 0,19 bislang noch nicht identifiziert wurde und der bei keiner der anderen Proben zu finden war.
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 12 (M-NR)
Pool 13 (M-R)
Pool 14 (W-NR)
Pool 15 (W-R)
Pool 16 (W-?)
PK NK
? 0.19 -- -- -- -- -- -- --
? 0.37 -- -- -- -- -- 4.9 --
M 3 0.49 -- -- -- -- -- 1.4 --
M 4 0.57 -- -- -- -- -- 22.2 --
M 7 0.74 -- -- -- -- -- 2.3 --
M 8 0.78 31.8 32.0 32.7 35.2 32.9 17.5 32.4
M 13 0.93 1.0 0.9 0.9 1.8 2.1 7.5 5.3
14C-LE 1.00 67.2 67.1 66.4 62.9 65.0 44.1 62.3
Abbildung 36: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 2.
Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) ohne Glucuronidase-Zusatz. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als prozentuale Peakfläche bezogen auf die Gesamtpeakfläche jedes Chromatogramms.
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 12 (M-NR)
Pool 13 (M-R)
Pool 14 (W-NR)
Pool 15 (W-R)
Pool 16 (W-?)
PK NK
? 0.19 -- -- -- 6.9 -- -- --
? 0.37 -- -- -- -- -- 3.5 --
M 3 0.49 -- -- -- -- -- 0.9 --
M 5 0.57 -- -- -- -- -- 21.5 --
M 7 0.74 -- -- -- -- -- 1.7 --
M 8 0.78 27.6 28.2 34.4 28.5 33.0 18.5 16.6
M 13 0.95 -- -- -- -- -- 7.1 --
14C-LE 1.00 72.4 71.8 65.6 64.6 67.0 46.9 83.4
Abbildung 37: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 2.
Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) mit Glucuronidase-Zusatz . Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als prozentuale Peakfläche bezogen auf die Gesamtpeakfläche jedes Chromatogramms.
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 12 (M-NR)
Pool 13 (M-R)
Pool 14 (W-NR)
Pool 15 (W-R)
Pool 16 (W-?)
PK
? 0.19 -- -- -- -- -- --
? 0.37 -- -- -- -- -- +
M 3 0.49 -- -- -- -- -- +
M 5 0.57 -- -- -- -- -- +
M 7 0.74 -- -- -- -- -- +
M 8 0.78 Ο Ο Ο (+) Ο Ο
M 13 0.93 Ο Ο Ο Ο Ο +
14C-LE 1.00 + + + + + +
Abbildung 38: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 2.
Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) ohne Glucuronidase-Zusatz. Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als nachgewiesen oder nicht nachgewiesen, korrigiert um die Negativkontrolle.
+ Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche > 25 % höher als die der Negativkontrolle
(+) Metabolit nachgewiesen, prozentuale Peakfläche bis zu 25 % höher als die der Negativkontrolle Ο Metaboliten mit einer relativen Peakfläche ≤ Negativkontrolle
-- Metaboliten nicht nachgewiesen
? Nicht identifizierte Peaks (Metaboliten).
Metabolit Relative
Retentions-zeit
Pool 12 (M-NR)
Pool 13 (M-R)
Pool 14 (W-NR)
Pool 15 (W-R)
Pool 16 (W-?)
PK
? 0.19 -- -- -- + -- --
? 0.37 -- -- -- -- -- +
M 3 0.49 -- -- -- -- -- +
M 5 0.57 -- -- -- -- -- +
M 7 0.74 -- -- -- -- -- +
M 8 0.78 + + + + + (+)
M 13 0.95 -- -- -- -- -- +
14C-LE 1.00 + + + + + +
Abbildung 39: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 2.
Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz) mit Glucuronidase-Zusatz . Radio-HPLC-Ergebnisse dargestellt als nachgewiesen oder nicht nachgewiesen, korrigiert um die Negativkontrolle.
Glossar siehe Abbildung 38.
Hinsichtlich der prozentualen Anteile des verbleibenden Loteprednols an der Gesamtpeakfläche fällt auf, dass sowohl die Werte für die Organpools, als auch die Werte für die beiden Negativkontrollen deutlich unterhalb jener des ersten Versuchsabschnittes liegen.
Dagegen sind die verbleibenden Loteprednolgehalte der beiden Positivkontrollen mit jenen des ersten Versuchsabschnittes vergleichbar. Während der verbleibende Loteprednolanteil der Positivkontrollen (44,1 % und 46,9 %) deutlich unter jenem der Negativkontrollen (62,3 % und 83,4 %, jeweils ohne und mit Glucuronidase-Zusatz) liegt, ist bei den Proben ein Unterschied hinsichtlich des Glucuronidase-Zusatzes zu beobachten (siehe Abbildung 40). So ist die durchschnittliche LE-Peakfläche der Organpools ohne Glucuronidase-Zusatz (65,8 %) größer, mit Glucuronidase-Zusatz (68,3 %) hingegen kleiner als die der Negativkontrollen (62,3 % bzw. 83,4 %). Auffallend sind jedoch die stark schwankenden Werte der beiden Negativkontrollen.
Abbildung 40: Metabolismus von Loteprednol-Etabonat durch humane nasale Mikrosomen, 2.
Versuchsabschnitt (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz). Loteprednolpeakfläche der Negativ- und Positivkontrolle sowie der jeweiligen Organpools in % der Gesamtpeakfläche.
2. Versuchsabschnitt:
NK PK 5 Organpools
Proben
NK PK 5 Organpools
Proben
NK PK 5 Organpools
Proben
NK PK 5 Organpools
Proben
LE-Peakfläche ( % )