Metabolische Aktivität

Neben der Gen- und Proteinexpression wurde auch die Enzymaktivität der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut untersucht. Hierzu wurden mikrosomale Membranen mit den Substraten Loteprednol-Etabonat, Testosteron und Ethoxyresorufin inkubiert. Nach Inkubation gepoolter Nasenmuschelmikrosomen mit Loteprednol-Etabonat konnte nur eine geringfügige Loteprednol-Verstoffwechselung ermittelt werden. M 8 stellte dabei den Hauptmetaboliten dar.

Da keine Untersuchungen zur Verstoffwechselung des bislang nur ophthalmologisch zugelassenen Loteprednol-Etabonates in extraokulären Geweben beim Menschen existieren, sind lediglich Vergleiche mit den Ergebnissen einer hausinternen Studie möglich (Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003), in deren Rahmen auch Inkubationen mit rekonstituierten Enzymsystemen durchgeführt wurden. CYP 3A4, eines der Haupt-Cytochrome der Leber (De Luka et al., 2001; Hukkanen, 2000), war dabei maßgeblich für die Biotransformation des Loteprednols verantwortlich.

In den vorausgegangen proteinanalytischen Untersuchungen war in der menschlichen Nasenschleimhaut nur Protein der CYP 2A-Subfamilie nachweisbar, wobei aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit spezifischer Antikörper (Ding and Kaminsky, 2002; Su et al., 2000) eine Unterscheidung von CYP 2A6 und 2A13 nicht möglich war. In den Experimenten mit rekonstituiertem und funktionell aktivem CYP 2A6 war keine nennenswerte Metabolisierung des Loteprednols zu beobachten (Metabolism Studies with Loteprednol etabonate, 2003), wobei das entstehende Metabolitenprofil dem der Inkubationen mit Nasenmuschelmikrosomen ähnelte.

Insgesamt betrachtet korreliert die deutliche metabolische Umsetzung des Loteprednols in den verwendeten Positivkontrollen (Lebermikrosomen der Ratte und des Menschen) mit den Daten durch separate Inkubation mit CYP 3A4, dem Haupt-Cytochrom der Leber. Ebenso stimmt die nur geringe Loteprednolverstoffwechselung durch menschliche nasale Mikrosomen mit den Beobachtungen überein, dass in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut nur Protein der CYP 2A-Subfamilie detektierbar war und dass dessen Mitglied CYP 2A6 in den Untersuchungen mit Supersomen gegenüber Loteprednol nur geringe Aktivitäten zeigte.

Bei der Betrachtung der Ergebnisse des 2. Versuchsabschnittes (mit Zugabe von Ammoniumacetatpuffer) fällt zunächst auf, dass das Substrat Loteprednol-Etabonat insgesamt sehr viel stärker zerfällt als im 1. Versuchsabschnitt (ohne Zugabe von Ammoniumacetatpuffer). So liegt der relative Anteil des verbleibenden Loteprednols in den Negativkontrollen des 2. Abschnittes um durchschnittlich 21,7 % niedriger als in den Negativkontrollen des 1. Abschnittes. Wenngleich die Zugabe von Ammoniumacetatpuffer (200 mM, pH 4,5) für den β-Glucuronidase-Verdau notwendig ist, scheint dessen Zusatz zu einer Instabilität des Loteprednols zu führen. Darüber hinaus sind die deutlich schwankenden Werte zwischen den beiden Negativkontrollen des 2. Abschnittes auffällig, weshalb die Daten dieses Abschnittes insgesamt nur qualitativ betrachtet werden.

Im 2. Versuchsabschnitt wurde zum Nachweis möglicher Glucuronide ein zusätzlicher Glucuronidase-Verdau durchgeführt. Durch Zugabe des Enzyms β-Glucuronidase sollte die Abspaltung des Glucuronsäure-Restes erzielt werden, womit der Nachweis der Glucuronidierung erbracht wird. Der einzige Metabolit, der in den Inkubaten ohne Glucuronidase-Zusatz auftrat, war – wie im 1. Versuchsabschnitt – M 8, der wiederum nur in einem Pool (Pool 15) oberhalb der Negativkontrolle lag. Somit stellt M 8 bei Pool 15 den einzigen Metaboliten dar, von dem eine Glucuronidierung hätte nachgewiesen werden können. Interessanterweise wurde nach Glucuronidase-Verdau auch nur bei Pool 15 (W-R) ein weiterer Metabolit detektiert. Dabei handelte es sich um einen neuen, bislang unidentifizierten Metaboliten mit einer relativen Retentionszeit von 0,19. Dies lässt auf eine Glucuronidierung von M 8 schließen.

Darüber hinaus war auffällig, dass M 8 in den Inkubaten mit Glucuronidase-Zusatz gegenüber der Negativkontrolle erhöht erschien. Betrachtet man dagegen die Metabolitenprofils der einzelnen Nasenmuschelpools mit und ohne Enzymzusatz unabhängig von der jeweiligen Negativkontrolle, so ist kaum ein Unterschied erkennbar. Dafür weist die Negativkontrolle mit Glucuronidase-Zusatz deutlich geringere Mengen an Zerfallsprodukten auf, die nicht erklärbar sind. Korrigiert man nun die absoluten M 8-Anteile der Organpools um die jeweilige Negativkontrolle, erscheint M 8 in den Inkubaten mit Enzymzusatz erhöht. Die Überprüfung der Ergebnisse des 2. Versuchsabschnittes war jedoch nicht möglich, da keine weiteren Mikrosomen menschlicher Nasenschleimhaut zur Verfügung standen und die Gewinnung des Materials ausgesprochen schwierig und langwierig ist.

Zusätzlich wurden Metabolismusuntersuchungen mit dem endogenen Steroid Testosteron durchgeführt. Betrachtet man die relativen Anteile des verbleibenden Testosterons in den

Nasenmuschelpools und in der Negativkontrolle, so scheint so gut wie keine Verstoffwechselung des Testosterons stattzufinden. Zieht man jedoch die geringe Verschiebung des Metabolitenprofils gegenüber der Negativkontrolle in Betracht, so dürfte zumindest von einem geringen Testosteron-Metabolismus auszugehen sein. So lagen nach 120-minütiger Inkubation der mikrosomalen Organpools mit 50 µM Testosteron alle untersuchten Testosteronmetaboliten jeweils unter 0,5 % des metabolischen Gesamtprofils. Oberhalb der Negativkontrolle befanden sich dabei Androstendion mit 0,37 % sowie in Spuren 6α-Hydroxytestosteron und 7α-Hydroxytestosteron.

7α-Hydroxytestosteron war dabei der einzige Metabolit, der weder in der Negativ-, noch in der Positivkontrolle (humane Leber) detektierbar war. Dagegen war er in äußerst geringen Mengen in allen Nasenmuschelinkubaten nachweisbar. Somit scheint es sich um einen Metaboliten zu handeln, der durch menschliche nasale Enzyme gebildet wird, welche nicht parallel auch in der Leber vorhanden sind. Inwieweit der Testosteronmetabolit durch die Cytochrome 2A13 und 2S1 gebildet wird, muss noch weitergehend untersucht werden.

Für den Menschen ist über den Metabolismus von Testosteron in der respiratorischen Nasenschleimhaut nichts bekannt. Dagegen wurden beim Rind in der Regio respiratoria insgesamt acht Testosteronmetaboliten nachgewiesen, wobei die Testosteronoxidationsrate um insgesamt etwa 15 % niedriger als in der Regio olfactoria lag (Longo et al., 1991). Mit heterolog exprimiertem CYP 2A verschiedener Spezies wurden unterschiedliche Beobachtungen hinsichtlich der Verstoffwechselung von Testosteron gemacht. So wurden beim Kaninchen sowohl mit gereinigtem mikrosomalem nasalem NMa (entspricht CYP 2A10/11), als auch mit rekombinantem CYP 2A10 und 2A11 neben Androstendion noch 3 weitere, nicht näher charakterisierte Testosteronmetaboliten X1, X2 und X3 detektiert (Peng et al., 1993), während bei der Ratte mit heterolog exprimiertem CYP 2A3 insgesamt 15 verschiedene α-Hydroxytestosteronmetaboliten nachgewiesen wurden (Liu et al., 1996). Dagegen zeigte heterolog exprimiertes humanes CYP 2A6, welches homolog zu CYP 2A10/11 des Kaninchens und zu CYP 2A3 der Ratte ist (Ding et al., 1994; Peng et al., 1993), keine Aktivität gegenüber Testosteron (Liu et al., 1996). Dies könnte wiederum die geringe Testosteronoxidationsrate menschlicher respiratorischer Nasenschleimhaut im Gegensatz zur vergleichsweise hohen Aktivität bei anderen Spezies (Ding and Coon, 1990; Longo et al., 1991) erklären, da CYP 2A-Protein in meinen Untersuchungen das einzige Cytochrom war, welches sich auch auf Proteinebene nachweisen ließ. Wie bereits zuvor erwähnt, war aufgrund der fehlenden

Verfügbarkeit spezifischer Antikörper (Ding and Kaminsky, 2002; Su et al., 2000) eine Unterscheidung von CYP 2A6 und 2A13 nicht möglich. Der Nachweis von CYP 2A13-Transkripten in der menschlichen respiratorischen Nasenschleimhaut (Koskela et al., 1999; Su et al., 2000) in Kombination mit dem Nachweis der Funktionsfähigkeit von CYP 2A13 (Su et al., 2000) könnte die Beobachtung erklären, dass trotz fehlender Aktivität von CYP 2A6 gegenüber Testosteron eine – wenn auch nur geringe – Testosteronverstoffwechselung nachgewiesen werden konnte.

Das CYP 1A1-Markersubstrat Ethoxyresorufin (Burke et al., 1994) wurde von keinem der insgesamt fünf untersuchten Nasenmuschelpools (zwei Raucher- und drei Nicht-Raucher-Pools) umgesetzt. Die fehlende EROD-Aktivität bei den Nicht-Rauchern war erwartungsgemäß, da bei den Nicht-Rauchern in der respiratorischen Nasenschleimhaut weder CYP 1A1-Transkripte, noch CYP 1A1-Protein nachgewiesen werden konnte. Bei Rauchern war CYP 1A1 zwar in 60 % der Fälle exprimiert, jedoch konnte kein CYP 1A1-Protein detektiert werden, was wiederum mit der fehlenden Ethoxyresorufin-Verstoffwechselung übereinstimmt.