2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Probenmaterial
humane Nasenmuscheln Friederiken-Stift, Hannover;
Medizinische Hochschule Hannover
2.1.2 Chemikalien
2.1.2.1 Reagentien für die Untersuchung der Genexpression
Agarose NEEO Ultra-Qualität, Rotigarose für Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe die Elektrophorese (Code 2267-3; Charge 43151566)
Bromphenolblau Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code B-8026; Charge 18H3630)
Custom Primers, 50nM, entsalzt Invitrogen GmbH, Karlsruhe (Primerliste einschließlich PCR-Bedingungen siehe Anhang Seite VII bis VIII)
DNA ladder, 100bp Invitrogen GmbH, Karlsruhe
(Code 15628-050; Charge 1131233)
DNA Typing Grade 50X TAE Buffer Life Technologies, Paisley, Schottland (Code 24710-030; Charge 1101351)
dNTP Mix (5mM für RT) Qiagen, Hilden
(Code 1010355; Charge 10921673)
dNTP Solution 100mM, PCR grade MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot (Code R0181; Charge 0273)
Ethanol 96% Riedel-de Haën Sigma-Aldrich, Seelze (Code 24105; Charge 13330)
Ethidiumbromidlösung 10 mg/ml Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code E-1510; Charge 117H8509)
Glycerin Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 3783.2; Charge 04252672)
HotStar Taq, 5 units/µl Qiagen, Hilden (Code 1007837; Charge 11239460)
2-Mercaptoethanol Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code M-7522; Charge 105F-02785)
Omniscript Reverse Transcriptase 4 units/µl Qiagen, Hilden (Code 1010890; Charge 11229931)
PCR Buffer, 10x Qiagen, Hilden
(Code 1005479; Charge 11239890)
Random Hexamers Promega, Mannheim
(Code C118A; Charge 13232211)
RNA 6000 Nano LabChip Agilent Technologies Deutschland GmbH, (Code 5065-4476; Charge EC18BK02) Waldbronn
RNA 6000 Nano Reagents & Supplies Agilent Technologies Deutschland GmbH, (Code 5065-4476; Charge EC21RK02) Waldbronn
RNasin Ribonuclease Inhibitor 10 000 units Promega, Mannheim (Code N211B; Charge 13000713)
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden
(Code 74104; Charge 11234541)
10 x RT Buffer Qiagen, Hilden
(Code 1010883; Charge 10922292)
Xylencyanol Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code X-4126; Charge 117H3626)
2.1.2.2 Reagentien für die mikrosomalen Untersuchungen
Acetonitril Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 8825.2; Charge 20281)
30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code 3029.1; Charge 18254163)
11-α-Hydroxyprogesteron Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code H-5502; Charge 17H0285)
Ammoniumacetat Merck KG, Darmstadt
(Code 1.01116.0500; Charge A180816 932)
Ammoniumperoxodisulfat Merck KG, Darmstadt
(Code 1.01201.0100; Charge K27070601)
β-Glucuronidase (EC 3.2.1.31) Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code G-0751; Charge 120K1321)
β-NADPH, reduced form Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code N-1630; Charge 81K7067)
Bicinchoninic Acid Solution Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code B-9643; Charge 60K5300)
Bovine Serum Albumin Fraction V PAA Laboratories GmbH, Linz, (Code K41-001-100; Charge G16112-207) Österreich
Chemicon ECL Chemicon, Temecula, USA
(Code 2230; Charge 20020402)
Dimethylsulfoxid Merck KG, Darmstadt
(Code 1.02952.1000; Charge K30558552 220)
EDTA Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code E-5134; Charge 100K0284)
Essigsäure Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 6755.1; Charge 31150335)
Ethanol 96% Riedel-de Haën Sigma-Aldrich, Seelze (Code 24105; Charge 13330)
Ethoxyresorufin Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code E-3763; Charge 22K4012)
Ethyl Acetat Mallinckrodt Baker B.V., Holland
(Code 8037; Charge 9930110002)
Glycin Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 3908.2; Charge 49151490)
Heptan Fluka Chemie GmbH, Schweiz
(Code 51745; Charge 423800/1)
Kupfer-(II)-sulfat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code P023.1; Charge 44046989)
[4-14C] Loteprednol Etabonate Amersham pharmacia biotech,
(Code CFQ13089) Buckinghamshire, England
Loteprednol Etabonate VIATRIS GmbH & Co KG, Frankfurt (Code X-387; Charge 25)
Methanol Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 4627.1; Charge 15253746)
Natriumchlorid Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 3957.1; Charge 02146852)
Potassium Chloride Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code P-5404; Charge 87H06665)
Precision blue protein standard prestained Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Code 161-0372; Charge 91731)
Primärantikörper für Western blot
(Liste der verwendeten Primärantikörper siehe Anhang Seite IX)
2-Propanol Merck KG, Darmstadt
(Code 1.09634.2500; Charge K29036034 112)
Resorufin Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code R-3257; Charge 18H3639)
Roti-Block 10x Konzentrat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code A151.1; Charge 06148259)
Roti-Load1 4x Konzentrat Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code K929.1; Charge 27045406)
Rotiszinteco plus Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code 0016.2; Charge 40251611)
SDS ultra pure Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 2326.2; Charge 48046682)
Sekundärantikörper für Western blot Chemicon, Temecula, USA (Liste der verwendeten Sekundärantikörper siehe Anhang Seite IX)
Sodium hydroxide Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code S-5881; Charge 127H01821)
Sucrose Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code S-9378; Charge 100K0121)
TEMED p.a. Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 2367.1; Charge 06141122)
Testosteron Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code T1500; Charge 39H0638)
Tris Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 4855.2; Charge 50152286)
Trizma Base Sigma Chemical Company, St.Louis, USA
(Code T-1503; Charge 11K5424)
Trizma Hydrochloride Sigma Chemical Company, St.Louis, USA (Code T-3253; Charge 69H5435)
Tween20 Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe
(Code 9127.1; Charge 47046531)
Western Lightning Chemiluminescence PerkinElmer Life Sciences, Boston, USA Reagent Plus (Code NEL105; Charge 254753)
2.1.3 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies Deutschland GmbH,
(Serien-Nr. DE01727542) Waldbronn
Analysenwaage Sartorius MC210S Sartorius AG, Göttingen (Serien-Nr. 11410980)
Biometra Standard Power Pack P25 Biometra, Göttingen (Serien-Nr. 4111139)
BioRad PowerPac 200 Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 285BR04868)
BioRad PowerPac 300 Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 283BR09143)
BioRad Sub-CellGT Elektrophoresekammer Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 61S01069)
C18-Nucleosil-Säule (250 x 4 mm, Macherey-Nagel, Düren Partikelgröße 5 µm, Serien-Nr. 1106105)
Chirurgische Pinzette, 14,5 cm Medicalis, Garbsen Chirurgische Schere, gerade, spitz/spitz, 14,5 cm Medicalis, Garbsen ELISA Reader Dynatech MR5000 Dynatech, Ohio, USA (Serien-Nr. G3112)
Emission Filter 620/10 (615-625 nm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Code 1702426)
Excitation Filter 510/10 (505-515 nm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Code 1702423)
Filterpapier Merck KG, Darmstadt (Code 1001-931)
Flow Scintillation Analyzer 500TR Series Packard BioScience Company, USA (Serien-Nr. 421035)
Fluorometer VersaFluor Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 435 BR 0769)
Gelkammer Biometra Minigel-Twin Typ G42 Biometra, Göttingen (Serien-Nr. 1409129)
Gewebehomogenisator Dounce 7 ml und 1 ml Wheaton, USA
Glasplatte, ausgeschnitten Whatman Biometra, Göttingen (Code 010-003)
Glasplatte mit fixierten Spacern 0,6 mm Whatman Biometra, Göttingen (Code 010-002)
HPLC Series 1100 für Testosteronmetabolismus Hewlett Packard GmbH, Waldbronn [ Degasser G1322A (Serien-Nr. JP 73014117)
Quat Pump G1311A (Serien-Nr. DE 83104972) ALS G1313A (Serien-Nr. DE 82206896) Col Comp G1316A (Serien-Nr. DE 82207725) DAD G1315A (Serien-Nr. DE 90604736) ]
HPLC Series 1100 für Radio-HPLC Hewlett Packard GmbH, Waldbronn [ Degasser G1322A (Serien-Nr. JP 73014143)
Quat Pump G1311A (Serien-Nr. DE 83104953) ALS G1329A (Serien-Nr. DE 91603535) ALS Therm G1330A (Serien-Nr. DE 82203511) Col Comp G1316A (Serien-Nr. DE 82207724) VWD G1314A (Serien-Nr. JP 73797282) ]
Kamm 10-zähnig 0,6 mm für Minigel und Whatman Biometra, Göttingen Minigel-Twin (Code 010-016)
Klammern für Gelelektrophorese Whatman Biometra, Göttingen (Code 010-007)
Kodak Digital Science Image Station 440 CF Kodak, USA (Serien-Nr. 207102)
LS 6500 Multi-Purpos Scintillation Counter Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Serien-Nr. 7070019)
Magnetrührer Heidolph MR 3000 Heidolph Instruments GmbH & Co.KG,
(Serien-Nr. 030008262) Schwabach
Mahlkugeln Wolframcarbid 5 mm F. Kurt Retsch GmbH & Co KG, Haan (Code 05.368.0038)
Megafuge 2.0R Heraeus Kendro Laboratory Products, Osterode (Serien-Nr. 268322)
Mini Trans-Blot Elektrophoretic Transfer Cell Bio-Rad Laboratories GmbH, München (Serien-Nr. 37S/4382)
MS2 Minishaker IKA IKA Works, INC., Wilmington, USA (Serien-Nr. 03.059839)
Nunc-Immuno Plates NUNC GmbH & Co KG, Wiesbaden
(Code 442 404)
Polycarbonatröhrchen Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Code 355618; Charge 010115)
PVDF-Transfer-Membran NEN Life Science Products, Boston,
(Code NEF102; Charge 183321) USA
Rotilabo-Einsätze 100 µl Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe (Code C516.1; Charge 69752226AS7)
Rotor 70Ti Beckmann Coulter, Palo Alto, USA
(Serien-Nr. 01E 933)
Roto-Shake Genie Scientific Industries, Inc.,
(Serien-Nr. 1580) New York, USA
Schwingmühle Retsch MM 200 F. Kurt Retsch GmbH & Co KG, Haan (Serien-Nr. 200609018G)
Sigma Tischzentrifuge 1-15 Sigma Laborzentrifugen, Osterode (Serien-Nr. 83054)
Silikonabdichtung 1,0 mm für Minigel und Whatman Biometra, Göttingen Minigel-Twin (Code 010-005)
Spherisorb ODS-2-Säule (250 x 4 mm, Latek, Eppelheim Partikelgröße 3 µm, Serien-Nr. 9802010)
Test tube heater SHT 20 Stuart Scientific Co. Ltd., Surrey, England (Serien-Nr. 5051)
Thermocycler T3 Biometra, Göttingen
(Serien-Nr. 0904125, 0904126, 0904134)
Thermomixer compact Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,
(Serien-Nr. 5350 02163) Hamburg
Thermomixer comfort Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,
(Serien-Nr. 5355 03052) Hamburg
Trockeneis Kohlensäurewerk, Laatzen
Ultra Turrax® T8 IKA Labortechnik, Staufen
(Serien-Nr. 00.080400)
Ultrazentrifuge Optima LE-80K Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Serien-Nr. COL Ø 1C27)
Verschlüsse für Polycarbonatröhrchen Beckmann Coulter, Palo Alto, USA (Code 338824)
Waage BP 3100P Sartorius AG, Göttingen
(Serien-Nr. 11903531)
Wärmeschrank Typ UE 400 Memmert GmbH + CoKG, Schwabach (Serien-Nr. c498-0396)
Wasserbad Julabo SW21 Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach (Serien-Nr. 03904420519)
Waters Oasis HLB 3cc (60mg) Extraction Waters Corporation, USA Cartridges (Code WAT094226; Charge W2147J4)
White virgin PTFE septa, 8mm Agilent Technologies Deutschland GmbH,
(Code 5183-4434) Waldbronn
Zentrifuge Mikro 22R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen (Serien-Nr. 0001096-03-00)
Zentrifugenröhrchen 15 ml Sarstedt, Nümbrecht (Code 62.554.502; Charge 2182 1603)
Zentrifugenröhrchen 50 ml Sarstedt, Nümbrecht (Code 62.547.254; Charge 2196 7023)
2.2 Methoden
2.2.1 Gewinnung und Transport des Probenmateriales
Respiratorische Nasenschleimhaut wurde von Patienten gewonnen, die sich aufgrund einer Muschelhyperplasie einer partiellen Turbinektomie der Concha nasalis inferior unterzogen hatten (Auflistung der Patienten einschließlich der Patientendaten siehe Anhang Seiten I bis VI). Die Personen wurden vor dem operativen Eingriff über das Projekt aufgeklärt und haben ihre Einwilligung für die Untersuchung erteilt.
Innerhalb von 10 – 15 Minuten nach ihrer operativen Entfernung wurden die Nasenmuscheln mittels Trockeneis schockgefroren und bei –80°C gelagert.
2.2.2 Genexpressionsuntersuchungen
Sämtliche Untersuchungen zur Genexpression erfolgten in den Laboren T2.09 und T2.023 des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin.
2.2.2.1 RNA-Isolation
Die RNA-Isolation aus der humanen respiratorischen Nasenschleimhaut wurde nach dem Protokoll des Herstellers des RNeasy Mini Kits von Qiagen durchgeführt. Abweichend vom Protokoll wurde die gewonnene RNA jedoch nicht im mitgelieferten RNase-freien Wasser, sondern in 50 µl DEPC-(Diethylpyrocarbonat) Wasser eluiert. Um hauptsächlich epitheliales Gewebes zu erhalten, wurden die oberflächlichen Schichten der conchalen Schleimhaut vorsichtig von den darunter liegenden knorpeligen und knöchernen Trägerstrukturen abgekratzt. Anschließend wurde das im Buffer RLT (lysis buffer) des RNeasy Mini Kits befindliche Gewebe mit jeweils einer Bleikugel pro Probe in der Schwingmühle zwei Mal 60 Sekunden bei einer Frequenz von 15 Hz homogenisiert.
Die qualitative und quantitative RNA-Messung erfolgte mit dem Agilent Bioanalyzer der Agilent Technologies Deutschland GmbH, Waldbronn nach Herstellerprotokoll, wozu 1 µl RNA je Probe eingesetzt wurde. Zur Beurteilung der RNA-Qualität wurden die beiden ribosomalen Banden herangezogen, deren Verhältnis (28S rRNA : 18S rRNA) im Idealfall einer reinen und intakten RNA 2:1 ist. Die Schärfe der ribosomalen Banden wurde nicht für Qualitätsbeurteilung herangezogen.
Proben mit einer RNA-Konzentration > 60 ng/µl wurden für die nachfolgende RT-(Reverse Transkriptase) Reaktion verwendet, bei geringerer RNA-Ausbeute oder bei mangelnder Qualität wurde die RNA-Isolation wiederholt und die RNA erneut gemessen.
2.2.2.2 RT-Reaktion und RT-PCR
Die Umschreibung der RNA in cDNA wurde mit der Omniscript Reverse Transcriptase von Qiagen durchgeführt. Für die reverse Transkription wurde jeweils 1 µg RNA eingesetzt und mit der entsprechenden Menge DEPC-Wasser auf ein Volumen von 12,75 µl eingestellt. Anschließend wurde die RNA für 5 min bei 65°C denaturiert. Nach Herunterkühlen der Probe auf Raumtemperatur wurde der Reaktionsmix bestehend aus 2 µl 10 x RT-Puffer, 2 µl dNTP Mix (5 mM), 2 µl Random Hexamers (5 µM), 0,25 µl RNasin (5 µM) und 1 µl Omniscript Reverse Transcriptase hinzugegeben und die RT-Reaktion bei 37°C gestartet. Da bei Probe M-R 4 aufgrund der geringen RNA-Konzentration von nur 67 ng/µl bei Einsatz von 1 µg RNA das Volumen von 12,75 µl überschritten wurde, musste bei dieser Probe der 1,5-fache RT-Ansatz gewählt werden, d.h. die RNA wurde mittels DEPC-Wasser auf ein Volumen von 19,12 µl gebracht, die 1,5-fache Menge des genannten Reaktionsgemisches hinzugefügt und die Reaktion gestartet. Im Anschluss an die einstündige Inkubation bei 37°C, während der die RNA in cDNA umgeschrieben wurde, erfolgte
eine erneute Denaturierung bei 95°C für 5 min. Die entstandenen cDNA wurde bei –20°C aufbewahrt.
Unter Zugabe von 20 µl A. bidest. bzw. von 10 µl A. bidest. im Falle des 1,5-fachen RT-Ansatzes wurde die in der reversen Transkription gewonnene cDNA auf eine Konzentration von 25 ng/µl verdünnt und pro PCR-Ansatz jeweils 1 µl cDNA (25 ng) eingesetzt. Die PCR wurde mit der HotStar Taq DNA Polymerase von Qiagen durchgeführt. Zum PCR-Cocktail, bestehend aus jeweils 14,375 µl A. bidest., 2 µl 10x PCR Buffer, 0,5 µl dNTP Solution (10mM), 0,125 µl HotStar Taq Polymerase sowie 2 µl der jeweiligen 10 µM Primergebrauchslösung ( je 10 µl 5´ bzw. 3´ Primer auf 80 µl A. bidest.) wurden pro Ansatz 1 µl cDNA hinzugegeben und die Reaktion im Thermocycler für 15 min bei 95°C gestartet. Für die zyklische Amplifizierung wurden folgende Bedingungen gewählt:
Aktivierung der Polymerase 15 min bei 95°C, Denaturierung 45 s bei 95°C, Annealing 60 s mit primerspezifischen Temperaturen (siehe Anhang Seite VII bis VIII), Elongation 60 s bei 72°C. Je nach Oligomer wurden unterschiedliche Zyklenzahlen verwendet. Im Anschluss an den letzten Zyklus erfolgte stets eine Reaktion für 7 min bei 72°C sowie ein Herunterkühlen des Gerätes auf 4°C zur Konservierung der Proben.
Parallel zu den Proben wurden bei der PCR jeweils eine Leber- und eine Negativkontrolle mitgeführt. Bei der Leberkontrolle handelte es sich um cDNA, die aus RNA humaner Leberzellkulturen durch reverse Transkription gewonnen wurde. Leber wurde als Kontrolle verwendet, da es sich bei der Leber um dasjenige Organ handelt, in dem die meisten Cytochrom P450 Monooxygenasen exprimiert sind. Nicht in der Leber exprimiert sind dagegen die Cytochrome 2A13 (Koskela et al., 1999; Su et al., 2000), 2F1 (Carr et al., 2003; Chen et al., 2002; Ding and Kaminsky, 2002, Nishimura et al., 2003), 2S1 (Rylander et al., 2001), 3A5 (Hukkanen et al., 2003), 4B1 (Nhamburo et al., 1989; Nishimura et al., 2003) sowie die Enzyme FMO2 (Dolphin et al., 1998) und UGT 2A1 Jedlitschky et al., 1999). Aus methodischer Sicht wurde damit in Kauf genommen, dass nicht bei allen untersuchten Genen in der Leberkontrolle RT-PCR Amplifikate nachgewiesen werden konnten. Bei der Negativkontrolle wurde anstelle der cDNA 1 µl A. bidest.
eingesetzt.
2.2.2.3 Linearitätsnachweis
Um den linearen Amplifikationsabschnitt zu gewährleisten, erfolgte vor der eigentlichen PCR für jeden Primer eine Primereinstellung mit einem cDNA-Mix aller Proben, welcher pro Oligomer bei 30, 33, 36 und 39 Zyklen getestet wurde. Beispielhaft sind nachfolgend die Linearitäten einiger Primer graphisch dargestellt.
Abbildung 9: Linearitätsnachweis für die Primer CYP 4B1, UGT 2A1, FMO 2, FMO 3, PPAR α und PPAR γ.
Dargestellt sind die an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA) gemessenen Lichtwerte bei jeweils 30, 33, 36 und 39 Amplifikationszyklen.
CYP 4B1
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
30 Zyklen 33 Zyklen 36 Zyklen 39 Zyklen Lichtwerte
y = 11013x - 14255 R2 = 0,9975
2.2.2.4 Auswertung der Amplifikate
Zur amplifizierten cDNA wurden 6 µl 6x DNA-loading buffer – bestehend aus 40 mg Bromphenolblau, 20 mg Xylencyanol, 100,64 g Glycerin ad 200 ml A. bidest. - hinzugegeben und je Probe 10 µl in eine Kammer auf einem 1,5%igen Agarosegel (in 100 ml 1x TAE-Puffer, versetzt mit 1 µl Ethidiumbromid) aufgetragen. Der Größenkontrolle diente dabei der in die jeweils erste Kammer gegebene DNA-Molekulargewichtsmarker (nachfolgend Ladder genannt). Nach 45-minütiger Auftrennung der cDNA bei 120 V in der Elektrophoresekammer erfolgte die Darstellung mittels UV-Licht an der Kodak Digital Science Image Station 440 CF (Kodak, USA). Durch die Verwendung spezifischer Primer ausreichender Länge und die Überprüfung der erwarteten bp-Länge konnten die Amplifikate ausreichend verifiziert werden. Eine eigenständige Verifizierung in Form einer Sequenzierung oder eines Restriktionsenzymverdaus wurde nicht durchgeführt.
Für die Auswertung wurden die Bandenstärken der PCR-Produkte der zu untersuchenden Gene mit der 1D-Image Analysis Software für Windows Version 3.5.3B geldensitrometrisch ermittelt und die Mittelwerte sowie Standardabweichungen aller Kandidatengene für die Raucher und die Nicht-Raucher, sowie die männlichen und weiblichen Patienten berechnet. Die statistische Signifikanzanalyse wurde mittels Mathematica4.2 der Wolfram Research, Inc. (www.wolfram.com) durchgeführt, wobei das Programmpaket „Statistics´HypothesisTests´“ mit dem Programm
„MeanDifferenceTest“ und der Option TwoSided->True zur Anwendung kam. Voraussetzung für die Anwendbarkeit dieses Tests ist das Vorliegen einer Normalverteilung, was vorab mit dem Shapiro-Wilk-Test gesondert überprüft wurde.
Gemäß SOP wurde pro Patient und Primer eine RT-PCR durchgeführt, weshalb weder ein Intra-, noch ein Inter-Assay Variationskoeffizient angegeben werden kann.
2.2.3 Proteinexpressionsuntersuchungen
Die Experimente zur Untersuchung der Proteinexpression wurden innerhalb des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin in den Räumen T2.03, T2.05, T2.09 und T2.033
durchgeführt.
2.2.3.1 Herstellung der Pufferlösungen
KCl-Puffer 0,15 M: 11,18 g KCl ad 1 l A. bidest.
10x SDS-Laufpuffer 150g Tris 720g Glycin 50g SDS ad 5 l A. bidest.
1x SDS-Laufpuffer 100 ml 10x SDS-Laufpuffer 900 ml A. bidest.
10x TBS-Puffer 121g Tris 400g NaCl ad 5 l A. bidest.
mit 1 M HCl auf pH = 7,6 eingestellt 1x TBS-Puffer ohne Tween 100 ml 10x TBS-Puffer
900 ml A. bidest.
1x TBS-T 0,1% 1000 ml 1x TBS-Puffer ohne Tween 1 ml Tween20
10x Transfer-Puffer 151,5g Tris 720g Glycin ad 5 l A. bidest.
1x Transfer-Puffer 100 ml 10x Transfer-Puffer 900 ml A. bidest.
pH = 8,3
TRIS-Stock 0,1 M: 6,35 g Trizma HCl 1,18 g Trizma Base ad 500 ml A. bidest.
mit 1 M HCl auf pH = 7,4 eingestellt
TRIS-Sucrose-Puffer: 42,79 g Sucrose 100 ml TRIS-Stock 0,93 g EDTA ad 500 ml A. bidest.
2.3.3.2 Isolation mikrosomaler Proteine durch Ultrazentrifugation
Aufgrund der geringen Gewebemengen mussten die Nasenmuscheln mehrerer Patienten gepoolt werden, um für die nachfolgenden proteinanalytischen und metabolischen Untersuchungen ausreichende Mengen an mikrosomalem Protein zu erhalten. So wurden insgesamt 15 Pools aus den Nasenmuscheln von drei bis vierzehn Patienten gebildet (Patientendaten zu den einzelnen Pools siehe Anhang Seite II bis VI). Eine Übersicht über Art und nachfolgende Verwendung der mikrosomalen Pools gibt Abbildung 10.
Pool Art des Pools
Anzahl der Patienten
WB LE I LE II Testost. EROD
60 min
120 min
mit Gluc.
ohne Gluc.
1 M-NR 5 X X 1 - - X -
2 M-NR 5 - X 1 X 2 - - - -
4 M-NR 6 X X 2 X 1 - - X -
5 M-NR 6 - X 2 X 1 - - - X
6 W-NR 6 X X 2 - - - X X
7 M-R 6 X X 2 X 1 - - - X
8 W-R 3 X X 2 - - - - -
9 M-NR 14 X X 2 X 2 - - X X
10 M-R 6 X X 2 X 2 - - X X
11 W-NR 5 X X 2 X 2 - - - -
12 M-NR 10 - - - X X - -
13 M-R 7 - - - X X - -
14 W-NR 10 - - - X X - -
15 W-R 5 - - - X X - -
16 W-? 4 - - - X X - -
Abbildung 10: Art und Verwendung der mikrosomalen Pools
Abkürzungen: EROD = Ethoxyresorufin-O-deethylase; LE-I = Loteprednol-Etabonat-Metabolismus Teil I (verschiedene Inkubationszeiten) mit 1 = 1. Versuchsserie und 2 = 2. Versuchsserie; LE-II = Loteprednol-Etabonat-Metabolismus Teil II (mit und ohne Glucuronidase-Zusatz); M = männlich; NR = Nicht-Raucher; R = Raucher;
Testost. = Testosteron-Metabolismus; W = weiblich; WB = Western blot.
Nach Bestimmung der Poolgewichte wurden die jeweiligen Organpools in der dreifachen Menge 0,15 M KCl-Puffer mit einer Schere zerkleinert und anschließend mit dem Ultra Turrax homogenisiert. Das gewonnene Homogenat wurde in ein Polycarbonatröhrchen gefüllt, mit 0,15 M KCl-Puffer aufgefüllt und für 30 min bei 15.000 Upm und 4°C in der Ultrazentrifuge Optima LE-80K (Beckmann Coulter, Palo Alto, USA) zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und für 60 min bei 55.000 Upm und 4°C erneut zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in einigen Millilitern 0,15 M KCl-Puffer aufgenommen und im Gewebehomogenisator Dounce (7ml) homogenisiert. Die erhaltene Suspension wurde nach Auffüllen mit 0,15 M KCl-Puffer nochmals für 60 min bei 55.000 Upm und 4°C zentrifugiert und das gewonnene Pellet in 500 µl TRIS-Sucrose-Puffer aufgenommen und im Gewebehomogenisator Dounce (1ml) homogenisiert. 10 µl wurden für die anschließende Proteinbestimmung eingesetzt, der Rest bei –80°C eingefroren.
2.2.3.3 Proteinbestimmung nach Smith et al. (1985)
Die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes wurde nach der Methode von Smith et al. (1985) durchgeführt. Hierzu wurde von jedem Pool eine Verdünnungsreihe (1:100 bis 1:1000) hergestellt.
Zur Quantifizierung des Proteingehaltes wurde vor jeder Probenmessung eine Kalibriergerade aus bovinem Serumalbumin (BSA) erstellt. Alle Messungen erfolgten als Doppelbestimmungen und wurden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt, wobei pro Kavität 100 µl Probe und 100 µl frisch angesetzte Färbelösung - bestehend aus 1 Teil 4% CuSO4 und 49 Teilen Bicinchoninic Acid - eingesetzt wurde. Zur Beschleunigung der Reaktion wurde die Mikrotiterplatte 30 min bei 60°C im Wärmeschrank inkubiert. Die Messung des Proteingehaltes erfolgte bei 550 nm mittels eines ELISA Reader Dynatech MR5000 (Dynatech, Ohio, USA).
2.3.3.4 Proteinexpression ausgewählter CYPs
2.3.3.4.1 Auftrennung der Proteine mittels 1D-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde nach der Methode von Laemmli (1970) durchgeführt. Die mikrosomalen Proteine von acht Pools wurden entsprechend ihres Molekulargewichtes mittels 1D-SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und durch Inkubation mit einem Primär- und Sekundärantikörper die Cytochrome 1A1, 2A, 2B6, 2E1, 3A4 und 3A5 nachgewiesen.
Pro Pool wurden 45 µg mikrosomales Protein auf ein Volumen von 12 µl eingestellt, mit je 4 µl Roti -Load1 4x-Konz. versetzt und 5 min bei 95°C inkubiert. Auf die erste Spur des 12%igen Polyacrylamidgeles wurde ein Marker – bestehend aus 5 µl Precision blue protein standard prestained und 0,5 µl Chemicon ECL – aufgetragen, auf die zweite Spur eine Positivkontrolle (humane Lebermikrosomen). Zur besseren Auflösung der Proteinbanden wurden die Proben auf ein Sammelgel aufgetragen, welches sich über dem eigentlichen Trenngel befand. Das Trenngel bestand aus 3 ml 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid, 1,875 ml 1,5 M Tris pH 8,8, 2,55 ml A. bidest. und 37,5 µl 20% SDS, das Sammelgel aus 850 µl 30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid, 625 µl 1 M Tris pH 6,8, 3,47 ml A. bidest. und 25 µl 20% SDS. Zum Start der Polymerisierungsreaktion wurde dem Trenngel 75 µl 10% Ammoniumperoxodisulfat und 7,5 µl TEMED, dem Sammelgel 50 µl 10%
Ammoniumperoxodisulfat und 5 µl TEMED hinzugegeben. Die Elektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur in einer Minigel-Elektrophoresekammer der Firma Biometra unter Zugabe von 1x SDS-Laufpuffer. Anfänglich betrug die Stromstärke 20 mA pro Gel, nach Erreichen des Trenngels wurde sie für etwa 60 bis 90 min auf 25 mA pro Gel erhöht.
2.3.3.4.2 Darstellung der Proteine mittels Western blot
Direkt im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel aus der Elektrophoresekammer entnommen und 10 min in 1x Transfer-Puffer getränkt. Parallel dazu wurde die PVDF-Membran 15 s in Methanol aktiviert, 2 min in A. bidest. gewässert und ebenfalls 10 min in 1x Transfer-Puffer getränkt. Nach Beschicken der Kassette und Einsetzen der Kassette in die Blotkammer erfolgte das Blotten über Nacht bei 90 mA und 4°C auf einem Magnetrührer Heidolph MR3000 der Firma Heidolph Instruments GmbH & Co.KG.
Zur Sättigung freier, unspezifischer Bindungsstellen wurde die PVDF-Membran für 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (Roto-Shake Genie der Firma Scientific Industries, Inc.) mit Blocking-Reagenz – bestehend aus neun Teilen 1x TBS-Puffer ohne Tween und einem Teil Rotiblock, 10x Konzentrat – versetzt. Nach drei fünfminütigen Waschschritten mit Waschpuffer (1x TBS-T 0,1%) wurde die Inkubation mit dem Primärantikörper, welcher in 10 ml Diluent – bestehend aus 99 Teilen 1x TBS-Puffer ohne Tween und einem Teil Rotiblock, 10x Konzentrat – verdünnt wurde (Angaben zu den verwendeten Primär- und Sekundärangaben und deren Verdünnungen siehe Anhang Seite IX), für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler durchgeführt. Nach erneutem Waschen folgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper in analoger Weise. Anschließend wurde die PVDF-Membran wieder gewaschen und in frisch angesetztem Entwicklungsreagenz 1 min bei Raumtemperatur geschwenkt. Nach etwa 5 min erfolgte die Exposition an der Kodak Digital
Science Image Station 440 CF (Kodak, USA). Die Lumineszenz wurde nach 1 und nach 10 min Expositionsdauer gemessen.
2.2.4 Metabolismusuntersuchungen
Die Inkubationsexperimente wurden in den Laboren T2.06, T2.07, T2.08 sowie T2.09 des Fraunhofer Institutes für Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt.
2.2.4.1 Metabolismus von Loteprednol-Etabonat (LE)
Um die Verstoffwechselung von Loteprednol-Etabonat, dem ersten Vertreter der sog. Soft Steroide (Szelenyi and Pahl, 2002), zu untersuchen, wurde 14C-Loteprednol-Etabonat als Substrat verwendet und das entstehende Metabolitenprofil mittels Radio-HPLC bestimmt. Die Messung des Loteprednol-Etabonats und seiner Hauptmetaboliten wurde dabei durch Frau Diplom-Chemikerin Qiong Luo am Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin durchgeführt.
Abbildung 11: Strukturformel von Loteprednol-Etabonat (LE), dem ersten Vertreter der sog. Soft Steroide.
[aus: Bodor N, Recent advances in retrometabolic design approaches. J. Control. Release, 62: 209-222, 1999.]
2.2.4.1.1 1.Versuchsabschnitt: Inkubation bei verschiedenen Inkubationszeiten
Im ersten Versuchsabschnitt erfolgten die Inkubationen der einzelnen mikrosomalen Nasenmuschelpools sowie der mitgeführten Negativ- (nur Puffer und Substrat) und Positivkontrollen bei 60 und/oder 120 min (siehe Abbildung 10). Die Versuche wurden dabei in zwei Versuchsserien aufgeteilt, wobei in der ersten Serie Rattenlebermikrosomen, in der zweiten humane Lebermikrosomen als Positivkontrolle verwendet wurden. Die konzentrierte Mikrosomensuspension wurde mit 0,1 M TRIS-Puffer auf 1 mg mikrosomales Protein / ml eingestellt und mit 1 mM β -NADPH versetzt. Zum Start der Reaktion wurde je Ansatz Loteprednol-Etabonat (25 µM) mit einer Aktivität von 1 µCi/ml hinzugegeben und die Reaktionsansätze im Wasserbad bei 37°C 60 bzw. 120
Im ersten Versuchsabschnitt erfolgten die Inkubationen der einzelnen mikrosomalen Nasenmuschelpools sowie der mitgeführten Negativ- (nur Puffer und Substrat) und Positivkontrollen bei 60 und/oder 120 min (siehe Abbildung 10). Die Versuche wurden dabei in zwei Versuchsserien aufgeteilt, wobei in der ersten Serie Rattenlebermikrosomen, in der zweiten humane Lebermikrosomen als Positivkontrolle verwendet wurden. Die konzentrierte Mikrosomensuspension wurde mit 0,1 M TRIS-Puffer auf 1 mg mikrosomales Protein / ml eingestellt und mit 1 mM β -NADPH versetzt. Zum Start der Reaktion wurde je Ansatz Loteprednol-Etabonat (25 µM) mit einer Aktivität von 1 µCi/ml hinzugegeben und die Reaktionsansätze im Wasserbad bei 37°C 60 bzw. 120