Proteinexpressionsuntersuchungen

Die Experimente zur Untersuchung der Proteinexpression wurden innerhalb des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin in den Räumen T2.03, T2.05, T2.09 und T2.033

durchgeführt.

2.2.3.1 Herstellung der Pufferlösungen

KCl-Puffer 0,15 M: 11,18 g KCl ad 1 l A. bidest.

10x SDS-Laufpuffer 150g Tris 720g Glycin 50g SDS ad 5 l A. bidest.

1x SDS-Laufpuffer 100 ml 10x SDS-Laufpuffer 900 ml A. bidest.

10x TBS-Puffer 121g Tris 400g NaCl ad 5 l A. bidest.

mit 1 M HCl auf pH = 7,6 eingestellt 1x TBS-Puffer ohne Tween 100 ml 10x TBS-Puffer

900 ml A. bidest.

1x TBS-T 0,1% 1000 ml 1x TBS-Puffer ohne Tween 1 ml Tween^20

10x Transfer-Puffer 151,5g Tris 720g Glycin ad 5 l A. bidest.

1x Transfer-Puffer 100 ml 10x Transfer-Puffer 900 ml A. bidest.

pH = 8,3

TRIS-Stock 0,1 M: 6,35 g Trizma HCl 1,18 g Trizma Base ad 500 ml A. bidest.

mit 1 M HCl auf pH = 7,4 eingestellt

TRIS-Sucrose-Puffer: 42,79 g Sucrose 100 ml TRIS-Stock 0,93 g EDTA ad 500 ml A. bidest.

2.3.3.2 Isolation mikrosomaler Proteine durch Ultrazentrifugation

Aufgrund der geringen Gewebemengen mussten die Nasenmuscheln mehrerer Patienten gepoolt werden, um für die nachfolgenden proteinanalytischen und metabolischen Untersuchungen ausreichende Mengen an mikrosomalem Protein zu erhalten. So wurden insgesamt 15 Pools aus den Nasenmuscheln von drei bis vierzehn Patienten gebildet (Patientendaten zu den einzelnen Pools siehe Anhang Seite II bis VI). Eine Übersicht über Art und nachfolgende Verwendung der mikrosomalen Pools gibt Abbildung 10.

Pool Art des Pools

Anzahl der Patienten

WB LE I LE II Testost. EROD

60 min

120 min

mit Gluc.

ohne Gluc.

1 M-NR 5 X X ¹ - - X -

2 M-NR 5 - X ¹ X ² - - - -

4 M-NR 6 X X ² X ¹ - - X -

5 M-NR 6 - X ² X ¹ - - - X

6 W-NR 6 X X ² - - - X X

7 M-R 6 X X ² X ¹ - - - X

8 W-R 3 X X ² - - - - -

9 M-NR 14 X X ² X ² - - X X

10 M-R 6 X X ² X ² - - X X

11 W-NR 5 X X ² X ² - - - -

12 M-NR 10 - - - X X - -

13 M-R 7 - - - X X - -

14 W-NR 10 - - - X X - -

15 W-R 5 - - - X X - -

16 W-? 4 - - - X X - -

Abbildung 10: Art und Verwendung der mikrosomalen Pools

Abkürzungen: EROD = Ethoxyresorufin-O-deethylase; LE-I = Loteprednol-Etabonat-Metabolismus Teil I (verschiedene Inkubationszeiten) mit ¹ = 1. Versuchsserie und ² = 2. Versuchsserie; LE-II = Loteprednol-Etabonat-Metabolismus Teil II (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz); M = männlich; NR = Nicht-Raucher; R = Raucher;

Testost. = Testosteron-Metabolismus; W = weiblich; WB = Western blot.

Nach Bestimmung der Poolgewichte wurden die jeweiligen Organpools in der dreifachen Menge 0,15 M KCl-Puffer mit einer Schere zerkleinert und anschließend mit dem Ultra Turrax^ homogenisiert. Das gewonnene Homogenat wurde in ein Polycarbonatröhrchen gefüllt, mit 0,15 M KCl-Puffer aufgefüllt und für 30 min bei 15.000 Upm und 4°C in der Ultrazentrifuge Optima LE-80K (Beckmann Coulter, Palo Alto, USA) zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und für 60 min bei 55.000 Upm und 4°C erneut zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in einigen Millilitern 0,15 M KCl-Puffer aufgenommen und im Gewebehomogenisator Dounce (7ml) homogenisiert. Die erhaltene Suspension wurde nach Auffüllen mit 0,15 M KCl-Puffer nochmals für 60 min bei 55.000 Upm und 4°C zentrifugiert und das gewonnene Pellet in 500 µl TRIS-Sucrose-Puffer aufgenommen und im Gewebehomogenisator Dounce (1ml) homogenisiert. 10 µl wurden für die anschließende Proteinbestimmung eingesetzt, der Rest bei –80°C eingefroren.

2.2.3.3 Proteinbestimmung nach Smith et al. (1985)

Die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes wurde nach der Methode von Smith et al. (1985) durchgeführt. Hierzu wurde von jedem Pool eine Verdünnungsreihe (1:100 bis 1:1000) hergestellt.

Zur Quantifizierung des Proteingehaltes wurde vor jeder Probenmessung eine Kalibriergerade aus bovinem Serumalbumin (BSA) erstellt. Alle Messungen erfolgten als Doppelbestimmungen und wurden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt, wobei pro Kavität 100 µl Probe und 100 µl frisch angesetzte Färbelösung - bestehend aus 1 Teil 4% CuSO4 und 49 Teilen Bicinchoninic Acid - eingesetzt wurde. Zur Beschleunigung der Reaktion wurde die Mikrotiterplatte 30 min bei 60°C im Wärmeschrank inkubiert. Die Messung des Proteingehaltes erfolgte bei 550 nm mittels eines ELISA Reader Dynatech MR5000 (Dynatech, Ohio, USA).

2.3.3.4 Proteinexpression ausgewählter CYPs

2.3.3.4.1 Auftrennung der Proteine mittels 1D-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde nach der Methode von Laemmli (1970) durchgeführt. Die mikrosomalen Proteine von acht Pools wurden entsprechend ihres Molekulargewichtes mittels 1D-SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und durch Inkubation mit einem Primär- und Sekundärantikörper die Cytochrome 1A1, 2A, 2B6, 2E1, 3A4 und 3A5 nachgewiesen.

Pro Pool wurden 45 µg mikrosomales Protein auf ein Volumen von 12 µl eingestellt, mit je 4 µl Roti^ -Load1 4x-Konz. versetzt und 5 min bei 95°C inkubiert. Auf die erste Spur des 12%igen Polyacrylamidgeles wurde ein Marker – bestehend aus 5 µl Precision blue protein standard prestained und 0,5 µl Chemicon ECL – aufgetragen, auf die zweite Spur eine Positivkontrolle (humane Lebermikrosomen). Zur besseren Auflösung der Proteinbanden wurden die Proben auf ein Sammelgel aufgetragen, welches sich über dem eigentlichen Trenngel befand. Das Trenngel bestand aus 3 ml 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid, 1,875 ml 1,5 M Tris pH 8,8, 2,55 ml A. bidest. und 37,5 µl 20% SDS, das Sammelgel aus 850 µl 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid, 625 µl 1 M Tris pH 6,8, 3,47 ml A. bidest. und 25 µl 20% SDS. Zum Start der Polymerisierungsreaktion wurde dem Trenngel 75 µl 10% Ammoniumperoxodisulfat und 7,5 µl TEMED, dem Sammelgel 50 µl 10%

Ammoniumperoxodisulfat und 5 µl TEMED hinzugegeben. Die Elektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur in einer Minigel-Elektrophoresekammer der Firma Biometra^ unter Zugabe von 1x SDS-Laufpuffer. Anfänglich betrug die Stromstärke 20 mA pro Gel, nach Erreichen des Trenngels wurde sie für etwa 60 bis 90 min auf 25 mA pro Gel erhöht.

2.3.3.4.2 Darstellung der Proteine mittels Western blot

Direkt im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel aus der Elektrophoresekammer entnommen und 10 min in 1x Transfer-Puffer getränkt. Parallel dazu wurde die PVDF-Membran 15 s in Methanol aktiviert, 2 min in A. bidest. gewässert und ebenfalls 10 min in 1x Transfer-Puffer getränkt. Nach Beschicken der Kassette und Einsetzen der Kassette in die Blotkammer erfolgte das Blotten über Nacht bei 90 mA und 4°C auf einem Magnetrührer Heidolph MR3000 der Firma Heidolph Instruments GmbH & Co.KG.

Zur Sättigung freier, unspezifischer Bindungsstellen wurde die PVDF-Membran für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (Roto-Shake Genie der Firma Scientific Industries, Inc.) mit Blocking-Reagenz – bestehend aus neun Teilen 1x TBS-Puffer ohne Tween und einem Teil Rotiblock, 10x Konzentrat – versetzt. Nach drei fünfminütigen Waschschritten mit Waschpuffer (1x TBS-T 0,1%) wurde die Inkubation mit dem Primärantikörper, welcher in 10 ml Diluent – bestehend aus 99 Teilen 1x TBS-Puffer ohne Tween und einem Teil Rotiblock, 10x Konzentrat – verdünnt wurde (Angaben zu den verwendeten Primär- und Sekundärangaben und deren Verdünnungen siehe Anhang Seite IX), für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler durchgeführt. Nach erneutem Waschen folgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper in analoger Weise. Anschließend wurde die PVDF-Membran wieder gewaschen und in frisch angesetztem Entwicklungsreagenz 1 min bei Raumtemperatur geschwenkt. Nach etwa 5 min erfolgte die Exposition an der Kodak Digital

Science Image Station 440 CF (Kodak, USA). Die Lumineszenz wurde nach 1 und nach 10 min Expositionsdauer gemessen.